临床投资杂志。2015年4月1日；125(4): 1433–1445.
NRF2促进神经退行性变和急性神经损伤中的神经元存活
,1 ,1 ,2 ,2和1
熊文军（Wenjun Xiong）
1美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院霍华德·休斯医学院遗传学和眼科系。
亚历山大·麦克尔·加芬克尔
1美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院霍华德·休斯医学院遗传学和眼科系。
李毅清
2波士顿儿童医院，F.M.Kirby神经生物学中心，生命科学中心，哈佛医学院神经外科和眼科，美国马萨诸塞州波士顿。
拉里·本诺维茨
2波士顿儿童医院，F.M.Kirby神经生物学中心，生命科学中心，哈佛医学院神经外科和眼科，美国马萨诸塞州波士顿。
康斯坦斯·塞普科
1美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院霍华德·休斯医学院遗传学和眼科系。
1美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院霍华德·休斯医学院遗传学和眼科系。
2波士顿儿童医院，F.M.Kirby神经生物学中心，生命科学中心，哈佛医学院神经外科和眼科，美国马萨诸塞州波士顿。
2014年11月4日收到；2015年2月5日验收。
- 补充资料
补充数据
GUID:9639F615-C76B-49E1-ADE7-EBBAFB7346A7
摘要
氧化应激在许多疾病条件下以及在正常衰老过程中导致神经元丢失；然而，减少氧化的小分子药物在预防神经退行性变方面并没有取得成功。此外，即使可以有效地系统性减少活性氧和/或氮物种（ROS/NOS），也可能产生有害的副作用，因为这些分子调节正常的生理过程。一种更有效和更有针对性的方法可能是仅在遭受氧化的细胞中增强内源性抗氧化防御机制。在这里，我们创建了几个腺相关病毒（AAV）载体来传递抵抗氧化的基因。这些载体编码转录因子NRF2和/或PGC1a，这些转录因子调节数百个抵抗氧化和其他形式的压力的基因，或超氧化物歧化酶2（SOD2）和过氧化氢酶等酶，这些酶直接解毒ROS。我们在光感受器退化的3个模型和神经挤压模型中测试了这种方法的有效性。AAV介导的NRF2传递比SOD2和过氧化氢酶更有效，而PGC1a的表达加速了光感受器的死亡。由于NRF2介导的神经保护作用延伸至光感受器和视网膜神经节细胞，这两种类型的神经元非常不同，这些结果表明，这种靶向方法可能广泛适用于许多细胞遭受氧化损伤的疾病。
关键词：遗传学、神经科学、眼科学、治疗学
介绍
氧化应激在许多退行性疾病和正常老化中被观察到。这种类型的应激会导致蛋白质、核酸和脂质受损，因此氧化应激在多种情况下对病理学起作用也就不足为奇了(1–三). 这些发现使氧化应激成为一个有吸引力的治疗靶点。然而，目前减少氧化损伤的方法，例如提供高剂量的外源性抗氧化剂，在临床试验中几乎没有疗效(4–7). 有限的临床成功并不反对氧化应激是发病机制的促因，相反，减少氧化的小分子方法可能并不合适。很少有合成抗氧化剂达到高稳定的系统水平，特别是在血脑屏障限制进入的神经系统中(8). 此外，即使可以达到并维持较高水平，系统性降低活性氧和氮物种（ROS/NOS）的策略可能过于迟钝，因为这些分子除了其病理效应外，在信号传递中还具有正常的生理作用(9). 利用通常抵抗氧化损伤的基因进行局部抗氧化治疗，有可能提供一种更具体有效的方法。
抗氧化蛋白根据其功能可分为两类。一组包含ROS脱毒酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和过氧化氢酶。它们可以清除不同细胞隔室中的特定活性氧，是已知最有效的酶之一。例如，SOD2转化超氧化物自由基（O2–)，活性氧在活细胞中的主要形式，转化为H2哦2和O2在线粒体中，过氧化氢酶去除H2哦2在过氧化物酶体的脂质分解过程中产生。这些酶通常在所有细胞中表达，并受到转录调控，转录调控由另一组抗氧化蛋白、转录因子（TF）执行，如过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化子1-α（PGC1a）和核因子红细胞衍生2，如2（NRF2，也称为NFE2L2）(10,11). PGC1a和NRF2是全球调节抗氧化防御反应的2种主要TF。PGC1a是一种多功能转录辅激活剂，也调节线粒体的生物发生和呼吸(12). NRF2通过与调节区域中的抗氧化反应元件（ARE）结合，促进许多解毒、细胞保护和抗炎基因的表达(13). NRF2通过一种“按需”机制发挥作用，该机制在生理条件下由KEAP1的细胞质抑制介导，在氧化刺激下有核积累(14). 这两组抗氧化基因都被提议作为治疗候选基因，例如用于神经退行性疾病、糖尿病并发症和心血管疾病，希望酶具有更高的特异性，比化学抗氧化剂产生更少的副作用，TF将通过激活数百个基因提供广泛的防御(15–17). 然而，只有少数研究通过病毒载体在体内动物模型中的基因传递来测试这种治疗策略(18–25)没有研究比较酶与TF或NRF2与PGC1a的有效性。
