基于抗体的蛋白质复合平台：技术和操作挑战

摘要

半个多世纪以来，基于单链抗体的免疫分析一直是蛋白质测量的主力，诊断市场上有数百种分析。ELISA是最常用的单链分析格式，但这些分析可能费力且昂贵，并且可能消耗相对大量的患者样本。使用多标记物策略获取增量医疗诊断和预后信息的潜力刺激了在同一样本上提供多个平行蛋白质测量的分析方法的发展（多重分析）(1). 多重分析可用于早期诊断、鉴别诊断、疾病分期和确定疾病预后(2). 然而，由于这些测试的复杂性，需要对用于临床试验或诊断实验室的复合蛋白测试板进行广泛验证(三). 在这里，我们概述了基于抗体的多重免疫分析平台，重点关注技术和操作挑战。

多重免疫分析格式

目前的多重免疫分析使用传统的免疫分析原理，其中高亲和力捕获配体被固定在平行分析中。主要系统使用抗体或蛋白质/肽作为结合分子，在与生物样本孵育期间分别捕获循环蛋白质或自身抗体。未结合的蛋白质通过洗涤去除，捕获的蛋白质通常使用各种标记的报告配体进行检测，尽管采用了无标记检测策略，包括使用表面等离子体共振的光学生物传感(4)和旋转圆盘显微干涉测量(5)和压电声学传感器，如石英晶体微天平(6,7)，是替代检测方式。检测标签量化后，信号强度要么使用校准曲线转换为质量单位，要么进行定性评估。

多重免疫分析系统分为两类：平面分析和悬浮微球分析。埃金斯(8)20多年前概述了平面微阵列技术的基本原理，表明与传统免疫分析相比，免疫分析的小型化由于提高了信噪比和缩短了扩散距离而减少了反应时间，从而提供了更好的定量下限。二维平面多路复用器由捕获配体的高密度微点组成（直径<250µm；>1000个点/cm²)固定在空间离散位置的刚性表面上，使得多个捕获配体固定在1孔中(图1). 发光体是平面分析中最常见的报告物，因为产生的化学发光信号具有高灵敏度和宽动态范围（约5 log）(9). 最近，电化学发光技术已被使用，其中Ru（bpy）等标签_三²⁺仅当靠近受激电极表面时才发出信号(9). 信号通过显微镜增强，捕获的图像通过特定于平台的软件包进行分析。尽管平面分析通常是手动执行的，但分析的自动化可以提高分析的稳健性和样本吞吐量。使用自动液体移液器添加样品和分析试剂已经证明了自动化的可行性(10).

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图1

平面和悬浮复合免疫分析格式。在平面分析中，捕获配体固定在刚性二维载体上，并用样品进行探测

荧光或化学发光信号由x个,年协调。在悬浮液分析中，捕获配体固定在彩色或尺寸编码的微球上。分析通过编码属性进行区分，流式细胞术用于检测分析特异性荧光信号。

三维悬浮复合物使用直径约5.3µm的微球作为固体载体，不同的捕获配体通过N个-羟基琥珀酰亚胺酯化学(图1) (11). 与平面复合物相比，蛋白质鉴定依赖于平面复合物x个,年位置，微球使用分类器，如大小或内部荧光团进行分析分配。流式细胞术原理用于产生结果：通过光散射（大小）或内部荧光比率区分分析特异性微球，并通过附加荧光标记生成分析依赖性信号。荧光激活细胞分选是悬浮阵列检测中使用的基本技术，已在诊断中常规使用了20多年(12,13). 悬浮复合体的动态分析范围约为3个原木(14). 与平面多重分析法相比，多重悬浮分析法的一个优点是，由于在每个微球群中进行了多次（50–100）独立测量，因此提高了不精确性。悬浮液分析也很容易与商业液体处理解决方案实现自动化。悬浮液分析的一个缺点是，用于清洗微球的过滤器底部微孔板容易泄漏、堵塞，并且非特异性分析物吸附到过滤器表面(15). 使用磁珠可以克服这一限制。由Co:Nd:Fe组成的磁珠₂O（运行）_三允许在分离和洗涤分析步骤中通过外部磁场进行操作(16).

