冠心病的全基因组关联分析

摘要

C类冠状动脉疾病及其临床意义心肌梗死是世界范围内导致死亡和残疾的主要并发症。¹生活方式和环境因素在其发展中起着重要作用。²此外，这些复杂的疾病在家庭中聚集，这表明有一个重要的遗传原因。^三尽管对许多基因进行了广泛的探索，但仍有强有力的证据表明分子遗传与冠状动脉疾病或心肌梗死有关。

最近发展的高密度基因分型阵列为与常见疾病相关的变异的全基因组评估提供了前所未有的解决方案。⁴Wellcome Trust Case Control Consortium（WTCCC）最近利用基因芯片人类图谱500K阵列集（Affymetrix），同时对大约500000个基因变体进行了分类，并报告了对大约2000人（以及一组共享的3000个对照组）的数据进行的分析，这些数据分别针对七种复杂疾病，包括冠心病。⁵一些基因座显示出与冠状动脉疾病有很强的相关性，但大量的统计检验给区分真假相关性带来了挑战。通过对WTCCC数据进行详细分析，并结合另一项大型全基因组关联研究——德国心肌梗死家族研究的数据，我们寻找了基因位点与冠心病和心肌梗死风险相关的可靠证据。

方法

结果

初步分析

根据染色体，WTCCC研究中SNP与冠状动脉疾病和德国研究中MI相关的P值分布如图所示图1在WTCCC研究中，396个SNP与冠状动脉疾病显著相关（P<0.001）。其中30个SNP在9个染色体区域聚集，符合FPRP小于0.5的预定义标准(表1在中补充附录). 我们在德国研究中测试了这九个基因座与心肌梗死的显著相关性。其中三个位点——染色体9p21.3、6q25.1和2q36.3——具有这种关联，即使在对九个位点的多次测试进行调整后也是如此(表2)。

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图1

全基因组关联分析中显示单核苷酸多态性（SNP）与冠心病或心肌梗死关联的信号强度图

根据双侧Cochran-Armitage趋势检验，−log P值表示每个SNP与冠状动脉疾病或心肌梗死的相关性。只有质量足够的SNP（参见补充附录)如图所示。在每项研究中，由两名独立评审员目视检查具有显著相关性（P<0.001）的所有SNP的信号强度图，以排除因基因型错误而可能出现的虚假结果（参见补充附录). 在x轴上显示的每条染色体内，数据从第三端绘制。WTCCC研究（A组）中关联的y轴量表与德国MI家族研究（B组）中的量表不同。

表2

WTCCC研究中的基因座与德国MI家族研究中重复的冠状动脉疾病有显著相关性^*

染色体	领导SNP	对照组中的次要等位基因	风险通道	数据	次要等位基因频率		风险等位基因的比值比（95%CI）	人口归因分数	P值
					病例受试者	控制
2	2943634卢比	一个	C类	WTCCC公司	0.30	0.34	1.22 (1.11-1.33)		1.19×10−5
				德国的	0.32	0.37	1.20 (1.06-1.35)		0.004
				调整后的德语			1.08 (0.90-1.31)	0.10	0.03
6	6922269卢比	一个	一个	WTCCC公司	0.29	0.25	1.23 (1.13-1.35)		6.33×10−6
				德国的	0.30	0.26	1.24 (1.09-1.41)		0.001
				调整后的德语			1.23 (1.01-1.50)	0.11	0.009
9	1333049卢比	C类	C类	WTCCC公司	0.55	0.47	1.37 (1.26-1.48)		1.80×10−14
				德国的	0.54	0.48	1.33 (1.18-1.51)		6.80×10−6
				调整后的德语			1.28 (1.07-1.53)	0.22	6.12×10−5

