生物化学杂志。作者手稿；PMC 2006年5月4日提供。
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人类线粒体C1-四氢叶酸合成酶：基因结构、mRNA的组织分布及在CHO细胞中的免疫定位*
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Priya Prasannan公司
‡德克萨斯州奥斯汀市德克萨斯大学细胞和分子生物学研究所化学与生物化学系，邮编78712
斯凯勒派克
‡德克萨斯州奥斯汀市德克萨斯大学细胞和分子生物学研究所化学与生物化学系，邮编78712
Kun Peng先生
§来自加利福尼亚大学伯克利分校营养科学系，邮编：94720
巴里·谢恩
§来自加利福尼亚大学伯克利分校营养科学系，邮编：94720
院长R.Appling
‡德克萨斯州奥斯汀市德克萨斯大学细胞和分子生物学研究所化学与生物化学系，邮编78712
‡德克萨斯州奥斯汀市德克萨斯大学细胞和分子生物学研究所化学与生物化学系，邮编78712
§来自加利福尼亚大学伯克利分校营养科学系，邮编：94720
#贡献均等。
**通讯作者：德克萨斯大学奥斯汀分校化学与生物化学系，德克萨斯州奥斯汀A5300大学站1号，邮编78712-0165；小提琴演奏家liam@gnilppad; 512-471-5842; 传真：512-471-5849 ¶这些作者为这项工作做出了同等贡献。
摘要
C类1-四氢叶酸合成酶（THF）是真核生物中发现的一种三功能酶，具有10-甲酰-THF合成酶、5,10-甲苯基-THF环水解酶和5,10--亚甲基-THF脱氢酶的活性。C的细胞质同工酶1-THF合成酶在包括人类在内的许多哺乳动物中都有很好的特征，但以前只在酵母中鉴定出线粒体同工酶酵母菌属在这里，我们报告了编码功能线粒体C的人类基因的鉴定和特征1-THF合成酶。该基因在6号染色体上跨越236 kbp，由28个外显子和一个可选外显子组成。该基因编码978个氨基酸的蛋白质，包括一个N端线粒体靶向序列。线粒体同工酶与人类细胞质同工酶的同源性为61%。在大多数人类组织中检测到该基因的表达，但在胎盘、胸腺和大脑中的转录物最高。检测到两个mRNA，一个3.6 kb的转录本和一个1.1 kb的抄本，两个转录本在每个组织中的比率不同。较短的转录物由另一种剪接事件产生，其中外显子7剪接到外显子8a而不是外显子8。外显子8a来源于铝序列，与长转录物的第8外显子没有同源性，仅编码15个氨基酸，随后是终止密码子和多聚腺苷酸化信号。这种短转录物可能编码一种缺乏10-甲酰-THF合成酶活性的双功能酶。这两个转录物都在相同的5′位点启动，即ATG起始密码子上游的107个核苷酸。融合到C末端V5表位标签的全长（2934 bp）cDNA在CHO细胞中表达。亚分馏细胞的免疫印迹显示，仅在这些细胞的线粒体部分存在一个107 kD的蛋白质，证实了该蛋白质的线粒体定位。表达全长人类cDNA的酵母细胞表现出较高的10-甲酰-THF合成酶活性，证实其为人类线粒体C1-THF合成酶。
关键词：线粒体、叶酸、单碳代谢
介绍
