内皮细胞向间充质细胞转化推动动脉粥样硬化进展

EndMT在小鼠动脉粥样硬化中的作用。

为了建立内皮细胞FGF信号缺失与动脉粥样硬化之间的因果关系，我们接下来研究了HFD对内皮细胞命运图中内皮细胞的影响毫吨/毫克记者阿波^–/–老鼠(Cdhr5-CreER公司^T2段mT/mG载脂蛋白^–/–老鼠）。16周的HFD导致管腔EC中FGFR1的表达显著降低(图3，A和D). 为了检测FGFR1水平降低对功能的影响，对正常饮食和HFD的小鼠全身注射FGF2。FGF2注射15分钟后主动脉中p-ERK表达的免疫细胞化学分析表明，与正常饮食小鼠血管段正常内皮细胞相比，斑块中p-ERK的表达显著减少(图3、B和E). 与内皮细胞FGF信号的减少相一致，HFD小鼠超过三分之一的管腔内皮细胞表达EndMT标记物NOTCH3，而在正常饮食的小鼠中几乎没有这种标记物(图3、C和F).

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图3

小鼠动脉粥样硬化模型中FGF信号活性和EndMT程度。

(A类)大鼠主动脉FGFR1的免疫荧光染色Cdh5-CreER公司^T2段mT/mG载脂蛋白^–/–小鼠（每组6只小鼠）。比例尺：10μm。(B类)Cdh5-CreER公司^T2段mT/mG载脂蛋白^–/–HFD治疗16周后的小鼠(n个=6）或正常饮食(n个=6）静脉注射FGF2（每只小鼠1μg），通过免疫荧光染色测定p-ERK激活。比例尺：10μm。(C)主动脉和斑块切片中NOTCH3的免疫荧光染色Cdh5-CreER公司^T2段mT/mG载脂蛋白^–/–小鼠（正常饮食，n个= 6; HFD、，n个=12）。比例尺：10μm。(D类–如果)表达FGFR1、p-ERK和NOTCH3的管腔内皮细胞数量的量化(***P（P）与正常饮食相比<0.001；未配对双尾学生的t吨测试）。黄色箭头表示表达NOTCH3的EC。Ø，未检测到。

为了进一步研究内皮细胞FGF信号在动脉粥样硬化病变发展中的作用，我们制作了内皮细胞命运定位基因编码pan-FGFR适配器分子FRS2α的可诱导内皮特异性缺失的小鼠阿波^–/–背景使用Cdh5-CreER公司^T2段驾驶员(16).Cdh5-CreER公司^T2段毫吨/毫克小鼠与Frs2a公司^{飞行/飞行}鼠标，生成Cdh5-CreER公司^T2段mT/mG Frs2a^{飞行/飞行}线路（此处指定为FRS2α^ECKO公司老鼠）。然后将这些老鼠交给阿波^–/–背景，生成Cdh5-CreER公司^T2段mT/mG载脂蛋白^–/–Frs2a公司^{飞行/飞行}小鼠（FRS2α^ECKO公司 阿波^–/–老鼠）和Cdh5-CreER公司^T2段mT/mG载脂蛋白^–/–Frs2a公司^{佛罗里达州/+}室友控制(补充图5A). 出生后注射三苯氧胺，FRS2α的命运定位和FRS2β切除效率^ECKO公司 阿波^–/–小鼠主动脉免疫细胞化学检测(补充图5B)和蛋白质印迹(补充图5C; 请参阅补充材料中完整的未经编辑的斑点）。FRS2α中的体重、总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇水平^ECKO公司 阿波^–/–小鼠与阿波^–/–HFD 16周前后的小鼠(补充图5、D和E).

HFD 4周后对主动脉弓、胸主动脉、腹主动脉和主动脉根部的检查显示FRS2α中有更广泛的动脉粥样硬化病变^ECKO公司 阿波^–/–小鼠与阿波^–/–老鼠(图4). 此外，FRS2α^ECKO公司 阿波^–/–主动脉显示动脉粥样硬化斑块病变增加，纤维连接蛋白沉积，ICAM-1和VCAM-1在动脉粥样硬化易感区和抵抗区的表达升高，这在阿波^–/–老鼠(图5).