我们在遗传性视网膜变性疾病视网膜色素变性（RP）小鼠模型和神经挤压损伤模型中，开发并比较了使用不同抗氧化基因、SOD2/过氧化氢酶、PGC1a和NRF2的基因治疗方法。在大多数遗传性失明中发生退化的关键神经细胞类型是锥体感光细胞，它介导高视力和色觉(26). 这类遗传性疾病具有遗传异质性，在人类中鉴定出至少60个RP基因座，RP是遗传性失明的一种更常见形式(27). 大多数RP基因主要或仅影响杆状光感受器，后者在弱光条件下调节视觉。因此，RP首先表现为夜视功能减退或缺失，因为视杆功能异常，通常在疾病过程中过早死亡(28). 杆死亡后，锥体失去活动并退化，导致日光视力逐渐丧失。虽然并非所有导致非自主性锥体死亡的机制都已知，但其中一个因素是氧化应激。锥体已被证明在RP中含有氧化脂质、核酸和蛋白质(29,30). 氧化应激与RP小鼠锥体的死亡有因果关系，因为抗氧化酶转基因过表达或反复注射抗氧化剂可以减缓RP小鼠模型中锥体的退化(30,31). RP有如此多的疾病基因，而锥体并不直接受疾病基因的影响，而是被非自主效应杀死，这一事实证明，需要一种通用的治疗方法来提高锥体存活率。一种有效的抗氧化策略可能提供一种这样的通用方法。
神经元对轴突的损伤也非常敏感，如脊髓损伤或增加压力的病理条件，如青光眼(32). 在这种情况下也观察到了氧化损伤，因此抗氧化策略也可能对这些情况有益(33–35). 虽然感光细胞是高度专业化和不寻常的神经元，但视网膜神经节细胞（RGC）是更典型的CNS投射神经元，在急性挤压伤中受损。它们有向远处目标投射的长轴突，脊髓运动神经元也是如此。一种流行的模拟神经挤压损伤的方法是切断视神经，从而切断RGC轴突，因此RGC在2周内死亡(36–39). 这为轴突损伤提供了一个极好的模型。
我们使用腺相关病毒（AAV）载体，将SOD2、过氧化氢酶、PGC1a和NRF2联合或单独传递给3种不同RP小鼠模型的锥体感光细胞和遭受神经挤压的RGC。我们发现，抗氧化剂AAV载体可以减缓RP小鼠模型的锥体退化并保持锥体形态。NRF2的过度表达单独表现出最有效的拯救作用，而PGC1a的过度表达则产生了意想不到的有害影响。SOD2加过氧化氢酶的过度表达，或仅NRF2的过度表达有效地保护了神经挤压后RGC的存活。这些结果表明，AAV介导的抗氧化基因治疗，尤其是NRF2，可能是涉及氧化的广泛疾病中多种细胞类型的有效治疗。
结果
抗氧化酶在RP小鼠模型中的表达。
在WT视网膜中，感光细胞表达高水平的抗氧化酶，包括SOD2和GPX1，这些抗氧化酶集中在其内层（IS）(). 这些观察结果与光感受器的ISs具有明显高密度的线粒体这一事实相一致(40)ROS的主要内源性来源(41). 使用shRNA结构来减少光感受器中的这些酶，导致氧化损伤增加和细胞快速死亡(补充图1; 本文的在线补充材料；doi（操作界面）：10.1172/JCI79735DS1号机组)证明了它们在感光细胞存活中的重要性。尽管RP小鼠在杆状体变性过程中存在高氧环境和锥体氧化应激增加(29,42–44)，这些抗氧化酶没有上调(). 为了提供一种特定的长期方法来增强球果的抗氧化能力，编码此类基因的AAV可能会延长其生存期。因此，我们选择SOD2和过氧化氢酶作为一组初始抗氧化基因，因为这两种酶的转基因过表达已被报道可促进RP小鼠模型的锥体存活(31)。
内源性抗氧化酶在小鼠光感受器中的表达。(A类)本研究中使用的3种RP小鼠模型的杆和锥死亡动力学示意图。(B类–E类)内源性SOD2的免疫染色(B类和C类)和GPX1(D类和E类)WT视网膜横截面中的蛋白质。圆锥OS和IS以PNA（绿色）突出显示。这两种酶在光感受器IS中富集。箭头指向圆锥体，圆锥体表达的SOD2/GPX1水平高于周围的棒。(F类–我)SOD2标准(F类和G公司)和GPX1(H（H）和我)P30中的表达第1版视网膜。OS、IS和ONL已塌陷成薄层，SOD2/GPX1表达大部分丢失。比例尺：5μm(B类–我)。
产生编码抗氧化酶和TF的AAV载体。
为了寻找锥体中基因表达的强启动子，我们测试了由几种类型的启动子驱动的GFP报告基因表达，这些启动子要么普遍存在，要么对感光细胞特异(补充图2). AAV载体（1012–1013基因组拷贝[gc]/ml）包装在血清型8衣壳中，对感光细胞感染有效(45,46)，并在视网膜下输送至P0小鼠眼睛。人巨细胞病毒即刻早期（IE）启动子是一个广泛表达的启动子，在锥体中有较强的表达。几乎每个锥体都被GFP明亮地标记在整个视网膜上，一些视杆和视网膜色素上皮（RPE）细胞也表达GFP(、和补充图3). 病毒感染后7天内观察到GFP的表达，并在至少18个月内保持较高水平(补充图4). 事实上，GFP在视锥细胞中的表达是如此明亮和持久（比视蛋白蛋白表达或花生凝集素[PNA]染色更为明显），因此它可以用于跟踪此处分析的退化后期病变视网膜中视锥细胞的存活情况(). 因此，选择CMV启动子是因为其在锥体中的高活性，以及由于在其他细胞类型中表达的潜在额外益处。为了测试是否可以混合载体进行组合基因治疗，我们进一步测量了AAV-CMV-GFP（以下简称AAV-GFP）载体和AAV-tdTomato（以下简称为AAV-td番茄）载体的联合感染率。当每种病毒的滴度大于2×10时，GFP和td番茄共标记的球果百分率高达90%12gc/ml，然后设置为研究中使用的AAV载体的浓度(补充图5)。
锥状细胞表达来自带有CMV启动子的AAV8的高水平GFP。(A类)在P0感染和P30成像后，对切除的视网膜进行AAV-GFP驱动的GFP荧光（绿色）成像。(B类)AAV-GFP感染视网膜的交叉切片。ONL显示高度感染（绿色）。(C类)视网膜横截面的高分辨率图像显示几乎所有视锥细胞中都有明亮的GFP（与红色的PNA标记），而一些视杆细胞中GFP的表达较弱。(D类–F类)一个5个月大的婴儿的短波长和中波长视蛋白染色（S+M视蛋白，以白色显示）罗–/–AAV-GFP感染小鼠视网膜。Opsin染色与GFP在锥体中的表达一致。比例尺：0.5 mm(A类和B类); 20微米(C类–F类)。