多重免疫分析配置

开发多重免疫分析需要严格验证分析配置和分析性能，以尽量减少测量不精确性。捕获配体选择和固定的优化、分析校准和分析性能（确定样品培养时间、降低分析之间的交叉反应性和非特异性蛋白质结合）是平面和悬浮复合格式的重要开发组成部分。

捕获配体

开发稳健的多重蛋白免疫分析的关键步骤是捕获配体的产生和表征。这些系统依赖于与靶蛋白紧密结合的高度特异性捕获配体的可用性。然而，由于组成氨基酸的大小和疏水性的不均一性，很难预测哪些材料与目标蛋白具有高亲和力(17).经典杂交瘤技术产生的单克隆抗体是最常见的捕获配体(18). 然而，单克隆抗体的生产和亲和力、特异性、交叉反应性和动力学参数（结合率和解离率）的表征都是劳动密集型和成本密集型的过程。尽管抗体特性对检测性能有直接影响，但当前的抗体“验证”协议往往不够充分；一些人在蛋白质印迹上只评估蛋白质条带的分子量(19). 最近，有两种高通量方法被描述为使用多重固定化蛋白质或肽进行抗体表征。一种是使用平面格式来同时分析表位识别和结合亲和力，以确定抗体特异性和亲和力(20). 另一种方法使用Luminex平台上的悬浮液格式，在几个小时内确定对多达100种抗原的抗体特异性(21).

单链抗体免疫分析验证的抗体可能以多种形式显示与其他蛋白质的交叉反应性，突出了应用特定抗体验证的需要(22). 此外，三明治免疫分析需要针对每种组成蛋白质的2种经验证的抗体。

鉴于抗体的局限性，正在评估替代捕获配体，如工程蛋白支架和核酸支架(23). 例如，适体，一种区分蛋白质异构体和构象的高度特异性核酸分子，与抗体一样具有靶标识别特征(24). 欧洲和美国最近的举措旨在提高亲和试剂的可用性和质量，最终目标是为蛋白质组分析创建经过验证的结合分子的标准化集合，以提高分析质量(23).

抗体固定化

抗体固定对可重复测量至关重要。理想的抗体固定化化学必须具有高结合能力、保持免疫活性的能力、高信噪比和批次间的低变异性(25,26). 虽然抗体比其他蛋白质变性的可能性小，但即使是最小的变性也可能暴露出疏水区域，从而增加非特异性蛋白质结合，并可能改变定量下限。在平面微阵列中，影响稳健免疫分析性能的固定参数包括斑点大小和形态、总抗体结合能力、背景信号、检测限以及阵列内和阵列间的斑点再现性(26). 通过在17种市售载玻片化学物质中生成23种测定的校准曲线来说明评估这些参数的重要性；这些曲线表明，玻片表面特性影响固定化抗体的活性和随后的数据质量(26). 在多重悬浮液分析中，标准抗体固定协议可能掩盖由大量赖氨酸或精氨酸残基组成的抗原识别表位，导致抗体无法识别其各自的抗原(21).

制造过程

分析制造过程中的可变性也会导致分析不精确。在平面多路复用器中，阵列打印是一个主要的变化源。机器人通过将捕获抗体的斑点以预先定义的模式沉积在微孔板孔上来打印阵列。打印头结构，如实心针和压电（喷墨），区分微阵列打印格式(19,27). 固体针接触式打印机将抗体从贮存器中提取到针中，并通过毛细管作用沉积抗体。抗体沉积量取决于针停留在微孔板上的时间长度。接触式阵列打印机的一个潜在限制是随着源库耗尽抗体沉积减少(27). 非接触式压电打印机使用电脉冲为每个点分配离散数量的捕获配体，理论上减少了板之间的点对点变化和整体变化(27). 然而，这种技术并不适合于沉积粘性材料或复杂混合物，并且需要较长的清洗周期(27). 高质量的平面阵列依赖于严格的打印程序。例如，我们通过目视检查从平面阵列获得的化学发光图像来观察打印错误，这突出表明需要更稳健的打印方法(图2A) (28).

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图2

多重分析制造中的变化可能会引入测量误差

（A） ，平面免疫分析6-plex从7个离散位置发出化学发光信号。绿色方框括起校准曲线。红色方框中包含不精确度>30%的重复样品。（B） ，一对微球（49,9.1µm；50,6.3µm）说明了悬浮分析中使用的珠粒的大小差异[Hanley等人(29)]. 面板B改编自Hanley等人(29)并根据知识共享署名许可证进行重印(http://creativecommons.org/licenses/by/2.0); 原始文章具有以下版权和许可证持有人信息：“©2007 Hanley等人；许可证持有人BioMed Central Ltd.”

微球的产生是悬浮液测定信号变异的关键来源。在多重悬浮免疫分析中，10%至32%的测量变异性可能归因于微球直径的变化。可以通过修改制造工艺来改善分析的不精确性，以提供更严格的批次质量控制(图2B) (29).