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图5

FRS2α动脉粥样硬化的早期发病^ECKO公司 阿波^–/–老鼠。

阿波^–/–和FRS2α^ECKO公司 阿波^–/–将小鼠置于HFD上，4周后进行检查。(A类)HFD 4周前后主动脉弓油红O染色动脉粥样硬化病变的代表性显微照片（每组5只小鼠）#1和#3表示动脉粥样硬化预防区，而#2表示动脉粥样硬化抵抗区。比例尺：4 mm(B类–D类)Fibronectin（FN）、ICAM-1和VCAM-1区域的纵向截面对应于来自A类在里面阿波^–/–和FRS2α^ECKO公司 阿波^–/–小鼠（每组5只）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。比例尺：16μm。

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图4

内皮FGF信号抑制对HFD 4周后小鼠动脉粥样硬化的影响。

阿波^–/–和FRS2α^ECKO公司 阿波^–/–将小鼠置于HFD上，4周后进行检查。(A类)主动脉显微照片阿波^–/–和FRS2α^ECKO公司 阿波^–/–12周龄的小鼠在用油红O染色后进行面部准备（每组5只小鼠）并量化损伤面积。所有数据显示为平均值±SD(*P（P）与相比<0.05阿波^–/–; 未配对双尾学生的t吨测试）。(B类)油红O染色主动脉根部横截面的代表性示例（每组5只小鼠）和主动脉根部病变区域的量化。比例尺：200μm。平均值±标准偏差(*P（P）与相比<0.05阿波^–/–; 未配对双尾学生的t吨测试）。

HFD 16周后，FRS2α^ECKO公司 阿波^–/–小鼠出现广泛的动脉粥样硬化斑块，累及主动脉弓、胸主动脉和腹主动脉、主动脉根部和头臂动脉(图6，A–C). 主动脉中的总斑块负荷比阿波^–/–小鼠（17.82%阿波^–/–FRS2α中为32.79%^ECKO公司 阿波^–/–) (图6A). 主动脉根部、头臂动脉和腹主动脉的病变面积增加同样显著(图6、B、C和E). 对腹主动脉的组织学检查显示，双基因敲除动物的腹主动脉环周斑块非常广泛，覆盖了正常情况下从未观察到的抗动脉粥样硬化区域阿波^–/–老鼠(图6D). 此外，坏死核心的尺寸显著增加，纤维帽的尺寸减小(图6、D和F)，具有脆弱斑块的典型特征。

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图6

内皮FGF信号抑制对HFD 4个月后小鼠动脉粥样硬化的影响。

(A类)主动脉显微照片阿波^–/–和FRS2α^埃科 阿波^–/–小鼠（24周龄）在4个月HFD后，用油红O染色并量化损伤区域后，在面部准备中（每组10只小鼠）。所有数据显示为平均值±SD(***P（P）<0.001与阿波^–/–; 未配对双尾学生的t吨测试）。(B类)用油红O染色的主动脉根部横截面的代表性示例和主动脉根部病变面积的量化（每组12只小鼠）。比例尺：200μm。平均值±标准偏差(**P（P）与相比<0.01阿波^–/–; 未配对双尾学生t吨测试）。(C和D类)油红O型或运动染色的头臂动脉和腹主动脉的代表性图像阿波^–/–和FRS2α^埃科 阿波^–/–老鼠(阿波^–/–老鼠，n个= 12; FRS2α^ECKO公司 阿波^–/–老鼠，n个= 10). 比例尺：100μm。方框内显示的病变的高清晰度图像显示在右侧。比例尺：50μm。NC，坏死核心。注意FRS2α中的周向斑块^ECKO公司 阿波^–/–老鼠。(E类)病变面积测量(***P（P）<0.001与阿波^–/–; 未配对双尾学生的t吨测试）。(如果)头臂动脉和腹主动脉纤维帽和坏死区范围的量化坡（poe）^–/–和FRS2α^ECKO公司 阿波^–/–老鼠(*P（P）< 0.05; ***P（P）<0.001与阿波^–/–; 未配对双尾学生的t吨测试）。

免疫细胞化学显示ICAM-1和VCAM-1的广泛周向表达以及单核细胞/巨噬细胞的募集(图7、A、B、D和E). 此外，FRS2α的动脉粥样硬化病变^ECKO公司 阿波^–/–小鼠对活化的TGF-β信号传导（p-SMAD2）、平滑肌α-肌动蛋白和NOTCH3表达以及广泛的胶原和纤连蛋白沉积进行强烈染色(补充图6和图7、C和F)，EndMT的所有标记。头臂动脉检查也有类似结果(补充图7).