接下来，我们创建了一个编码SOD2和过氧化氢酶的AAV载体。过氧化氢酶是一种过氧化物酶体蛋白，被重新定位到线粒体(31)其中，它与SOD2一起可以清除超氧自由基（O2–)线粒体氧化磷酸化过程中产生的主要活性氧。我们制作并比较了两组载体。单个AAV载体（AAV-SOD2-2A-Cat）()对两种抗氧化酶进行编码，并以1:1的比例添加AAV-GFP载体以追踪感染。在第二组中，每个基因由一个也表达GFP的AAV载体编码，GFP表达由IRES元件（AAV-SOD2-IRES-GFP和AAV-CAT-IRES-GFF）指导。对于这两种策略，单独注射AAV-GFP载体的动物作为对照。我们发现，使用IRES元件的载体没有产生高GFP表达，而与每个基因的单独AAV载体的组合策略产生了高水平的GFP和抗氧化酶表达，如IHC在视网膜切片上所示（数据未显示）。因此，我们使用了载体的组合，每个载体编码一个基因用于所有后续实验。GFP中SOD2和过氧化氢酶的表达+通过对蛋白的免疫染色证实了细胞的存在，即使在退化的晚期，它们的表达仍然很稳定()。
SOD2和过氧化氢酶对球果存活的影响。(A类)AAV-GFP和AAV-SOD2-2A-CAT结构示意图。(B类–我)IHC显示AAV载体在平板P60中的异位SOD2和过氧化氢酶表达第1版视网膜。(J型和L（左）)平板安装P50第1版表达GFP的AAV载体感染视网膜(n个= 29) (J型)以及GFP、SOD2和过氧化氢酶(n个= 7) (L（左）). D、 背侧；N、 鼻；五、 腹侧；T、 暂时的。(K（K）和M（M）)每组均显示了视网膜背中部（视神经头背侧1.5mm）250μm×250μm正方形内的持续锥体的高放大图像。(N个)锥体密度量化方案说明。选择位于视神经头背侧、鼻侧、腹侧和颞侧1.5mm处的一个250μm×250μm正方形来表示扁平视网膜每一小叶的锥体存活。GFP公司+计算每个正方形中的锥体，每个视网膜使用4个正方形的平均数。(哦)施工期间的锥体密度第1版退化。每组平均每个时间点有17个视网膜被量化。误差条代表平均值±SEM**P（P）<0.01（未配对双尾学生）t吨测试。比例尺：20μm(B类–我); 1.5毫米(J型和L（左）); 50微米(K（K）和M（M）)。
表达SOD2和过氧化氢酶的AAV治疗视网膜延长视锥存活时间。
我们首先评估SOD2和过氧化氢酶的过度表达是否影响rd1型小鼠，一种具有缺陷磷酸二酯酶β基因的RP模型，导致早发性快速退化(47). 在第1版小鼠，在出生后3周内，棒细胞几乎全部死亡，在接下来的2个月内，锥细胞死亡(). 在出生后不同的日子采集AAV感染小鼠的视网膜，并成像自然GFP荧光。锥体中GFP的表达显示了该模型中锥体死亡的典型中心-边缘进展（参考文献。48和). 为了评估锥体存活率，我们检查了视网膜中部区域（距离视神经头1.5毫米），因为它代表了视网膜的平均退化状态(). 为了量化视锥密度，我们选择了四个250μm×250μm的正方形，分别位于视神经头背侧、鼻侧、腹侧和颞侧1.5mm处，如之前所做的那样(31)和亮GFP的数量+对每个视网膜外部的细胞进行量化(). AAV治疗组和WT（CD1）小鼠P30时的锥体密度相当，表明在此阶段主要锥体死亡尚未扩散到视网膜中层(). 到P50时，视锥细胞变性迅速发展，因此在视网膜中部，对照组的视锥细胞数量显著减少第1版只接受AAV-GFP载体的小鼠(). 相反，AAV-SOD2-2A-CAT处理的视网膜在P50处的锥体密度显著高于GFP对照组（196±8 vs.131±10 cells/0.0625 mm）2,P（P）< 0.01) (). 为了确保救援效果不是针对中背视网膜，我们还量化了整个中央视网膜的锥体密度。虽然椎体退行性变在中心区域更为严重，但我们观察到的救援效果与在中周边测量到的效果相似(补充图6). 在P70第1版变性，SOD2加过氧化氢酶处理的视网膜和对照视网膜之间的差异最小（80±9 vs.76±10细胞/0.0625 mm2,P（P）> 0.05) (). 这些结果表明SOD2和过氧化氢酶过度表达可以减缓但不能阻止锥体死亡。
表达NRF2但不表达PGC1a的AAV治疗的视网膜锥体存活率更高。
抗氧化酶过度表达导致的锥体死亡延迟鼓励我们开发更有效的抗氧化治疗。与作用于特定活性氧并局限于特定细胞隔室的抗氧化酶相比，主抗氧化剂TF可能提供更广泛、更有效的保护。NRF2和PGC1a是2种这样的TF，具有一些重叠但基本上分离的靶基因(10,13,14,49). 我们制作了2个单独的AAV载体（AAV-NRF2和AAV-PGC1a，)并将它们一起或单独添加到rd1型眼睛来确定他们是否能拯救圆锥体的存活。这两种药物一起进行了测试，以确定它们是否起到了相加作用，甚至是协同作用。我们观察到NRF2加PGC1a和NRF2单独但不单独使用PGC1a进行锥体救援(). 仅NRF2的过度表达比这两个基因加在一起的拯救效果稍好，而PGC1a的过度表达加速了锥体死亡，这在P30时间点最为明显(). 这些结果表明，NRF2负责将两种TF添加到一起时所看到的救援效果，因此AAV-NRF2单独用于后续实验。锥体密度的定量显示，NRF2处理的视网膜中留下的锥体比对照视网膜中多（255±17个细胞对131±10个细胞/0.0625 mm2,P（P）<0.0001）或SOD2-CAT治疗的视网膜（255±17 vs.196±8细胞/0.0625 mm2,P（P）< 0.05) (). NRF2的救援效果也更持久。在P70时，NRF2处理的视网膜中的锥体数仍显著高于对照组（159±12 vs.76±10细胞/0.0625 mm2,P（P）< 0.001) ()。