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^*对于每个SNP，WTCCC和德国数据中给出的优势比（95%置信区间）和P值表示与每个风险等位基因拷贝相关的冠心病风险，并基于Cochran-Armitage趋势检验，不调整协变量。调整后的德国数据的优势比和人口归因分数基于多元分析，包括所有三个主要SNP，并对年龄、性别、年龄和性别之间的相互作用、PROCAM研究分数和Framingham风险分数进行了调整。经调整的德国数据的P值经多次测试（即共九个位点与冠状动脉疾病相关的测试）校正，但未经协变量调整。SNP的位置及其位点的详细信息如所示图2和中图1A和1B在中补充附录表中给出了关于SNP的更多详细信息，包括两项研究中的基因型频率​表11和​和3三在中补充附录.

染色体9p21.3上的位点在WTCCC和德国研究中均显示出最强的信号（P=1.80×10⁻¹⁴P=3.40×10⁻⁶）(图1和表2). 该基因座rs1333049的单核苷酸多态性铅与冠心病的联合P值为2.91×10⁻¹⁹每拷贝C等位基因的风险增加36%（95%置信区间[CI]，27至46）。大约22%的研究参与者是该等位基因的纯合子，另有50%携带单一拷贝。在WTCCC和德国的研究中，在9p21.3上约100 kb的区域内发现了与影响方向和大小相关的类似模式(图2). 在该区域内显示关联的19个SNP处于强烈的连锁不平衡状态。然而，可以区分两个区块，每个区块内的联动不平衡性较强（平均D'>0.90），区块间的联动不均衡性中等（平均D''，约0.60）(图2). 区块1中的三个SNP（rs7044859、rs1292136和rs7865618）和区块2中的一个SNPs（rs1333049）足以标记该区域。单倍型分析表明，这种关联主要是由于四个SNP的两个相互排斥的单倍型（TTGG和ACAC）(补充附录). 在WTCCC研究中，与TTGG单倍型（频率，对照组0.333，病例组0.271）相比，ACAC单倍型冠心病的比值比（频率，控制组0.324，病例组0.386）为每拷贝单倍型1.48（95%可信区间，1.34-1.64）（P=2.1×10⁻¹⁴). 德国研究中的单倍型分析结果相似(补充附录)。

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图2

9号染色体上冠心病的关联信号

根据9号染色体上的位置，使用双侧Cochran–Armitage检验计算出的−log P值如图（I）所示。箭头表示领先SNP。插入图显示了与WTCCC和德国9号染色体研究中的SNP小等位基因相关的冠心病优势比之间的相关性。还显示了基因或表达序列标签（EST）的基因组位置（根据国家生物技术信息中心[NCBI]的参考序列收集）（II）。所有数据均来自加州大学圣克鲁斯分校的基因组浏览器（NCBI构建35）。红色方框表示重组热点，根据HapMap数据估算（第二阶段，第21版）（III）。WTCCC研究中冠心病患者SNP基因分型的不平衡系数值，使用Haploview软件生成（IV）。有两个明显的SNP区块（1和2）具有显著相关性。使用Haploview软件生成的9号染色体HapMap CEU数据（来自北欧和西欧血统的人）中所有SNP的不平衡系数如图（V）所示。在IV和V中，SNP之间的连锁不平衡强度从白色增加到蓝色再到红色（白色：不平衡系数<1，LOD分数<2；蓝色：不平衡指数=1，LOD得分<2；粉红色或淡红色：不平衡因数<1，LOD分数≥2；亮红色：不均衡系数=1，LOD得分≥2）。与II、III和IV相关的参考文献见补充附录.