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图7

内皮细胞FGF信号抑制对小鼠炎症和EndMT标记基因表达的影响。

(A类–C)用抗ICAM-1、抗VCAM-1、F4/80和抗纤维连接蛋白抗体对动脉粥样硬化斑块进行组织学分析(阿波^–/–老鼠，n个= 12; FRS2α^ECKO公司 阿波^–/–小鼠，n个= 10). 注意FRS2α中的周向斑块^ECKO公司 阿波^–/–老鼠。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺：62μm（低倍图像）；10μm（高倍图像）。方框区域的高分辨率图像显示在右侧。(D类–如果)F4/80、ICAM-1、VCAM-1和纤维连接蛋白面积的测量(*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）<0.001与阿波^–/–; 未配对双尾学生的t吨测试）。

流体剪切应力。

将HUVEC接种在涂有10μg/ml纤维连接蛋白的组织培养塑料载片上，并在补充有20%FBS、ECGS、100 mg/l肝素和青霉素/链霉素的M199培养基中生长汇合。刺激前4小时，细胞在补充有8%FBS的M199培养基中饥饿。然后将滑块夹在平行板流动室中，并以12达因/厘米的速度剪切²（层流）或1±4达因/厘米²（振荡流）16或48小时。然后在PBS中清洗细胞，并进一步处理以进行免疫染色或mRNA提取。

SMAD2/3易位分析。

细胞用4%甲醛固定15分钟，然后用1%Triton X-100渗透15分钟。渗透后，用StartingBlock Blocking Buffer（Thermo Fisher Scientific）封闭细胞15分钟，并在4°C下用在StartingBlocking Buffer（1:500，Cell Signaling）中稀释的SMAD2/3一级抗体培养过夜。经过3个清洗步骤后，用DAPI和Alexa Fluor 647结合二级抗体（1:500，分子探针）在室温下在StartingBlock Blocking Buffer中稀释2小时，对细胞进行检测。然后用Fluoromount-G安装介质（Southern Biotech）安装细胞。然后，使用安装在配备电动工作台的Perkin-Elmer旋转圆盘共焦显微镜上的×20物镜拍摄50张图像（Prior Scientific）。然后使用前面描述的专用MATLAB函数分析图像(35). 简单地说，图像的掩模是使用自适应直方图均衡化算法与强度和大小阈值相结合来制作的。通过提取细胞核的掩模（由DAPI图像确定），将其拟合为椭圆，并确定流动方向与椭圆长轴之间的角度，计算细胞方向。根据拟合椭圆的偏心率测量核偏心率。取转录因子染色掩模（SMAD2/3），计算细胞核内染色面积和染色强度的乘积，再除以总染色面积和总染色强度的积，计算核移位。这产生了一个我们称之为易位因子的无单位度量，在完全核易位的细胞中等于1，在没有易位的电池中等于0。

慢病毒的产生。

人FGFR1 shRNA慢病毒构建物购自Sigma-Aldrich，人FRS2αshRNA慢毒构建物购于Open Biosystems。为了生产shRNA慢病毒，使用X-tremeGENE 9 DNA转染试剂（06365787001，Roche）将携带对照、FGFR1和FRS2αshRNA的3.7μgΔ8.2、0.2μg VSVG和2.1μg pLKO.1共转染到293T细胞中。48小时后，收集培养基，用0.45-μm过滤器（PN4184，PALL Life Sciences）清除，并与聚丁烯（5μg/ml）（H9268，Sigma-Aldrich）混合，然后应用于细胞。培养6小时后，用新鲜培养基代替含病毒的培养基。使用QuickTiter慢病毒滴度试剂盒（慢病毒相关HIV p24，VPK-107，Cell Biolabs）偷笑病毒上清液。

RNA分离和定量实时PCR。

将细胞悬浮在TRIzol试剂（15596018，Invitrogen）中，并根据制造商的说明分离总RNA（74134，QIAGEN）。使用iScript cDNA合成试剂盒（170-8891，Bio-Rad）进行逆转录。通过混合等量cDNA、iQ SYBR Green Supermix（170-8882，Bio-Rad）和SABiosciences（一家QIAGEN公司）（FGFR1[PPH00372F]、VE-cadherin[PPH00668F]、N-cadherin[PPPH00636F]、eNOS[PPH01298F]、TGF-βR1[PPH00237C]、PAI-1[PPH00215F]）的基因特异性引物，使用Bio-Rad CFX94进行定量实时PCR（qRT-PCR）、ICAM-1[PPH00640F]、VCAM-1[PPH00623E]、MCP-1[PPH00192F]、ZEB2[PPH09021B]、Slug[PPH02475A]和Snail[PPH02459A]）或以下用于检测mRNA的引物：扭转1、actggcctgcaaaaccatag和tgcattaccatggtcct；ACTA2公司、gccacagctctctctct和tgaattccagccat；缺口3、ctcatccgaaacctctac和tcttccaaccctctac；纤维连接蛋白1、gttgtccggctctcc和agtgtcagggttgcctcca；以及胶原蛋白1A、tgtggcccagaacactggt和caggaagggtcagctggatgg。所有反应均在25μl反应体积内进行，一式两份。个体mRNA表达与内源性β-肌动蛋白表达相关。PCR扩增包括在95℃下进行10分钟的初始变性步骤，然后在95℃进行46个周期的PCR扩增15秒，在60℃进行30秒。