抗氧化TFs对球果存活的影响。(A类)AAV-PGC1a和AAV-NRF2构造的示意图。(B类–D类)平板安装P50第1版表达GFP、NRF2和PGC1a的AAV载体感染视网膜(n个= 10) (B类)、GFP和NRF2(n个= 8) (C类)、GFP和PGC1a(n个= 15) (D类). (E类–G公司)视网膜背中部的持续锥体。(H（H）)施工期间的锥体密度第1版感染指定结构后的退化。每组检查的视网膜平均锥体密度和数量总结如下补充表1误差条代表平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，以及***P（P）通过双向方差分析，<0.0001。(我和J型)平板安装P110第10行表达GFP的AAV载体感染视网膜(n个= 6) (我)以及GFP和NRF2(n个= 13) (J型). (K（K）和L（左）)中背侧视网膜的高倍图像。(M（M）–P（P）)平板安装P160罗–/–表达GFP的AAV载体感染视网膜(n个= 9) (M（M）)以及GFP和NRF2(n个= 6) (N个)，具有高倍图像(哦和P（P）). (问)P110中锥体密度的量化第10行和P160中罗–/–视网膜。每组视网膜数量的量化显示在每个条形图的底部。误差条表示平均值±SEM**P（P）<0.01（未配对双尾学生）t吨测试。比例尺：1.5 mm(B类–D类,我,J型,M（M）、和N个); 50微米(E类–G公司,K（K）,L（左）,哦、和P（P）)。
为了测试抗氧化治疗是否可用于治疗由各种遗传损伤引起的视网膜色素变性，我们在其他2种视网膜色素变性模型中检测了AAV-NRF2治疗对锥体存活的影响：第10行和罗–/–.第10行磷酸二酯酶β基因有不同的突变，并且退化速度较慢第1版(50). 这个罗–/–小鼠视紫红质基因为空，该基因是RP常染色体形式中最常见的致病基因(51)，并提供了比任何一种磷酸二酯酶β菌株更慢的退化模型。我们发现NRF2的过度表达延长了两种模型的锥体存活时间(). 这一结果表明，抗氧化剂AAV载体可用于多种类型RP患者的通用治疗，无论其遗传损伤如何。
AAV-NRF2治疗后视网膜形态改善。
光受体具有专门的形态域，用于捕获光和光传导。光敏外段（OS）富含光转导蛋白，而内质网则富含核糖体和线粒体。在病变视网膜中，当视锥内质网和内质网退化时，视力受损，这种退化发生在视锥死亡之前。因此，我们评估了抗氧化治疗是否不仅延长了椎体存活时间，而且还保留了椎体OS和IS的结构。处理后的视网膜用PNA染色，其轮廓为视锥OSs和ISs。经NRF2处理的椎体比例较高第1版视网膜有PNA染色的结构，类似于OSs和IS，而对照组为锥体第1版视网膜缺乏PNA+P50处的结构(). 早在第30页就进行了这一观察()，在锥状体死亡发生之前第1版视网膜。我们还观察了视蛋白蛋白，它定位于WT视网膜中的视锥OSs(). 然而，在退化的视网膜中，视蛋白蛋白被显示错误定位于细胞体，而不是OS(52)如第160页所示罗–/–视网膜(). 在AAV-NRF2中——处理罗–/–视网膜，视蛋白与PNA在OS和IS中共定位，尽管剩余的OS/IS结构没有WT视网膜长(). 类似的结果出现在第10行NRF2过度表达的视网膜（数据未显示）。这些观察结果表明，抗氧化剂AAV载体不仅可以延长锥体存活时间，还可以保留锥体感光细胞的一个重要功能域。
NRF2对锥体形态的影响。(A类和B类)P50中存活锥体（红色）的PNA染色第1版视网膜。所有图像均取自视网膜背中部区域（距视神经头背侧约1.5 mm）。插图是单个细胞的高倍图像（原始放大倍数，×40A类,B类,D类、和E类插图）。(C类)GFP百分比的量化+P50中背区锥体PNA染色第1版视网膜。每组的每个视网膜大约有300个细胞。误差条代表平均值±SEM。量化的视网膜数量显示在每个条中*P（P）<0.05（未配对双尾学生）t吨测试。(D类和E类)P30的PNA染色第1版视网膜。(F类)WT视网膜中的PNA（红色）和S+M视蛋白（白色）染色。定位于锥体OS的Opsin蛋白。(G公司–L（左）)P160中的PNA和视蛋白染色罗–/–视网膜。在AAV-GFP感染的视网膜中观察到PNA染色缺失和视蛋白对细胞体的定位错误(n个= 9) (G公司–我)，而PNA和视蛋白与AAV-GFP加AAV-NRF2感染的视网膜中剩余的锥膜结构共定位(n个= 6) (J型–L（左）). 比例尺：20μm。
经AAV-NRF2治疗的视网膜氧化减少。
接下来，我们询问抗氧化治疗的拯救效果是否与减少氧化有关。使用氢乙硫胺（一种与超氧自由基反应后会发出红色荧光的染料）评估NRF2处理和对照视网膜中的超氧物水平。对照组P40出现强红色荧光第10行视网膜，如横截面所示，尤其是外核层（ONL）(). 相比之下，我们发现用AAV-NRF2治疗的视网膜信号极小()，表明超氧化物自由基水平降低。感光细胞容易受到氧化应激的影响，因为它们含有高水平的多不饱和脂肪酸。我们通过丙烯醛（脂质过氧化的标志物）的免疫染色检测脂质过氧化水平。NRF2过度表达的视网膜丙烯醛染色水平显著降低(). 这些结果表明，AAV-NRF2能有效保护球果免受氧化损伤。