染色体6q25.1上的领先SNP（rs6922269，组合P值为2.90×10⁻⁸亚甲基四氢叶酸脱氢酶（NADP+依赖性）1样蛋白基因(MTHFD1L公司). 该区域的所有阳性SNP均位于基因中部的内含子中(图1A在中补充附录). rs6922269的风险等位基因（A）的流行率约为25%，每拷贝风险增加23%（95%可信区间，15至33）。单倍型分析表明，只有携带A等位基因的两个单倍型在病例受试者中比在对照组中更常见，这证实了在单基因座分析中，A等位蛋白与冠心病的比值比增加(补充附录)。

第三个重复位点位于染色体2q36.3上（rs2943634，组合P值为1.61×10⁻⁷包含233kb的区域(图1B在中补充附录). 该区域内只有一个假基因（ENSG00000197218）。rs2943634的风险等位基因（C）的流行率约为65%，每拷贝风险增加21%（95%可信区间，13-30）。单倍型分析表明，在rs2943634附近的连锁不平衡区中观察到的其他关联是由于与其连锁不平衡所致(补充附录)。

德国研究中，染色体9p21.3和6q25.1上的基因座与心肌梗死的相关性不受心血管危险因素和评分调整的影响。相反，调整后染色体2q36.3位点心肌梗死的比值比降低(表2). 进一步分析表明，该位点还与体重指数（加性模型中P=0.004）、高血压的存在与否（P=0.04）以及低密度脂蛋白胆固醇水平（P=0.03）显著相关。德国研究中三个基因座的完全调整的群体归因分数如下所示表2三个位点的组合分数为0.38（95%CI，0.13至0.55）。通过将这三个位点的预测信息添加到模型中，基于Framingham风险评分和PROCAM研究评分的心肌梗死预测显著提高（偏差，191.48；P<1×10⁻¹⁰)。

对于WTCCC研究中FPRP小于0.5的六个基因座，德国研究中没有复制其关联，两项研究的结果分别如表2在中补充附录这些基因座的复制能力在43%到80%之间。

讨论

我们联合分析了两项不同但互补的冠状动脉疾病和心肌梗死全基因组关联研究的数据，这两项研究以类似的方式进行了确定，并涉及相同的基因分型平台。对这两个数据集进行的顺序和组合分析使我们能够识别几个新的基因位点，这些基因位点的个体和整体对冠心病的风险有很大影响。

第9p21.3号染色体与冠状动脉疾病的相关性是WTCCC研究中发现的最强的。⁵德国研究发现，该基因座也与心肌梗死密切相关，这有力地证明了该基因与冠状动脉疾病有关。相关性证据很强，风险变异体很常见，而等位基因的每一个拷贝都大大增加了患病的可能性。这些发现明确地证明了该位点存在一个主要的遗传风险变体。

事实上，在修订这份手稿的过程中，另外两项全基因组研究报告了同一9p21.3基因座与冠状动脉疾病和心肌梗死之间的强烈关联，^13,14使其成为迄今为止发现的冠状动脉疾病复制率最高的基因座。该区域包含两个细胞周期素依赖性激酶抑制剂的基因编码序列，CDKN2A型（编码原型INK4蛋白p16INK4a）和CDKN2B型（编码p15INK4b），在细胞周期的调节中起重要作用，可能通过其在TGF中的作用而被牵连-β-诱导生长抑制，在动脉粥样硬化的发病机制中。^15-17尽管有一个或两个CDKN2型基因可能解释与冠状动脉疾病的关系，其他解释也需要考虑，包括甲基硫腺苷磷酸化酶的参与(MTAP公司)基因或位于该区域的其他表达序列。同一区域最近也与2型糖尿病易感性增加有关，^18-20提高共同而非单一机制导致冠心病和糖尿病的可能性。

染色体6q25.1与冠状动脉疾病的关联映射到MTHFD1L公司编码C1-四氢叶酸（THF）合成酶线粒体同工酶的基因。^21,22C1-THF合成酶家族用于各种细胞过程，特别是嘌呤和甲硫氨酸的合成。²¹因此，MTHFD1L公司活性也可能影响血浆同型半胱氨酸水平，^21,23提高两者之间联系的可能性MTHFD1L公司变异和冠心病的危险因素。²⁴AtheroGene研究1070人数据的初步分析²⁵尚未揭示rs6922269基因型与血浆同型半胱氨酸水平之间的关联（Tiret L，Blankenberg S：个人沟通）。然而，需要在更广泛的学科中进行进一步研究，以调查这种可能性。