用于蛋白质免疫检测的抗体。

我们使用以下抗体进行免疫印迹（IB）、免疫荧光（IF）或免疫组织化学（IHC；IHC），p44/42 MAPK（ERK1/2）（Thr202/Tyr204）（4370，细胞信号；IHC(14)、FRS2α（ab10425，abcam；IHC），FRS2（sc-8318，Santa Cruz；IB），GAPDH（2118，细胞信号；IB，NOTCH3（5276，细胞信号；IB），NOTCH三（ab23426，abcam；IHC），PAI-1（612024，BD；IB^465/467)（3101，细胞信号；人类石蜡样品的IHC），p-SMAD2（Ser^465/467)（AB3849，Millipore；IHC用于小鼠石蜡样品），p-SMAD2（Ser^465/467)（3108，细胞信号；IB），SMAD2（3122，细胞信号传导；IB，VCAM-1（NBP1-47491，Novus Biologicals；IHC用于人体组织），VCAM-1，（ab19569，abcam；IHC-用于小鼠组织），VC AM-1（3540-1，Epitomics；IB），VE-cadherin（sc-6458，Santa Cruz；IB；），VEGFR2（2479，Cell Signaling；IB。

小鼠的产生。

Frs2a公司^{飞行/飞行}之前描述过老鼠(36).Frs2a公司^{飞行/飞行}老鼠被杂交到罗莎26荧光报告器毫吨/毫克报告行（JAX SN:007676），然后交叉到C57BL/6阿波^–/–鼠标（JAX SN:002052）。神父2a^{飞行/飞行}阿波^–/–mT/mG用表达Cre重组酶的小鼠在镉5发起人（德国穆斯特马普研究所R.H.Adams赠送）。阿波^–/–和FRS2α^ECKO公司 阿波^–/–雄性小鼠喂食西方饮食（40%千卡%脂肪，1.25%胆固醇，0%胆酸）4或16周（产品{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“D12108”，“term_id”：“2148896”，“term_text”：“D12108”}}D12108号，研究饮食），从8周大开始。他们的体重和血脂状况与阿波^–/–小鼠(补充图5、D和E). 使用以下引物进行PCR基因分型分析：Frs2a公司^{飞行/飞行}（5′-GAGGTGTGCTGATTGGAAGGCAG-3′和5′-GGCACAGTGTCTGCAGACAATG-3′），毫吨/毫克（5′-CTCTGCTGCCTCCTGGCTTCTT-3′，5′-CGAGGCGGATACACAGCAATA-3′和5′-TCAATGGGCGGTGT-3′），Cdh5-CreER公司^T2段（5′-GCTGCATTACCGGTCGATGCAACGA-3′和5′-GTGGCAGAGGCAACACCATT-3′），阿波（5′-GCCTAGCGCGAGGAGCCG-3′，5′-GTGACTGGAGCTCTGCAGC-3′，和5′-GCGCCCCGACTGCCT-3′）。

免疫组织化学染色。

使用Microm低温恒温器（用于冷冻块）或石蜡切片机（用于石蜡块）以5μm的间隔进行切片。对于冷冻组织切片，将载玻片在-20°C的丙酮中固定10分钟。对于石蜡切片，将载玻片在二甲苯中脱蜡，在柠檬酸盐缓冲液（10 mM，pH 6.0）中煮沸20分钟以回收抗原，然后再水化。用PBS清洗3次后，在4°C的加湿室中用封闭溶液（10%BSA和PBS中的马血清）稀释的一级抗体培养组织切片过夜。切片用Tris缓冲盐水冲洗3次；与适当的Alexa Fluor 488–、Alexa Fuor 594–或Alexa Fluor 647–结合二级抗体在室温下在封闭溶液中稀释1:1000培养1小时；再次清洗3次，并用带DAPI的ProLong黄金安装试剂安装在载玻片上({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“P36935”，“term_id”：“549826”，“term_text”：“P26935”}}第36935页，生命科技）。所有免疫荧光显微照片均使用Axiovert 200M显微镜系统（卡尔蔡司显微成像）采集。使用Velocity软件捕获图像，并使用ImageJ软件（NIH）进行量化。