AAV-NRF2处理视网膜的氧化评估。(A类–F类)氢乙硫胺与P40外周横截面上的超氧物反应后发出红色荧光第10行视网膜感染AAV-GFP(A类–C类)和AAV-GFP加AAV-NRF2(D类–F类). (G公司–L（左）)P30抗丙烯醛染色第1版视网膜感染AAV-GFP(G公司,H（H）、和K（K）)以及AAV-GFP和AAV-NRF2(我,J型、和L（左）). (K（K）和L（左）)视网膜中背侧区域的高放大图像（以红色边框突出显示）如所示H（H）和J型.比例尺：20μm(A类–F类,K（K）、和L（左）); 1.5毫米(G公司–J型)。
AAV-NRF2治疗后视网膜功能改善。
为了测试抗氧化剂基因治疗对延长生存期和保存形态的影响是否能改善视力，我们评估了患者的视力第10行使用光运动试验的小鼠(53). 在最亮的亮度设置（60 cd/m）下进行分析2)测定锥反应。我们首先对未经治疗的患者的视力进行了一项时程研究第10行小鼠，发现他们的视力在P30和P60之间迅速下降(，白色方框）。未经治疗的左右眼第10行尽管动物之间存在差异，但小鼠的视力水平始终非常相似（右眼/左眼[R/L]比值≈1）(，白色条）。因此，未注射的左眼被用作注射AAV的小鼠右眼的动物内对照。接下来我们测量了rd10型在退行性变过程中，单独使用AAV-GFP或AAV-GFP+AAV-NRF2治疗小鼠。在所有动物组中，我们观察到左眼视力下降的速度相似，而用AAV-GFP加AAV-NRF2治疗的右眼视力下降速度较慢(). 我们对治疗效果的评估是基于R/L眼视力的比率，这将同窝出生者之间以及同窝出生者之间的差异降至最低。与GFP治疗组相比，NRF2治疗组（1.34±0.12）动物的R/L眼视力比率增加第10行在第40页观察到动物（1.07±0.04）(). 治疗组和未治疗组之间的差异在P50时变得更为显著，因此NRF2治疗组动物右眼的视力几乎是左眼的2倍（1.92±0.17 vs.1.00±0.11）()。
AAV-NRF2感染后的功能评估。(A类)验光试验用于测试第10行未注射或单独注射AAV-GFP或AAV-GFP+AAV-NRF2的小鼠。左眼和右眼分别显示。(B类)年左右眼视力比第10行P40和P50小鼠。(C类和D类)在第10行第40页的小鼠。典型波形(C类)b波振幅的平均R/L眼比(D类)用于控制(n个=17）和AAV-NRF2–处理(n个=23）显示小鼠。每组测试的小鼠数量显示在每个栏中。误差条代表平均值±SEM*P（P）<0.05和***P（P）<0.0001由未配对的双尾学生t吨测试。
用AAV-NRF2进行抗氧化处理也能保持视锥功能，如进行明视视网膜电图（ERG）时的b波振幅所示。NRF2治疗组在P40处出现更好的波形和明显更高的b波振幅的R/L眼比rd10型视网膜比GFP对照组视网膜（1.20±0.25 vs.0.84±0.09，P（P）< 0.05) ()。
AAV-NRF2基因治疗可以保护更多类型的神经元。
最后，我们想确定抗氧化基因治疗是否可以扩展到氧化应激与细胞死亡有关的其他细胞类型。例如，当神经在创伤性事故中被切断或压碎时，神经元经常表现出氧化损伤(33,35). 我们在RGC轴突损伤模型中测试了抗氧化剂AAV载体，其中80%以上的RGC在视神经挤压（ONC）后2周内死亡(36,38,54). 在本实验中，GFP、SOD2加过氧化氢酶或NRF2 AAV载体在ONC前14天用AAV血清型2衣壳包装并经玻璃体内输送RGC表达(39). ONC后2周，接受编码SOD2和过氧化氢酶的AAV载体或编码NRF2的载体的视网膜保留的RGC明显多于表达GFP的对照视网膜(). 对RGC存活率的挽救作用在ONC后至少延长到4周(). 由于两种类型的抗氧化剂载体都不能促进轴突再生，因此这种作用仅限于存活(补充图7)。
ONC后2周和4周RGC存活率。(A类–C类)视网膜扁平支架中RGC细胞的免疫染色。ONC前两周，成年C57Bl/6J小鼠的眼睛接受玻璃体内注射表达GFP的AAV2载体(n个= 4) (A类)，SOD2-2A-CAT(n个= 6) (B类)，或NRF2(n个= 6) (C类). ONC后2周采集视网膜，并对β3-微管蛋白（Tuj1）（绿色）进行染色，这是一种特殊的RGC标记物。(D类)ONC后2周和4周RGC存活率的量化。数量标准化为WT C57Bl/6J视网膜，无ONC。每组检查的视网膜数量显示在每个条形图中。误差条代表平均值±SEM*P（P）<0.05和**P（P）通过双向方差分析得出<0.01。
讨论
我们已经成功开发出一种抗氧化剂基因疗法，可以延长急性和慢性神经退行性变小鼠模型的神经元存活时间。NRF2（一种主要的抗氧化剂TF）的过度表达以及SOD2和过氧化氢酶（两种抗氧化酶）的过表达减缓了3种感光细胞退化模型中的锥细胞死亡。重要的是，锥体形态和视觉功能也得到了保留。在神经挤压模型中也观察到了这种救援效果，在该模型中，神经元由于轴突的急性损伤而迅速死亡。由于这些治疗挽救了根本不同的细胞类型，因此使用内源性抗氧化防御机制的基因治疗可能对许多类型的神经退行性疾病有效。此外，这些载体可能对其他组织和疾病类型有益，因为NRF2、SOD2和过氧化氢酶广泛表达(55)。
这项研究的一个重要基础是Campochiaro小组的工作，他们证明每天服用抗氧化剂或SOD2和过氧化氢酶的转基因过度表达能够减缓RP小鼠的锥体死亡，例如，在第1版小鼠和P50rd10型老鼠(30,31,56). AAV载体定向稳定表达抗氧化酶或TF，临床试验证明其对眼部基因治疗安全有效(57–59)，应为慢性病（如RP）提供长期保护。如上所述，长期和高剂量的抗氧化剂可能对人体产生副作用，无论如何，很难实现，并且在临床试验中也没有效果(4–7)。
