分析生物化学。作者手稿；PMC 2014年11月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：项目经理3805113
尼姆斯：美国国立卫生研究院510551
使用毛细管western系统精确准确地绝对定量内源性蛋白质
,1,* ,1 ,1 ,2 ,2 ,2和三
陈金秋
1协作蛋白质技术资源，细胞生物学实验室，癌症研究中心，国家癌症研究所，国家卫生研究院，马里兰州贝塞斯达20892
马德琳·R·海德曼
1协作蛋白质技术资源，细胞生物学实验室，癌症研究中心，国家癌症研究所，国家卫生研究院，马里兰州贝塞斯达20892
米歇尔·埃尔曼
1协作蛋白质技术资源，细胞生物学实验室，癌症研究中心，国家癌症研究所，国家卫生研究院，马里兰州贝塞斯达20892
诺埃米·凯迪
2马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究中心癌症生物学和遗传学实验室，邮编：20892
Wonhee Woo公司
2美国国立卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心癌症生物学和遗传学实验室，马里兰州贝塞斯达，20892
彼得·布隆伯格
2马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究中心癌症生物学和遗传学实验室，邮编：20892
保罗·戈德史密斯
三马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心主任办公室科学技术合作办公室，邮编：20892
1协作蛋白质技术资源，细胞生物学实验室，癌症研究中心，国家癌症研究所，国家卫生研究院，马里兰州贝塞斯达20892
2马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究中心癌症生物学和遗传学实验室，邮编：20892
三马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心主任办公室科学技术合作办公室，邮编：20892
通讯作者：陈金秋（Jin Qiu Chen），博士，美国马里兰州贝塞斯达市37号楼Rockville Pike 9000号，2140室，邮编：20892，vog.hin.liam@31jnehc电话，电话：1-301-496-7517，传真：1-301.435-8188 - 补充资料
1
GUID:6120F365-0367-43C4-BA79-8E63835154B4
摘要
在复杂的生物环境中准确定量蛋白质表达水平具有挑战性。在这里，我们描述了一种使用自动毛细管免疫分析系统（基于大小的Simple-Western系统，ProteinSimple，CA）绝对定量细胞裂解液中内源性蛋白质的方法。该方法能够准确测量每纳克细胞裂解物中皮克或亚皮克水平的目标蛋白的绝对量。测量结果独立于细胞基质或细胞裂解缓冲液，并且不受其特定表位的不同抗体亲和力的影响。然后，我们应用该方法定量LNCaP和U937细胞中蛋白激酶C（PKC）亚型的绝对表达水平，这两种细胞系广泛用于探测PKC靶向配体的下游生物反应。我们的绝对定量证实了PKCδ在这两种细胞中的优势，支持这种PKC亚型在这些细胞系中的重要功能作用。这里描述的方法提供了一种精确定量蛋白质表达水平并将蛋白质水平与功能关联的方法。除了与传统的西方分析相比提高了准确性之外，它还避免了在比较具有不同亲和力的不同抗体的信号强度时固有的失真。
关键词：蛋白激酶C（PKC），毛细管免疫分析，Simple Western，定量蛋白质分析
介绍性发言
有关蛋白质表达的信息对于理解蛋白质功能的机制以及制定生物医学发展战略非常重要[1,2]。虽然mRNA定量已被广泛用作蛋白质表达的间接指标，但研究发现，mRNA和蛋白质水平并不总是相关的[三–5]。蛋白质定量方法已经通过基于抗体和基于质谱的技术建立。虽然这些技术提供了有关相对蛋白质水平以及对刺激作出反应的蛋白质修饰的良好信息，但精确定量复杂生物基质中绝对蛋白质水平的方法面临许多挑战[2,6]。例如，由于内源性信号干扰，在ELISA和抗体阵列分析中很难建立定量标准，并且在传统的西方人中观察到分析再现性差。虽然质谱法提供了一个高精度的分析平台，但由于样品基质中普遍存在其他肽和小分子的干扰，因此其精确度可能较低。质谱法还需要复杂的样品制备程序[2,7].