多路校准

定量测试优于定性测试，因为前者提供了更多关于调节蛋白质浓度以应对疾病进展和治疗干预的信息。定量免疫分析的准确性取决于适当校准品和校准方法的开发和验证。校准材料，包括优质、纯化的天然和重组蛋白质，为将信号响应与蛋白质浓度联系起来提供了基础。可通过多因素分析确定体外高通量生产可溶性蛋白的最佳条件(30). 包括分类因子和连续因子组合的全因子实验允许测试多种条件。多元回归分析确定了影响可溶性蛋白表达的重要因素，额外的统计技术优化了这些表达条件(30). 然后使用最佳条件高通量生产可溶性蛋白质，用于校准平面和悬浮分析。

校准方法也需要仔细考虑。通常，校准曲线由一系列已知的蛋白质浓度组成，这些蛋白质浓度与分析信号相对应，并且曲线上拟合了一个数学表达式。通常使用具有4个或5个参数的非线性回归模型(31). 在多个微量滴定板上应用相同的校准曲线是困难的；因此，每个平板都增加了校准标准，减少了样品检测空间，增加了检测成本。校准曲线信号也容易受到批次间随机变化的影响，这是一个可能导致显著测量变化的因素。

交叉反应性

与复合蛋白免疫分析开发相关的问题包括消除试剂之间的分析干扰和分析灵敏度的配置，以为目标样本基质中的每个复合蛋白提供可接受的动态范围(2). 检测抗体与固定化捕获配体和非特异性分析物之间的交叉反应限制了可用于给定复合物的蛋白质数量。一些蛋白质组合是不可能的，因为非特异性结合可能产生较大的背景信号，从而降低分析灵敏度。例如，与单链ELISA相比，11链平面分析的灵敏度降低了1.7–5.0倍，因为在复合格式中有更高的背景信号(2). 抗体交叉反应可能会将平面形式的蛋白质测量限制在30–50个蛋白质(32). 理论上，悬浮液分析更容易发生蛋白质之间的交叉反应，因为当小球在液体中循环时，可能会发生交联，这可能会限制复合能力(1).

抗体相关分析干扰可以通过三个实验来评估，这三个实验测量当（1）单个蛋白与完全检测抗体鸡尾酒孵育时产生的信号；（2） 完整的蛋白混合物与单个检测抗体孵育；（3）去除1个抗体的抗体鸡尾酒与完整的蛋白质混合物孵育，以检测检测抗体与特定蛋白质之间的交叉反应性(33).

分析稀释剂也是干扰源。稀释剂和分析缓冲液必须在普通分析条件下与复合物中包含的所有试剂和蛋白质有效相互作用。这是一个挑战，因为蛋白质需要特定的调节来维持构象；电荷、疏水性和翻译后修饰的差异可能会改变要求。缓冲液pH值和离子强度的微小变化可能会不可逆转地调节结构，损害分析性能。例如，对市售稀释剂的比较表明，在19-丛悬浮液分析中，稀释剂选择显著抑制了信号强度和分析灵敏度(34).

在多重分析开发期间，必须配置最佳温度、培养时间和试剂浓度。应用多因素设计优化分析参数，可以快速开发出分析间和分析内不确定度<20%的稳健分析(35). 基本筛选设计可能包括多个级别的变量，例如捕获和检测抗体和报告分子的浓度，以及孵育时间和温度。此外，成分分析的动态范围必须兼容，以便可以使用单一样品稀释液测量所有蛋白质。尽管样品可以在多次稀释时进行测量，但这样做会导致更高的分析成本。除了调节样品稀释度外，还可以调节测量装置的响应。例如，在Luminex平台上，调整光电倍增管设置可以调节分析校准曲线的动态范围和灵敏度；增加电压可以提高灵敏度，但由于饱和，上端的恢复率较低(11).

分析验证

多重免疫分析性能的分析验证应在临床验证之前进行。建议的分析性能标准包括线性范围、分析特异性、回收率、检测和定量限、合理的不精确性以及与质量参考方法的比较(36).

使用相同样品的多个副本估算的CV描述了测量变化。理想情况下，批内和批间的不精确性相似，因此在批次之间的测量中不会引入额外的变化。免疫分析具有内在的分析内变异性，因此对相同样品的重复分析会产生结果分布。通过改进分析或运行复制样本并平均值，可以降低这些影响。在使用平面复数的较小研究中，分析内不精确性范围为4.2%至67.0%，分析间不精确性为9.4%至56.0%(37–41). 然而，大规模研究中平面复合蛋白阵列的可靠性和一致性尚不清楚，一般而言，复合免疫分析的允许不精确程度尚未确定。特别是，在不影响分析间不精确性的情况下分析许多样品的能力尚未得到充分记录。在研究设计和分析阶段（下文讨论），可以在一定程度上控制分析间的变异性。初步研究可能有助于确定测定的可靠性和有效性。我们通过拟合每个分析物的线性模型来评估组间变异的来源，该模型包括年龄、性别、种族的固定效应，以及生产数据的标称变量“板”：24.4%的分析物总变异性由分析性能的板对板差异解释(28). 这些结果凸显了美国食品和药物管理局（FDA）制定正式绩效指南的必要性。⁴