我们的研究结果证明了全基因组方法的主要优势，即有可能发现迄今为止尚未发现的增加复杂疾病易感性的基因座。然而，新发现的关联背后的机制往往并不明显。事实上，染色体9p21.3、6q25.1和2q36.3上的信号与冠状动脉疾病的关联机制都需要阐明。同样，在综合分析中确定的染色体位点之前都没有与冠状动脉疾病密切相关。然而，一些基因座中的基因(PSRC1型第13.3页，MIA3型第1季度41，以及座椅模块组件315q22.33）在细胞生长或抑制中起作用。^26-29这些过程对于动脉粥样硬化斑块的形成和发展以及斑块不稳定性都是至关重要的。³⁰我们的研究结果表明，这些过程的基因调控在冠状动脉疾病和心肌梗死的发展中起着重要作用。

我们试图复制的WTCCC研究中的一些基因座在德国研究中没有显示相关性。这些负面数据强调了需要谨慎查看全基因组关联，尽管它们具有统计强度，直到它们在适当的验证样本中被复制。在这种情况下，还应注意我们的综合分析中确定的四个位点。³¹

我们的主要目标是独立于任何生物学假设，确定与冠状动脉疾病显著相关的基因座。尽管如此，基因分型平台也提供了一个机会来检查与先前报告的关联基因中的遗传变异。事实上，在我们的一项研究中，有几项研究表明了这种关联。然而，在这两项研究中，只有脂蛋白脂肪酶基因中的SNPs有关联的证据。这一发现与最新的系统研究一致，这些研究在复制候选基因的初始发现方面基本上是失败的。³²然而，许多先前研究的基因变体在基因芯片阵列上标记不佳，这显然无法涵盖这些基因中甚至常见变异的全部范围。

我们的发现能否转化为更好地预防或治疗冠状动脉疾病，只有随着时间的推移和进一步的研究才能清楚。尽管每个基因座的比值比适中，正如多基因疾病的预期一样，对这三个验证基因座的群体归因分数的估计无论是单独还是总体上都是相当可观的。这一观察为改善整体冠状动脉风险预测提供了潜力。然而，这两项研究中的受试者都有很强的早发冠心病家族史，这可能增强了检测与冠状动脉疾病相关性的能力，但也可能增加了估计的人群归因风险，超过了散发病例的风险，有必要在更广泛的学科中进一步分析这些位点。还需要进一步研究这些基因座与其他类型动脉粥样硬化疾病以及心血管危险因素和标记物的相关性。在遗传水平上，研究应侧重于相关区域的精细定位和候选基因的彻底调查。我们的结果为所有这些额外的研究提供了一个框架。

我们的分析有几个重要的局限性。尽管基因芯片阵列类型超过500000个变体，但由于补充附录此外，为了减少多重检验的影响，我们只使用了相当保守的Cochran–Armitage趋势检验（一种加性模型）来筛选WTCCC数据的显著相关性。这些局限性使一些基因座可能被遗漏，进一步分析数据和随后的验证将揭示其他基因座。

尽管如此，通过使用来自两项全基因组关联研究的信息的初始复制和随后组合的顺序策略，我们能够描述一些新的冠心病和心肌梗死基因座，这些基因座对这些疾病的风险有相当大的影响，值得深入的随访研究。最重要的是，在两项独立的研究中发现单个基因座是最强的信号，这为我们了解冠心病遗传学的临床相关进展带来了希望。随着当前复杂性状全基因组关联研究活动的加速，我们的方法也可能提供一种范式，用于合并此类研究的结果，以最大限度地从这些昂贵而费力的实验中提取有价值的信息。

补充材料

致谢

脚注

参考文献