在这份手稿中，我们描述了一种使用基于大小的Simple-Western系统精确、准确地定量细胞裂解液中绝对蛋白表达的方法。Simple Western™是ProteinSimple（加利福尼亚州圣克拉拉）最近开发的一种无凝胶、无斑点、基于毛细血管的自动化Western印迹系统。在Simple Western™分析中，样品制备后的所有步骤都是完全自动化的，包括样品装载、基于大小的蛋白质分离、免疫探针、洗涤、检测和数据分析。该系统极大地减少了传统西式人工过程所造成的可变性。Simple Western™系统生成的数据具有高度的定量性和良好的连续再现性[8]。使用Simple Western™系统，我们开发了一种绝对定量细胞裂解物中内源性蛋白的方法，将GST标记的重组蛋白作为比较标准，并证明了该方法测量总细胞裂解物中Erk1和Erk2绝对水平的可靠性和准确性。为了说明这种方法的威力，我们将该系统应用于LNCaP和U937细胞中PKC亚型的定量。我们能够比较PKC亚型的相对丰度，并定量测定两种细胞系中不同PKC亚型别的绝对蛋白质水平。后一信息有助于理解这些不同的PKC亚型对PKC配体（例如佛波酯或苔藓抑制素1，一种目前正在癌症临床试验中的化合物）激活的信号网络的相对贡献(www.clinicaltrials.gov).
PKC是经验证的癌症治疗靶点[9,10]。目前正在加紧努力，通过结构简化开发下一代与苔藓抑制素相关的药物，同时保持其对PKC蛋白的生物特异性[11–13]。LNCaP和U937是本研究的理想细胞系，因为它们是特征良好的系统，突出了对佛波酯和苔藓抑制素生物反应的巨大差异[11,14]。这项工作的一个关键部分是了解这些细胞中的哪些PKC亚型对反应很重要，以及这些单独的PKC亚型态是如何被佛波酯、bryostatin 1和bryostatin1的各种结构类似物所差异调节的[14–16].
材料和方法
材料
重组蛋白GST-PKCα、GST-PKC-βII、GST-PKCδ、GST-PKCε和GST-Erk1来自SignalChem（加拿大不列颠哥伦比亚省里士满），GST-Erk 2来自EMD Millipore（马萨诸塞州比列里卡）。抗PKCβII（sc-13149）、抗PKCδ（sc-937）和抗PKC（sc-214）的一级抗体来自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯），抗PKC的（#1510-1）来自Epitomics（加州伯灵盖姆），抗Erk1（#05-957）和抗Erk1/2（#06-182）来自Millipore。二级抗体（山羊抗兔或山羊抗鼠辣根过氧化物酶（HRP）结合）来自Jackson ImmunoResearch（宾夕法尼亚州西格罗夫）用于Simple Western™分析，来自Bio-Rad（加利福尼亚州赫克勒斯）用于常规Western分析。人前列腺癌细胞系LNCaP、人单核细胞白血病细胞系U937、人乳腺癌细胞系MCF7、人宫颈癌细胞系HeLa、胎牛血清（FBS）和RPM1-1640培养基来自ATCC（Manassas，VA）。
细胞生长
细胞在37°C、5%CO的增湿大气中生长2使用ATCC推荐的生长介质。
用于简单西方分析的细胞裂解物制备
用M-Per缓冲液（Thermo Scientific，Waltham，MA）或RIPA缓冲液（20 mM HEPES（pH 7.5），150 mM NaCl，1%NP40替代物，0.25%脱氧胆酸钠（w/v）和10%甘油）溶解细胞，其中含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂（EMD Millipore，Billerica，MA）。使用Pierce 660蛋白质分析和BSA标准（Thermo Scientific，Waltham，MA）在SpectraMax Plus384（分子器件，加州森尼维尔）微孔板阅读器上测量蛋白质浓度。
实时RT-PCR分析