观测到的信号强度测量值不仅包含测量噪声，还包含其他类型的系统变化。在统计分析之前进行充分的数据转换、标准化和标准化对于有效结果至关重要，然而，在缺乏记录的数据质量保证程序的情况下，通常会报告蛋白质多重数据的分析。已经描述了各种分析技术，以尽量减少分析内和分析间不精确性的影响。例如，可以评估患者样本中的实验室漂移并将其用作质量控制参数，可以使用平均比值或回归校准重新校准分析(42). 将测量的响应重新调整为恒定水平也可能使分析结果正常化(43,44). 或者，线性混合模型可以评估质量，最小化随机噪声，并通过估计方差分量消除系统测量误差。该方法用于量化系统偏差的大小（分析师、日和实验），并提取针对这些影响进行调整的数据(45). 值得注意的是，这些策略尚未得到验证，数据调整不应取代稳健的多重分析的发展。

操作控制

蛋白质免疫分析复合物的临床实施需要适当的统计方法来指导分析验证、质量控制和分析。虽然再现性和可靠性对诊断分析至关重要，但QC算法还没有很好地开发用于复合蛋白免疫分析(36). 大多数临床实验室都实施了单分析质量控制协议(46). 分析方法的不精确性（随机误差）的特点是重复测量对照材料，这些数据用于计算对照材料的参考范围。通过分析已知低、中、高蛋白浓度的材料，对单链免疫分析的分析性能进行常规监测。将观察结果与对照参考范围进行比较，如果观察结果超出参考范围，则表明分析性能不合格，数据被拒绝。随着阵列上单个反应的数量增加，质量控制的考虑因素也随之增加，并且产生具有适当浓度的每个组成蛋白质的对照材料是蛋白质复合物临床应用的一大挑战(36). 控制材料必须大量生产，以在类似于测试样品的基质中提供持续的蛋白质来源，且从小份到小份或从批次到批次的浓度变化最小。控制蛋白和高浓度蛋白质溶解度的明确混合物可能会对多重分析产生问题(47). 这些问题正受到国家标准与技术研究所等机构的关注，这些机构为临床应用生产和分发标准参考材料(48).

即使克服了材料开发中的障碍，设计解释多重质量控制数据的规则和确定分析结果的可接受性也面临着重大挑战(49).当所有结果都在所有分析物的分析物特定参考范围内时，QC没有问题。然而，QC失败的几率随着在多重分析中进行的单个反应数量的增加而增加，并且当1种或多种组成蛋白的测量超出限制时，尚不清楚如何进行。一种选择是拒绝所有成分分析物的测试结果，并在额外的复合板上重新分析对照物和样品。另一种方法是选择性地接受通过每一级QC的组成蛋白质的数据(49). 该操作取决于是整体考虑多重数据，还是单独考虑每个成分分析。前者的一个例子是在Luminex BioPlex 2200分析仪上进行抗核抗体测试的FDA清除的BioPle悬浮液分析，该分析仪包括两种对照材料，其中每种材料含有正常和异常数量的13种蛋白质。结果仅报告通过质量控制规范的蛋白质；由于医疗决策支持软件需要每个测试的数据，因此如果任何1个分析物未通过QC，则不提供输出(50). 对于后者，重新测试策略尚不明确。一种选择是开发单链或更小的多重分析小组，其中包括可用于重新测试未通过质量控制的运行的分析子集，但较小小组的分析性能可能与原始的较大小组有显著差异，验证独特蛋白质组合的工作量和成本将是巨大的。在临床实验室常规使用蛋白质复合阵列之前，必须解决这些质量控制问题。

临床效用

尽管近年来研究市场引入了数百种复合蛋白免疫分析方法，但FDA只批准了有限的一部分用于临床，这一观察结果说明了构建稳健阵列的复杂性。FDA清除的平面蛋白复合阵列主要由用于点对点评估的侧向流免疫分析组成(51). 例如，分类^®心脏轮廓仪^®4-plex测量肌钙蛋白I、肌酸激酶MB、肌红蛋白和脑钠肽（BNP），以帮助使用便携式侧流平台评估胸痛。目前，悬浮免疫分析是FDA清除的多重蛋白检测的主流技术，特别是在临床实验室检测过敏或自身免疫或感染性疾病患者血清中的抗体(15).

结论

多重免疫分析，无论是平面免疫分析还是悬浮免疫分析，都有可能提供具有诊断和预后价值的数据。多标记策略可以提高医学诊断和预后信息；因此，正在开发用于癌症、中风、糖尿病和心血管疾病的其他蛋白质微阵列。由于技术和发展挑战，这些分析在临床环境中的实施已经滞后。虽然多重蛋白免疫分析能够测量多种分析物，但在体外诊断市场广泛应用多重阵列之前，必须解决分析和质量控制问题。临床应用必须遵循全球公认的校准标准、性能标准和质量控制程序的建立。

致谢

脚注

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