本研究的另一个有指导意义的方面是比较两种主要抗氧化剂TF（PGC1a和NRF2）相互之间以及与SOD2和过氧化氢酶的救援效果。这两种TF被认为是神经退行性疾病的生存促进剂(16,60). 然而，还没有研究比较它们的影响，只有少数研究检测了这些基因过度表达的影响(18–20,24,25). 与SOD2和过氧化氢酶的过度表达相比，NRF2单独的过度表达对感光细胞存活和功能表现出更好的拯救作用。这一结果可能是因为NRF2不仅促进SOD2和过氧化氢酶的表达，而且还协调其他抗氧化基因的诱导，包括像素，过氧化物酶体(Prx公司)以及许多谷胱甘肽和NADPH再生成酶，从而对不同细胞隔室中的各种活性氧中间产物进行更广泛和更平衡的调节(11,61–63). 除了抗氧化作用外，NRF2还被认为通过其下游靶点如NAD（P）H脱氢酶、醌1（NQO1）和血红素氧化酶-1（HO-1）介导细胞保护和抗炎作用(11,61,62). 我们的研究结果表明，小分子NRF2激活剂，包括美国食品药品监督管理局批准的药物富马酸二甲酯（BG-12），目前用于治疗多发性硬化症(64,65)，可能是视网膜变性的有效治疗剂。虽然目前这是高度推测性的，但我们的结果为测试BG-12对RP动物模型的影响提供了理论依据。与NRF2过度表达相比，PGC1a过度表达加速了锥体死亡。这可能是由于PGC1a的活性超出抗氧化调节，例如诱导血管生成(66). 然而，PGC1a过度表达产生有害影响的原因需要进一步研究。尽管如此，我们的结果与一份报告一致，即PGC1a的过度表达导致成年大鼠黑质纹状体系统多巴胺能神经元的明显变性(67)这表明，在某些细胞环境中，将PGC1a保持在生理水平可能很重要。值得注意的是，PGC1a在正常和病变视网膜中的表达已经很高，而NRF2在IHC中无法检测到（数据未显示）。因此，PGC1a的过度表达可能使其水平超过细胞无法耐受的阈值。
视网膜变性疾病具有异常的遗传异质性，约有200个疾病基因和数千个人类突变导致失明(27). 解决每个基因缺陷都是一项困难而昂贵的任务。通用基因治疗，如本文报道的抗氧化基因治疗，对于由不同基因损伤引起的RP患者，以及可能患有其他氧化性视网膜疾病的患者，如青光眼和年龄相关性黄斑生成（AMD），是一种成本有效的治疗方法(68,69). 有趣的是，RPE中SOD2的敲低诱导早期AMD表型(70)许多其他证据表明氧化在AMD中起作用。因此，这些载体可能在这种疾病中有用，特别是对于干燥性AMD，这种疾病没有有效的治疗方法，在75岁以上的人中很常见(71)。
这里证明的抗氧化基因治疗可以显著减缓锥体死亡，因此，在最快的退化模型中第1版在P70时，NRF2处理的视网膜比GFP处理的视网膜中存在更多的锥体。然而，如何将这些影响外推到人类身上尚不清楚。考虑到人类视网膜较大且疾病动力学较慢，NRF2过度表达后锥体存活的时间可能更长。然而，抗氧化基因疗法并没有完全阻止锥体退化。RP椎体死亡不太可能仅由氧化应激引起。相反，椎体死亡可能是由包括但不限于代谢失调在内的多种压力因素综合作用所致(48)，缺乏营养因子(72–76)和炎症(77). 虽然抗氧化基因治疗可以作为一种独立的治疗，但它也可以补充其他基因治疗。它在光遗传治疗中可能特别有用(78). 研究表明，RP小鼠模型中的功能失调锥体对激活由AAV传递的光遗传蛋白卤视紫红质的光反应(79). 光遗传学治疗被认为不是延长RP锥的寿命，而是延长它们的功能期。用一种促进生存的疗法（如这里开发的疗法）来加强视基因治疗，可能会延长生存期和功能。幸运的是，AAV是一种适合于这种组合基因治疗的载体，我们的高共感染率证明了这一点(补充图5). 除了增强光基因治疗外，可对抗氧化应激或提供生长因子的基因治疗也可用作干细胞治疗的补充，以使植入的光感受器细胞在有害的宿主环境中存活。
许多RP患者直到他们的视锥开始退化才被诊断出来，因为许多或大多数视杆丢失后，日光视力受到损害。在这种情况下，早期干预是不可能的，比如用基因替代疗法来挽救棒材。在这项研究中，我们进行了新生儿AAV注射，这有助于病毒接种物在视网膜上传播。需要进一步研究，以确定是否可以通过延迟抗氧化剂AAV注射来实现益处，例如，延迟到大多数棒材消失的时间点。一种有希望的可能性是，考虑到人眼的大尺寸和从周边到中心的视锥丧失的进展，接种到视锥丧失前沿的区域足以延缓视锥退化并保护患者最有价值的中心视力。研究NRF2的过度表达是否不仅拯救了锥体，还促进了锥体OS的再生，这也将是一件有趣的事情，因为锥体OS是光转导的场所，它们的存在与功能相关(79)。
我们还观察到抗氧化剂AAV载体对急性轴突损伤模型ONC后RGC存活的神经保护作用。急性轴索损伤也发生在脊髓损伤中，运动神经元是受损的细胞类型，就像它们在一些较慢但具有破坏性的疾病中一样，如肌萎缩侧索硬化症（ALS）。在ALS干细胞模型中NRF2的过度表达显示出一种益处，尽管体内传递效率太低，无法解释体内的有效性(25). 同样，由于慢病毒本身的有害影响，在小鼠急性脊髓损伤模型中使用编码NRF2的慢病毒的研究也没有定论(19). 然而，在这些条件下发生的氧化损伤需要进一步研究NRF2过度表达的有效性。在眼睛中，筛板附近的轴突损伤会损害视网膜干细胞，导致其丧失和伴随的视力丧失，就像青光眼一样(32). 氧化应激被认为在青光眼的发病机制中起作用(68). 在ONC模型中，超氧阴离子的存在是RGC凋亡的早期标志，玻璃体内注射聚乙二醇结合SOD可促进RGC在轴切术后2周内的存活(33). 关于…的研究编号2-缺陷小鼠显示ONC后RGC数量减少，支持NRF2在损伤后保护RGC的作用(80). 与之前的研究一致，这里报道的实验表明，AAV介导的抗氧化基因治疗延长了RGC生存期。