按照制造商的方案（加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen），用TRIzol试剂从培养细胞中分离出RNA。对于cDNA合成，使用制造商推荐的iScript Advanced cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）逆转录1.5µg总RNA。使用iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）在150倍稀释的cDNA上对20µl体积的MyiQ或iQ5仪器（Bio-Rad）进行实时qPCR。所用的引物是预先设计和验证的引物，引物来自基亚根（加利福尼亚州巴伦西亚），用于PKC和GAPDH，或来自奥里金（马里兰州罗克维尔），用于其他基因。使用2计算相对基因表达水平−（Ct）公式，其中Ct表示感兴趣基因和GAPDH之间的周期差异，用作内部控制。在准备好包含所有相关转录物的系列稀释（1:5）“通用”RNA样品上测试时，qPCR反应的效率在99%到109%之间。
蛋白质印迹分析
在含有1%Triton X-100并辅以蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Roche、Branford、CT）的冰冷磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）中通过旋涡和超声处理制备总细胞裂解物。在冷却的微型离心机（Eppendorf）中，以2600×g的速度离心5分钟，去除细胞碎片。含有相同数量蛋白质的样品（使用BIO-RAD测量的蛋白质浓度直流Tm公司蛋白质分析）添加到SDS和含有β-巯基乙醇的样品缓冲液（Quality Biological Inc）中，在100°C下培养5分钟，在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶（Invitrogen）上分离，并在100伏（恒定）电压下转移到硝化纤维素膜（GE Healthcare，Waukesha，WI）中使用Mini-Trans-Blot®电泳转移池（Bio-Read）持续75分钟。用在PBS中稀释的5%脱脂干乳（Bio-Rad）封闭膜，用一级抗体在4°C下培养过夜（根据经验确定稀释度以获得最佳结果），清洗（在含有0.5%吐温-20的PBS中3次10分钟），并用二级抗体在室温下培养1小时。清洗后（在含有0.5%吐温20的PBS中3次10分钟），信号由ECL产生，并在高性能化学发光膜上检测（GE Healthcare）。扫描的胶片使用Adobe Photoshop CS3（Adobe Systems，McLean，VA）进行编辑。
简单西方分析
根据ProteinSimple用户手册进行简单的Western分析。简而言之，将细胞裂解物样品与主混合液（ProteinSimple，加州圣克拉拉）混合至最终浓度为1×样品缓冲液、1×荧光分子量标记和40mM DTT，然后在95°C下加热5分钟。样品、封闭试剂、一级抗体、HRP结合二级抗体、化学发光底物、分离和堆积矩阵也被分配到384孔板中的指定孔中。平板装载后，分离电泳和免疫检测步骤在毛细管系统中进行，并完全自动化。Simon Simple Western分析在室温下进行，除以下规定外，均使用仪器默认设置。。首先用分离矩阵填充毛细管，然后用堆叠矩阵填充，并加载约40nL样品。在电泳过程中，蛋白质根据分子量通过堆积和分离矩阵在250伏电压下分离40-50分钟，然后使用专有的光活化捕获化学固定在毛细管壁上。然后将基质洗掉。接下来用封闭试剂培养毛细血管15分钟，然后用一级抗体和HRP结合的二级抗体对靶蛋白进行免疫检测。所有抗体在Immunobooster（马里兰州艾里山生物世界咨询实验室）或抗体稀释液（ProteinSimple）中以1:50或1:100稀释。使用Immunnobooster的抗体孵育时间为10–15分钟，或使用抗体稀释液的抗体孵化时间为60–120分钟。然后添加鲁米诺和过氧化物（ProteinSimple）以产生化学发光，化学发光由CCD相机捕获。用Compass软件（ProteinSimple）对数字图像进行分析，并将检测到的蛋白质的量化数据报告为分子量、信号/峰值强度等。
结果和讨论
细胞裂解液中内源性蛋白的绝对定量