C类1-四氢叶酸（THF1)合成酶是真核生物中发现的一种三功能酶，含有10-甲酰-THF合成酶（酶代码EC6.3.4.3）、5,10-甲苯基-THF环水解酶（酶号EC3.5.4.9）和5,10--亚甲基-THF脱氢酶（酶码EC1.5.1.5）的活性(，反应1-3）。这些活性以及丝氨酸羟甲基转移酶(，反应4），是叶酸的生物活性形式THF所携带的单碳单元相互转化的核心。活性单碳单元用于多种细胞过程，包括从头开始嘌呤和胸苷酸合成，丝氨酸和甘氨酸相互转化，蛋氨酸生物合成，线粒体和叶绿体中的蛋白质合成。
真核生物叶酸介导的单碳代谢的分区。C分别催化反应1、2和3，10-甲酰基-THF合成酶（EC 6.3.4.3）、5,10-甲苯基-THF环水解酶（EC 3.5.4.9）和5,10--亚甲基-THF脱氢酶（EC 1.5.1.5）1-四氢叶酸合成酶。其他反应由4，丝氨酸羟基甲基转移酶（酶代码EC2.1.2.1）催化；5，甘氨酸裂解系统（酶代码EC2.1.2.10）；6，亚甲基四氢叶酸还原酶（EC 1.5.1.20）；7，蛋氨酸合酶（酶代码EC2.1.1.13）；8，蛋氨酸-tRNA甲酰转移酶（酶代码EC2.1.2.9）；9，亚甲基四氢叶酸合成酶（酶代码EC6.3.3.2）。并非所有反应都显示了所有辅酶。
在真核细胞中，线粒体和细胞溶质隔室都含有一组平行的单碳单位相互转化酶(1). 例如，在酵母中酿酒酵母C的线粒体和细胞质同工酶1-THF合成酶（由核基因编码MIS1号机组和ADE3型）已被纯化和表征(2,三). 这两种同工酶都以100kDa亚基的同源二聚体的形式存在。每个亚单位由约70kDa的C末端10-甲酰-THF合成酶结构域和约30kDa通过蛋白水解敏感连接区连接的N末端双功能脱氢酶/环水解酶结构域组成。哺乳动物和鸟类来源的细胞质同工酶共享该亚基的大小和结构域(4-9).
C的所有三项活动1-哺乳动物线粒体中也发现THF合成酶(10,11). 我们对完整的大鼠肝线粒体和线粒体提取物的研究表明，这些细胞器能够通过叶酸依赖性途径将丝氨酸的碳3氧化为甲酸(，反应1-4）(11). 然而，C的折页相互转换活动的存在、结构和功能1-哺乳动物线粒体中的THF合成酶一直存在争议。MacKenzie及其同事研究了一种最初从腹水肿瘤细胞中分离的双功能NAD依赖性5,10-亚甲基-THF脱氢酶/5,10-甲苯基-THF环水解酶(12,13). 这种双功能酶缺乏催化10-甲酰-THF合成酶活性的大C末端结构域，因此无法生成甲酸盐。这种酶被证明是一种核编码的线粒体蛋白(14,15)仅在转化的哺乳动物细胞和胚胎或非分化组织中检测到(12). 在成人分化组织中，仅在大鼠肾上腺组织中检测到NAD依赖性5,10-亚甲基-THF脱氢酶活性(16)尽管编码这种酶的mRNA在所有被检测的组织中都处于低水平(17). MacKenzie认为哺乳动物线粒体缺乏C1-THF合成酶，双功能NAD依赖性脱氢酶/环水解酶是线粒体三功能酶的哺乳动物同源物(18,19).
在这里，我们报道了编码功能性线粒体C的人类基因的鉴定和特征1-THF合成酶。我们发现它在成人组织中广泛表达，全长cDNA编码一种在CHO细胞中表达时定位于线粒体的蛋白质。这些数据证实了C的存在1-哺乳动物线粒体中的THF合成酶，完成如.