动脉粥样硬化病变的组织学分析。

对动物实施安乐死，并用4%多聚甲醛（18814，Polysciences Inc.）经左心室灌注固定5分钟。使用油红O染色分析位于主动脉、主动脉根部、头臂动脉和腹主动脉的病变。为了测量主动脉中的病变，解剖整个主动脉，包括升弓、胸段和腹段，轻轻清洁外膜组织，并用油红O（O0625，Sigma-Aldrich）染色，如前所述(37). 表面病变面积用ImageJ软件（NIH）进行定量。为了测量主动脉根部的病变，切除心脏和近端主动脉，并切除心室的顶点和下半部分。

血脂分析。

血清是在9391通过血液离心2分钟获得的克在4°C下保存，并在-80°C下储存，直到进行每次分析。在耶鲁小鼠代谢表型中心测量总胆固醇、甘油三酯和HDL胆固醇水平。

蛋白质印迹分析。

用HNTG裂解缓冲液（20 mM HEPES[PH7.4]，150 mM NaCl，10%甘油，1%Triton X-100，1.5 mM MgCl）裂解细胞₂，1.0 mM EGTA），含有完整的无EDTA的微型蛋白酶抑制剂（11836170001，罗氏）和磷酸酶抑制剂（04906837001，罗氏。使用Tris/Glycin/SDS流动缓冲液（161-0772，Bio-Rad）在标准TGX预铸凝胶（567-1084，Bio-Rad）上溶解每个样品中的20μg总蛋白，转移到硝化纤维素膜（162-0094，Bio-Read）上，然后用各种抗体进行探测。使用SuperSignal West Pico化学发光基板（34080，Thermo Fisher Scientific）进行化学发光测量。

患者群体。

人冠状动脉取自移植受体或尸体器官供体的移植心脏。

标本采集。

研究人员随时待命于手术组，并在移植时采集心脏。为了最大限度地减少离体伪影，在手术室内切除了大约5至20毫米的左冠状动脉主干(补充图8A)并立即作为冰冻切片进行处理(n个=43）在最佳切割温度介质中（樱花Finetek USA Inc.），当长度足够时，另加一段(n个=29）也固定在福尔马林中，用于随后的包埋、切片和染色。尽管某些抗体（FGFR1和p-SMAD2）对石蜡包埋标本的检测更为理想，但大多数分析都是在冷冻标本中进行的。

组织学和形态计量学分析。

左主冠状动脉切片用H&E和Movat染色。每个区块一个截面的数字H&E和Movat照片以最终放大倍数×40进行投影。使用ImageJ软件（NIH）进行形态计量分析。如中所述补充图8B测量内膜和中膜厚度。I/M厚度与斑块分期的比率(38)用于分级动脉粥样硬化的严重程度。我们平均了每个样本4个不同区域的这些参数的结果，以获得平均值。I/M比值小于0.2的左主冠状动脉被视为无疾病或轻度疾病；I/M比值在0.2到1之间的患者被视为中度疾病；I/M比值大于1或钙化的患者被视为患有严重疾病。

统计。

所有图形都是使用GraphPad Prism软件创建的，统计分析是使用Graph Pad Primm计算的。使用双尾学生的t吨测试。对于多重比较，使用了纽曼-凯尔斯检验的单因素方差分析。采用皮尔逊秩相关检验进行变量间的相关分析。A类P（P）小于0.05的值被认为是显著的。所有结果均由至少3个独立实验证实。误差条代表平均值±SEM。

我们感谢Robert Friesel（缅因州医学中心研究所）提供FGFR1抗体，感谢Ralf Adams（马克斯普朗克研究所）Cdh5 CreER基因^T2段老鼠。我们感谢丽塔·韦伯（Rita Webber）和妮可·科普兰（Nicole Copeland）维持了本研究中使用的小鼠群体。这项工作得到了NIH拨款R01 HL053793（给M.Simons）和P01 HL107205（给M.Simons和M.A.Schwartz）的支持。血脂谱由耶鲁小鼠代谢表型中心核心设施（NIH拨款U24 DK059635）进行。