使用Simple Western™系统，以Erk2为LNCaP细胞裂解物中的原型，开发了内源性蛋白质的绝对定量方法。将代表标准物的重组GST-Erk2的系列稀释液加入LNCaP裂解液中。重组蛋白/细胞裂解物混合物在Simple Western系统上分离并分析Erk2。GST-Erk2标准物上的GST标签赋予内源性Erk2的大小变化，允许信号从内源性Erk2和外源性Erk2标准物分离。说明了一个具有代表性的实验，数据分别以伪凝胶和电泳图格式显示，使用识别ERK1和Erk2的ERK1/2抗体。随着GST-Erk2标准的不断降低，可以看到Erk1/2的恒定水平。峰面积表示目标信号强度，并由计算机软件精确量化。在1.25至40 pg GST-Erk2蛋白范围内观察到检测到的Erk2信号的线性(). 使用Rudolph等人描述的线性回归分析方法[17]，内源性Erk2的量是从加标GST-Erk2和内源性Erk2的强度相等（强度比=1）的点计算的。在单个实验中，如所示我们发现，根据最佳拟合线性曲线预测GST-Erk2的6.67 pg，产生的信号与16.5 ng LNCaP裂解物中存在的内源性Erk2信号等效(). 进一步的转化，解释了两种蛋白质之间的分子量差异（GST-Erk2 MW=67.8 kDa，Erk2 MW=42 kDa），表明16.5 ng LNCaP裂解液中存在4.13 pg的内源性Erk2，表明0.25 pg Erk2/ng LNCa裂解液的浓度。
LNCaP裂解液中内源性Erk2的绝对定量将GST-Erk2重组蛋白的系列稀释液加入16.5 ng LNCaP裂解液中，将重组蛋白/细胞裂解液样品与样品装载主混合液混合，并按照方法所述的Simple Western系统进行分析。（A） 使用抗Erk1/2抗体进行印迹的Simple Western结果的伪凝胶和（B）电离层图图像；（C） 绘制GST-Erk2信号强度与GST-Erk2峰值量的关系图。用1.25至40 pg GST-Erk2观察到检测线性；（D） 内源性Erk2测定的线性回归分析。当强度比=1时，根据最佳线性曲线预测GST-Erk2的6.67 pg。数据是具有代表性的实验。虚线表示95%的保密间隔。
为了测试定量方法的稳健性，在LNCaP裂解物总量变化时测量内源性Erk2的绝对量。如所示在7.6～60.8 ng的样品中，平均获得0.26 pg Erk2/ng的总细胞裂解蛋白。样品之间的CV%为8.4%。
表1
赖氨酸盐量
（ng） | Erk2号机组
（裂解液中的pg） | Erk2号机组
（裂解液pg/ng） |
|---|
|
|---|
| 7.6 | 2.06 | 0.27 |
| 16.5 | 3.93 | 0.24 |
| 33 | 8.11 | 0.25 |
| 60.8 | 17.9 | 0.29 |
|
| 意思是 | | 0.26 |
| %简历 | | 8.4 |
为了检测不同的裂解物或不同的裂解液制备条件是否会影响GST-Erk2的定量，我们比较了向不同裂解物中添加等量GST-Erk2蛋白后的信号。裂解物来自三种细胞系，即HeLa腺癌细胞、MCF7乳腺癌细胞或LNCaP前列腺癌细胞，并用基于Bicine/CHAPS的M-per-lysis缓冲液制备[18]或基于HEPES/NP-40的RIPA裂解缓冲液(). 虽然GST-Erk2、内源性Erk1和Erk2的活性受不同缓冲条件的影响()，GST-Erk2的测定量没有改变。在各种条件下，观察到其信号的%CV小于10%(). 虽然本实验的目的是检测不同细胞裂解物或裂解条件对GST-Erk2信号的可能影响，但可以注意到，与Hela和LNCaP细胞相比，MCF7细胞中Erk2的绝对表达水平和与Erk1信号的比率都较高。本文描述的方法可用于进一步量化和比较Erk蛋白的表达水平，以研究Erk蛋白在不同细胞类型或生物过程中可能的差异功能。我们进一步评估了如果我们使用识别蛋白质不同表位的不同一级抗体，内源性蛋白质的测量量是如何进行比较的。本次评价以内源性Erk1为靶点，以纯化的Erk1作为标准。一种抗体是Erk1特异性抗体（Millipore，#05-957），另一种抗体识别Erk1和Erk2蛋白（Millipore，#06-182）。这两种抗体的结果相当(). 测量值为0.27±0.02 pg和0。用抗Erk1抗体和抗Erk1/2抗体分别测定MCF7细胞总细胞裂解物蛋白的31±0.05pg（平均值±SD，n=3个实验）Erk1/ng。抗Erk1/2抗体的标准偏差稍高，可能是由于Erk2信号的轻微干扰。
Erk2信号的矩阵效应将10 pg（Run 1&3）或20 pg（Ran 2）的GST-Erk2加入用M-per或RIPA缓冲液制备的HeLa、MCF-7和LNCaP细胞裂解液中，并用Simple Western系统进行分析。（A） 一次典型运行的伪凝胶图像表明，在使用M-per或RIPA缓冲液制备的不同细胞裂解液中，GST-ERk2信号强度几乎相同。（B） 将GST-Erk2信号归一化为HeLa M-per-lysate中的GST-Erk2信号，并进行比较。
表2
用抗Erk1特异性抗体和抗Erk1/2抗体定量MCF7细胞内生Erk1
| 抗Erk1