氧化应激常见于神经退行性疾病，如帕金森氏病(1,81–83). 它可能对线粒体功能障碍和炎症等多种病理途径产生影响，并且是导致神经元死亡的恶性事件级联中的重要环节。例如，帕金森氏病复合物I缺乏引起的线粒体功能障碍可导致活性氧生成增加，进而导致线粒体蛋白质损伤和线粒体DNA突变的积累，从而进一步损害呼吸链的组装或功能(84–86). 有证据表明，NRF2通路是帕金森氏病过程中主要受差异调节的通路之一(87,88)在帕金森氏病动物模型中，小分子或转基因过表达激活NRF2通路可以减缓神经元丢失和疾病进展(89,90). 然而，也有关于NRF2在癌细胞中激活的令人担忧的报道，这表明NRF2存在系统性上调的潜在风险(91,92). 在这里，我们展示了一种通过AAV靶向过度表达NRF2的替代治疗策略，从而提供特异性和治疗寿命，这可能有益于一系列病理条件。
方法
动物。
客户尽职调查1和第1版（FVB/N）小鼠购自Charles River Laboratories。C57Bl/6J和第10行老鼠是从杰克逊实验室购买的。罗–/–小鼠由Janis Lem（美国马萨诸塞州波士顿塔夫茨大学）提供(51). 所有小鼠均保持12小时光照/12小时黑暗循环。
AAV载体构建和病毒生产。
SOD2（MMM4769-99609684）和过氧化氢酶（MMM4769-99609855）的小鼠全长cDNA克隆从Thermo Scientific订购。去除过氧化氢酶过氧化物酶体靶向信号（PTS）（aa序列GSHMAAKGKANL），线粒体靶向序列（简称OTC；正向引物：5′-AAGAATTGCTGTTTAATCTGAGGATCTTAAACAATGGCAGCTTTAGAAAATGGTCACAACTTTCGAATTTCGAAATTTCGGTGGACACCACTACATCGGAGAGCGCCAGC-3′；如前所述，在PCR反应后添加鸟氨酸转氨酰酶基因的反向引物：5′-ATATGCGGCCTAGGCCTGCGTGTGTGA-3′）(31). SOD2，2A（基因共表达的自裂肽；参考文献。93)使用Gibson Assembly Master Mix（新英格兰生物实验室）将过氧化氢酶序列连接在一起，并通过EcoRI/NotI位点将整个SOD2-2A-CAT序列克隆到AAV-MCS8空载体（哈佛医学院DF/HCC DNA资源核心）中。将土拨鼠肝炎病毒转录后元件（WPRE）插入盒的3′端以增强表达。从Thermo Scientific获得NRF2小鼠cDNA克隆（MMM1013-202763164），并将其插入AAV-MCS8载体中，在5′端和3′端添加NotI限制性位点。鼠标第1a部分cDNA由Bruce Spiegelman（美国马萨诸塞州波士顿达纳法伯癌症研究所）提供，并通过NotI/XhoI位点克隆到AAV-MCS8中。AAV-CMV-GFP载体质粒从Harvard DF/HCC DNA Resource Core（克隆ID:EvNO00061595）获得，含有人CMV增强子/启动子、人β-珠蛋白内含子和GFP cDNA。
如前所述，产生重组AAV8和AAV2载体(94). 简单地说，将AAV载体、rep/cap包装质粒和腺病毒辅助质粒与聚乙烯亚胺混合并添加到HEK293T细胞（目录HCL4517；Thermo Scientific）。转染72小时后，收集上清液用于AAV8制剂，并收获细胞用于AAV2制剂(95). 沉淀上清液中的AAV8病毒（与8.5%w/v PEG-6000和0.4 M NaCl在4°C下混合2小时），在7000℃下离心克10分钟，并重新悬浮在病毒缓冲液中（150 mM NaCl和20 mM Tris，pH 8.0）。对于AAV2病毒，将细胞颗粒重新悬浮在病毒缓冲液中，然后进行3次冻融循环，并将Dounce均质。细胞碎片在5000时被丸化克持续20分钟，上清液在碘克沙醇梯度上运行。使用Amicon 100K色谱柱（EMD Millipore）用PBS洗涤回收的AAV载体3次。使用RT-PCR和蛋白质凝胶测定病毒滴度。将病毒稀释至不同浓度以测试感染，浓度约为2×1012抢救实验采用gc/ml。AAV8-CMV（SV40内含子）–GFP质粒（质粒ID:PV0101）用于补充图3是从宾夕法尼亚大学载体核心（美国宾夕法尼亚州费城）获得的，AAV8血清型包装病毒是基因转移载体核心的礼物（美国马萨诸塞州波士顿Schepens眼科研究所）
AAV注射。
如前所述，对P0新生儿眼睛进行视网膜下注射(96,97). 约0.3μl AAV8（1012–1013使用FemtoJet（Eppendorf）控制的拉角玻璃吸管将gc/ml）导入视网膜下间隙。左眼未注射动物内对照药物。
光动力分析。
如前所述，使用验光系统（CerebralMechanics Inc.）测量视力(53). 所有测试均在上午9点至下午2点之间进行。将小鼠放在平台上，并让其在试验箱中适应5分钟。根据周围监视器上虚拟正弦波光栅的速率，对他们进行反射性头部追踪运动评估，并在动物停止追踪时，在最高空间频率（周期/度）下确定视觉敏锐度阈值。测试采用12度/秒漂移速度和100%对比度的光栅。由于右眼和左眼分别对光栅的逆时针和顺时针旋转作出反应，因此分别对其进行了独立测试(98). 采用阶梯式程序，观察者测试低到高视力。每只动物每次试验5至15分钟，试验在断奶后立即开始，持续1至2个月，直到两眼均未观察到明显反应。试验动物的个体对治疗组不知情。