实验程序
材料-所有化学品都具有最高的商业质量。DIFCO培养基成分来自VWR（宾夕法尼亚州西切斯特）。限制性酶、虾碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶和T4 DNA连接酶购自Gibco-BRL（Rockville，MD）。PCR和测序引物由IDT（Coralville，IA）制作。[α-32P] dATP（3000Ci/mmol）购自NEN生命科学产品公司（马萨诸塞州波士顿）。
全长cDNA的构建-德国基因组计划（RZPD）构建的部分cDNA克隆（DKFZp586G1517）(20)，在GenBank中识别({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AL117452”，“term_id”：“5911902”，“term_text”：“A117452”}}AL117452型)使用人类细胞质C的cDNA序列进行BLAST搜索1-THF合成酶(21). 该cDNA包含390 nt的3′非编码序列和一个poly（a）尾，但缺少起始密码子，表明它在5′端被截断。截短的cDNA克隆从RZPD（德国）获得，其序列由德克萨斯大学奥斯汀分校的DNA分析设施确认。人类基因组数据库包含与该cDNA相对应的整个基因，并预测了额外的5′外显子，该外显子编码60个额外的N末端氨基酸。缺失的5′外显子（外显子1，)PCR扩增自英国桑格中心获得的基因组PAC克隆（dJ44A20）。PCR扩增产物使用Qiagen凝胶提取试剂盒进行凝胶纯化，亚克隆到pGEM-T Easy载体（Madison WI，Promega）中，并验证其序列。必须使用MasterAmp飞行高度层由于外显子1的高G+C含量，PCR反应中的DNA聚合酶（Epicenter，Madison，WI）（见结果）。然后将部分cDNA克隆和外显子1克隆用作拼接重叠延伸PCR（SOE-PCR）的模板(22)以产生全长cDNA。外显子1片段（230 bp）用飞行高度层聚合酶和引物TOPO5′（5′CACC自动变速箱GGCACGCGTCTGCCGCTC3′；ATG起始密码子下划线）和humitoSOE3′（5′CTTCTCTGACGATGGAGTCCG3′）。使用PCR扩增2719 bp的cDNA片段Pfu公司聚合酶和引物GS5′SOE（5′GGGACTCCATCGTCAGAGAGA3′）和TOPO3′（5′GAACAAGCTTAACTTGTTGTTCC3′）。TOPO3′与ORF终止密码子之前的最后9个密码子互补。使用Qiagen凝胶提取试剂盒对两种产品进行凝胶纯化。使用引物TOPO5′和TOPO3′以及飞行高度层聚合酶。对全长cDNA产物（2934 bp）进行凝胶纯化，并按照制造商的说明使用定向TOPO克隆将其克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1D/V5-His-TOPO（Invitrogen）中。TOPO克隆反应转化为One-Shot化学活性大肠杆菌（Invitrogen），并在含有50μg/ml氨苄青霉素的YT（0.8%胰蛋白酶，0.5%酵母提取物，0.5%NaCl）板上选择阳性菌落。用载体引物和基因特异性引物对菌落进行PCR筛选，并用Qiagen微型质粒制备试剂盒制备阳性质粒。序列分析显示，与原始cDNA和基因组序列相比，全长克隆中存在碱基替换，推测这些序列是在PCR反应中合并的。(飞行高度层聚合酶是由于外显子1的GC含量高而选择的，它缺少3′→5′校对活动）。使用Stratagene的Quick Change Site Directed Mutagenise试剂盒修复此替换。修复后的全长cDNA克隆pcDNA3.1-humito被完全测序，并确认了正确的序列（GenBank Accession#{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AY374130”，“term_id”：“34811725”，“term_text”：“A374130”}}AY374130年).
人类线粒体C的内含子/外显子结构1-THF合成酶基因.外显子显示为编号的黑色条；插入子为细水平线。外显子和内含子的大小和位置大致按比例绘制，但内含子26除外，其长度为55350 bp。整个基因跨度为236 kbp。表二列出了每个外显子和内含子的实际大小。
CHO细胞转染--1.5 x 105将CHO细胞接种在直径为35mm的培养皿上，并在添加10%（v/v）胎牛血清的α-MEM中培养。然后通过Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）方法，将每个板转染2μg pcDNA/humito。转染后，细胞在常规培养基中额外培养48小时，然后应用含有G418的选择性培养基（0.8 mg/ml）。使用选择性培养基约一周，直到形成抗抗生素菌落。挑选、重新镀膜、培养和收集抗性菌落。
细胞匀浆和亚细胞组分的制备--转染细胞培养在两个150 cm2T形烧瓶，产量1-2 X 108细胞。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）（4 X 5 ml，4°C）冲洗单层，然后在室温下用含有10 mM EDTA（10 ml）的PBS培养，直到细胞分离（5-10分钟）。轻轻敲击烧瓶以取出细胞，然后将细胞转移到50毫升的塑料锥形管中。通过300倍离心将细胞制成颗粒克在室温下保持5 min，用15 ml均质溶液（HMS，250 mM蔗糖，1 mM EDTA，pH 6.9）在4℃下清洗细胞颗粒。将细胞颗粒重新悬浮在HMS（2 ml，4°C）中，并转移到氮气空化装置（Kontes）中，在4°C下暴露于36 psi的压力下30分钟。将破碎细胞的悬浮液收集到一个3ml锥形磨砂玻璃双组织研磨机中，并用均质器的四个冲程进一步破碎(23).