（pg Erk1/ng裂解物） | 抗Erk1/2
（pg Erk1/ng裂解物） |
|---|
| 运行1 | 0.24 | 0.25 |
| 运行2 | 0.28 | 0.33 |
| 运行3 | 0.28 | 0.35 |
|
| 平均值 | 0.27 | 0.31 |
| 标准偏差 | 0.02 | 0.05 |
| %简历 | 7.4 | 16.1 |
上述数据表明，使用Simple Western™系统，我们能够精确、准确地定量细胞裂解物中内源性蛋白质的绝对量。测量没有明显受到细胞基质、样品裂解缓冲液或抗体亲和力差异的影响。
PKC亚型的绝对定量及其在LNCaP和U937细胞中的比较
作为我们对佛波酯、苔藓抑制素1和合成苔藓他汀1类似物的不同作用机制的表征的一部分，我们发现各种配体与LNCaP和U937细胞中的各种内源性PKC亚型发生不同的相互作用并下调其表达[14–16]。它们同样对PKC下游的细胞和分子反应有不同的影响。鉴于PKC亚型在底物选择性和绝对活性方面仅表现出适度差异，了解PKC亚型别表达的绝对水平将有助于更好地了解各种亚型对下游反应的贡献。例如，Caino等人利用siRNA抑制LNCaP细胞中单个PKC亚型的表达，得出结论认为PKCδ在佛波酯处理诱导基因反应中起主要作用[19]。这是PKC亚型特异性或表达水平的影响吗？
使用qPCR，我们比较了LNCaP和U937细胞中不同PKC亚型的mRNA表达水平。发现了高达6个数量级的表达水平差异(). PKCδ和PKCα是LNCaP细胞的主要亚型，PKCε水平较低。相对表达水平分别为1、0.25和0.03（请注意). PKCⅡ的mRNA水平比PKCδ低几个数量级。在U937细胞中，PKCδ和PKCβII是主要的亚型，PKCε和PKCα水平较低。PKCδ、PKC II、PKCε和PKCα的相对表达水平分别为1、2.2、0.07和0.0005。
LNCaP和U937细胞中PKC亚型的比较（A） PKC亚型的qPCR定量。对LNCaP和U937细胞制备的RNA进行实时RT-PCR分析，使用针对指示基因和GAPDH的预先设计和验证的引物作为对照。数据表示三个独立实验的平均±SEM值。（B） 常规蛋白质印迹分析。用SDS-PAGE分离LNCaP和U937细胞制备的15 g总细胞裂解物，并用指示的抗体进行电转移和免疫印迹。显示了三个独立实验中所有PKC信号使用相同ECL曝光时间的代表性图像。肌动蛋白信号被用作负荷控制。（C） 使用中描述的方法绝对定量PKC亚型蛋白质数据表示至少三个独立实验的平均±SD值（参见补充表格详细信息）。
PKC亚型蛋白表达的传统蛋白质印迹法给出了一个稍微不同的图像(). 在LNCaP细胞中，PKCδ占主导地位，PKCα和PKCε似乎相似，相比之下，相对于PKCα，PKCε的mRNA表达水平明显较低。在U937细胞中，PKCδ的带强度最强，PKCⅡ和PKCε的带强度降低。再次，蛋白激酶Cε和蛋白激酶CβII的相对表达在western-blotting中与qPCR中显示出特殊差异，qPCR显示出30倍的差异，但western-blotting显示出更大的相似性。
当然，这两种PKC亚型相对表达的测量值只是PKC亚组蛋白实际表达水平的间接指标。mRNA表达水平不能包含翻译效率或蛋白质的差异稳定性。通过western blotting比较带强度在很大程度上取决于所比较的不同蛋白质的抗体亲和力的差异以及图像曝光时间的可能变化。
为了确定LNCaP和U937细胞中PKC亚型的绝对水平，我们使用了上述方法，将细胞裂解液与单个纯化的GST-PKC亚型别进行加标，并使用Simple Western™系统进行定量(，另请参见补充材料用于代表性的线性回归分析数据）。因此，我们可以确定每个细胞系中单个PKC亚型的相对表达水平以及它们相对于总蛋白的绝对水平。在LNCaP细胞中，PKCδ、PKCα的相对蛋白表达水平分别为1、0.05和0.02，在最低PKCε抗体检测限（约为总蛋白的0.032 pg/ng）中几乎检测不到PKCε的表达。在PKC II抗体最低检测限时，未检测到内源性PKC II蛋白，低于总蛋白的0.062 pg/ng。在U937细胞中，PKCδ、PKC II和PKCε的相对蛋白表达水平分别为1、0.51和0.02。在PKCα抗体最低检测限时，未检测到内源性PKCα蛋白，该检测限小于总蛋白的0.009 pg/g。数据表明，PKCδ是LNCaP细胞中主要的PKC亚型，而U937细胞中PKCδ和PKCβII的表达较高。