ERG公司。
Espion E3系统（Diagonsys LLC）用于记录ERG第10行老鼠。小鼠被麻醉，双眼瞳孔扩张。根据公布的方案进行了视力ERG检查(31). 小鼠在30 cd/m的背景光下适应光10分钟2锥反应由34 cd×s/m激发2具有10cd/m的低背景光的闪光灯2，信号从50次扫描中平均。
ONC公司。
成年C57BL/6J小鼠从Jackson实验室获得。小鼠在8-10周龄时接受AAV2载体玻璃体内注射。如前所述，在全身麻醉下进行玻璃体内AAV注射和ONC手术(36). 简言之，约3μl AAV2-GFP（控制载体）、AAV2-NRF2或AAV2-SOD2-2A-CAT（均带有约5×1012gc/ml滴度）注入小鼠双眼。注射AAV后14天，用镊子在距视神经头0.5 mm处挤压视神经5秒钟。ONC手术后2周或4周处死小鼠，采集其视网膜和视神经进行IHC，以量化RGC存活和轴突再生（有关RGC轴突再生分析和量化方法的详细信息，请参阅补充材料）。
组织学。
眼睛被剜除，并在背部周围标记方位。视网膜在室温下解剖并固定在4%甲醛中30分钟。对于视网膜切片，将固定视网膜在5%、15%和30%蔗糖中的PBS中冷冻保护数小时，并将其嵌入OCT中的干冰上。切片（20μm厚）在低温恒温器（徕卡）上切割。将视网膜切片或整个视网膜杯用5%BSA封闭在PBST中（PBS用0.1%Triton X-100），在4℃下用一级抗体染色过夜，并用PBST清洗3次。使用不同的封闭溶液（TBS用2%Triton X-100,1%正常山羊血清和0.1%SDS）进行RGC染色。本研究中使用的主要抗体包括：兔抗锥抑制素（1:250；AB15282；EMD Millipore）；兔抗丙烯醛（1:250；ab37110；Abcam）；兔抗红/绿视蛋白（1:300；AB5405；EMD Millipore）；山羊抗蓝色视蛋白（1:100；sc-14365；圣克鲁斯生物技术公司）；兔抗SOD2（1:250；ab13533；Abcam）；兔抗GPX1（1:250；ab22604；Abcam）；兔抗过氧化氢酶（1:1000；ABIN96131；在线抗体）；兔抗β3-管蛋白（1:500；ab18207，Tuj1克隆；Abcam）；罗丹明结合和FITC-结合PNA（1:1000；载体实验室）。使用二级抗体对切片或整个视网膜进行染色，包括驴抗兔CY3、驴抗兔Alexa Fluor 647和驴抗羊Alexa Fluor 646（均以1:1000使用；Jackson ImmunoResearch），并在室温下在黑暗中与DAPI共染2小时，然后安装在Fluoromount-G（SouthernBiotech）中。使用×10物镜和磁贴扫描拍摄扁平安装视网膜的图像，其他所有图像均使用×40物镜和Z轴-叠放在蔡司LSM780共焦显微镜上。用于组间比较的图像是在相同的共焦设置下并排拍摄的。
统计学。
对于锥体密度定量，为其治疗组遮盖视网膜。在每个视网膜中，选择四个250μm×250μm的正方形，分别位于视神经头背侧、鼻侧、腹侧和颞侧1.5mm处，以表示各自小叶中的平均锥体密度。亮绿色荧光蛋白的数量+用ImageJ软件（NIH）对细胞进行定量。一个数字，从4个方块中取平均值，表示1个视网膜的锥体密度。不同阶段群体间锥体密度的统计分析()使用双向方差分析进行。A类P（P）小于0.05的值被认为具有统计学意义。
用荧光显微镜（E800；Nikon）对扁平安装视网膜中8个矩形区域（420μm×560μm）的RGC存活率进行了量化，其中1个图像在4个小叶的每一个小叶中的视神经头上捕捉到1mm，1个图像捕捉到2mm。Tuj1号机组+使用ImageJ软件对细胞进行计数，并对1只眼睛的8个区域的细胞密度进行平均，并将其标准化为WT C57BL/6视网膜中RGC的平均数量。数据表示为平均百分比±SEM。使用双向方差分析进行组间统计分析。A类P（P）小于0.05的值被认为具有统计学意义。
使用未配对双尾学生的t吨测试。A类P（P）小于0.05的值被认为具有统计学意义。
研究批准。
所进行的所有动物程序均获得哈佛大学IACUC的批准，并按照机构指南进行动物护理。
致谢
我们感谢Michael Do、Michael Brown和Greg Bryman的技术援助和深入讨论；巴兹尔·鲍利克和迈克尔·桑德伯格对ERG分析的有用指导；Ru Xiao和Luk Vandenberghe讨论AAV的产生和感染；和布鲁斯·斯皮格曼第1a部分cDNA质粒及讨论。AAV8-CMV（SV40内含子）–GFP病毒是基因转移载体核心（美国马萨诸塞州波士顿Schepen眼科研究所）的礼物。这项工作得到了NIH（RO1 EY023291和R21 EY024137）的支持；霍华德·休斯医学院；以及Miriam博士和Sheldon G.Adelson医学研究基金会。
脚注
利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。
参考信息：临床投资杂志。2015年；125(4):1433–1445. doi:10.1172/JCI79735。
参见第页开头的相关评论1390.
工具书类
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