所有三种方法都显示LNCaP和U937细胞之间相对PKC亚型表达水平的相似性。例如，PKCβII、PKCδ和PKCε在U937细胞中的表达水平较高，而LNCaP细胞的PKCα表达高于U937。将绝对定量法与qPCR提供的mRNA表达的间接测量值或western blotting的条带强度进行比较，发现特定细胞中不同PKC亚型的表达水平存在一些差异。在U937细胞中，qPCR表明PKC II的水平高于PKC，而不是绝对蛋白定量或western blotting。在LNCaP细胞中，western blotting表明PKC在水平上与PKC相似，而绝对蛋白定量或qPCR显示PKC表达低于PKC（参见详细信息）。
LNCaP细胞中PKCδ亚型的优势与该亚型对PMA诱导的基因表达的贡献一致[19]。Simple Western™定量显示，这些细胞中PKCε表达水平相对较低，这同样有助于解释这种异构体对PMA对基因表达影响的有限贡献。在U937细胞中，PKCβII蛋白的高水平表达与bryostatin 1的研究结果相吻合，bryostatin1导致PKCβⅡ的下调幅度远大于PMA，它不能像PMA一样诱导细胞粘附和增殖抑制的长期效应[15].
结论
Simple Western™系统具有高质量的数据定量和卓越的分析再现性，使我们能够检测蛋白质异构体的相对丰度，并开发出一种在微克或亚微克水平上精确定量蛋白质的方法。细胞裂解物中内源性蛋白的绝对定量方法被证明是可靠和准确的，因为它不受样品基质、样品浓度和检测抗体变化的影响。蛋白质的绝对定量避免了因不同靶蛋白的抗体亲和力不同而引起的问题，这在许多情况下可能会产生相对丰度的误导性印象。尽管在加入纯化蛋白标准物后，通过传统的western印迹法可以获得一些近似的绝对表达水平，但Simple western™系统结合了操作简便性、广泛蛋白质负荷的线性、严格定量和良好的分析再现性。这里描述的方法提供了一种准确关联蛋白质数量及其功能的方法。在相对表达水平对其功能至关重要的情况下，这可能特别重要，就像复合体中假定的蛋白质伴侣一样。
虽然此处描述的标准化方法代表一种方法，但也可以考虑其他替代方法。如果在特定设置中确认了信号的线性，则可以使用单一浓度标准的复制品进行归一化。同样，可通过在不包括实验细胞裂解物的平行样品中装载纯化的未标记标准蛋白来实现标准化。后一种方法将控制GST或其他蛋白质标签所赋予标准的抗体信号的任何畸变，尽管它也无法控制裂解物或负载的任何影响。考虑到这里所描述的系统的健壮性，所有这些方法都将是强大的。
鸣谢
本研究得到了国家癌症研究所癌症研究中心国立卫生研究院院内研究计划（项目Z1A BC 005270，Z1C BC 011434）的支持。
脚注
出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
工具书类
1Brody EN、Gold L、Lawn RM、Walker JJ、Zichi D.高含量亲和力蛋白质组学：解锁蛋白质生物标记物发现。专家Rev Mol Diagn。2010;10(8):1013–1022.[公共医学][谷歌学者] 2Gillette MA，Carr SA。靶向质谱法定量分析生物医学中的肽和蛋白质。自然方法。2013;10(1):28–34. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。de Sousa Abreu R、Penalva LO、Marcotte EM、Vogel C.蛋白质和mRNA表达水平的全球特征。分子生物晶体。2009;5(12):1512–1526. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Pascal LE、True LD、Campbell DS、Deutsch EW、Risk M、Coleman IM、Eichner LJ、Nelson PS、Liu AY。mRNA和蛋白质水平的相关性：前列腺中簇指定抗原的细胞类型特异性基因表达。BMC基因组学。2008年；9：246。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Lu P，Vogel C，Wang R，Yao X，Marcotte EM。绝对蛋白表达谱估计转录和翻译调控的相对贡献。国家生物技术。2007;25(1):117–124.[公共医学][谷歌学者] 6Ellington AA、Kullo IJ、Bailey KR、Klee GG。基于抗体的蛋白质复合平台：技术和操作挑战。临床化学。2010;56(2):186–193. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Rifai N，Gillette MA，Carr SA。蛋白质生物标记物的发现和验证：临床应用的漫长而不确定的道路。国家生物技术。2006;24(8):971–983.[公共医学][谷歌学者] 8Nguyen USN，Boge A，Fung PA。简单西方[贸易]：一种无凝胶、无污渍、无需动手的西方印迹重塑。自然方法。2011;8（11） ：v–vi。 [谷歌学者] 9Griner EM，Kazanietz MG。蛋白激酶C和其他二酰甘油效应物在癌症中的作用。Nat Rev癌症。2007;7（4） ：281–294。[公共医学][谷歌学者] 10Teicher BA。蛋白激酶C作为治疗靶点。临床癌症研究。2006;12(18):5336–5345.[公共医学][谷歌学者] 11Keck GE、Kraft MB、Truong AP、Li W、Sanchez CC、Kedei N、Lewin NE、Blumberg PM。通过吡喃环化聚合苔藓抑制素1的高效类似物：苔藓生长抑制素类似物，模拟佛波酯功能。美国化学学会杂志。2008年；130(21):6660–6661. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Hale KJ，Manaviazar S.苔藓抑制素抗肿瘤大环内酯的全合成新方法。亚洲化学杂志。2010;5(4):704–754.[公共医学][谷歌学者] 13Wender PA，Miller BL.分子前沿的合成。自然。2009;460(7252):197–201. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Kedei N、Telek A、Czap A、Lubart ES、Czifra G、Yang D、Chen J、Morrison T、Goldsmith PK、Lim L、Mannan P、Garfield SH、Kraft MB、Li W、Keck GE、Blumberg PM。合成的苔藓抑制素类似物Merle 23剖析了LNCaP人前列腺癌细胞系中苔藓酶活性的不同机制。生物化学药理学。2011;81(11):1296–1308. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Kedei N、Telek A、Michalowski AM、Kraft MB、Li W、Poudel YB、Rudra A、Petersen ME、Keck GE、Blumberg PM。通过比较LNCaP和U937癌细胞系对佛波酯、苔藓抑制素1和苔藓他汀类似物的转录反应，可以了解它们的不同作用机制。生物化学药理学。2013;85(3):313–324. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Kedei N、Lewin NE、Geczy T、Selezneva J、Braun DC、Chen J、Herrmann MA、Heldman MR、Lim L、Mannan P、Garfield SH、Poudel YB、Cummins TJ、Rudra A、Blumberg PM、Keck GE。不太亲脂性和合成更易获得的Bryostatin 7的生物特征与Bryostatin1的相似。ACS化学生物。2013 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Rudolph C，Adam G，Simm A.通过定量蛋白质印迹法测定每个细胞C-Myc蛋白的拷贝数。分析生物化学。1999;269(1):66–71.[公共医学][谷歌学者] 18Yang Boja E、DeFilippes F、Fales HM。三种专利洗涤剂的电喷雾质谱。分析生物化学。2000;285(2):205–210.[公共医学][谷歌学者] 19Caino MC、von Burstin VA、Lopez-Haber C、Kazanietz MG。通过全基因组表达分析确定的蛋白激酶C同工酶对基因表达的差异调节。生物化学杂志。2011;286(13):11254–11264. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