通过离心（900倍）沉淀细胞核和未破碎细胞克，6分钟）。小心取出上清液，转移到另一个离心管中，并将其储存在冰上。将颗粒重新悬浮在HMS（1 ml）中，并在研磨机中通过四次冲程进一步分散。离心后（900倍克，6min），将上清液与第一个上清液结合并保存在冰上。将沉淀洗涤（3×1ml HMS），并将最终的粘性沉淀（核级分）重悬于HMS（1ml）中。将合并的上清液离心（900 x克，5分钟），并丢弃任何颗粒。通过添加HMS，上清液的体积[核后上清液（PNS）总分数]增加至5 ml。
将PNS离心（10000倍克，15分钟），然后将颗粒储存在冰上。将上清液重新离心（10000倍克，15分钟）得到最终上清液（细胞溶质部分）。将第二个颗粒与第一个颗粒结合，用HMS（2 ml）洗涤，然后再悬浮在HMS（1 ml）中，得到线粒体部分。谷氨酸脱氢酶活性(24)作为线粒体标记物，乳酸脱氢酶活性(25)用作细胞质标记。
免疫印迹法--细胞溶质和线粒体组分的蛋白质浓度使用Bradford分析测定(26)以牛血清白蛋白为标准。将来自转染和未转染CHO细胞的80μg细胞溶质和线粒体蛋白在7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上在180 V下分离50分钟。一半凝胶被染色，另一半的蛋白质转移到硝化纤维膜上（密苏里州山谷公园中西部科学）在250毫安的电流下进行90分钟的电泳。然后用蒸馏水对膜进行3次洗涤，每次洗涤5分钟，并在室温下用Tris缓冲盐水（TBS）（10 mM Tris碱，0.15 M NaCl，pH 8.0）中的2%干乳封闭1小时。然后将封闭的膜与一级抗体（小鼠抗V5抗体；1:1000稀释；Invitrogen）在室温下用1%干牛奶稀释在TBS中培养1小时。然后用TBST（10 mM Tris碱，0.15 M NaCl，0.0025%吐温-20，pH 8.0）分别清洗膜3 X 5分钟，并在室温下用二级抗体（山羊抗鼠抗体；1:2000稀释；佐米德，加利福尼亚州旧金山）培养1小时。最后用TBST和TBS 2X分别对膜进行5分钟的清洗，并在观察带之前用水冲洗。使用增强化学发光（ECL；Amersham Pharmacia Biotech）检测显示反应带。
酵母和酶分析中的表达-将全长人cDNA从pcDNA3.1-humito亚克隆到酵母表达载体pVT103U的BamH1和XhoI位点(27). 在这个结构中，pVT-humito，整个人类线粒体C1-THF合成酶ORF，包括线粒体前序列，由ADH公司载体的启动子。酵母菌株DAY3(ser1 ura3-52 trp1 leu2 ade3-130) (28)用pVT-humito或空pVT103U载体用醋酸锂法进行转化(29)修改如所述http://www.cm.utexas.edu/appling/YEASTrafo.html细胞在合成的最小培养基中生长，提取液制备并检测NAD+-和NADP+-所述的依赖性亚甲基四氢叶酸脱氢酶活性(30). 根据Kirksey和Appling测定10-甲酰-THF合成酶活性(31).
Northern分析-FirstChoice Northern Human Blot I试剂盒取自Ambion（德克萨斯州奥斯汀），其poly（A）+mRNA取自以下成人人体组织：大脑、胎盘、骨骼肌、心脏、肾脏、胰腺、肝脏、肺、脾脏和胸腺。使用试剂盒中提供的试剂和[α-32P] dATP符合试剂盒制造商的说明。这两个探针代表假定的线粒体C的5′端和3′端1-THF合成酶cDNA。利用引物GS5′SOE和反义链（GSI）上的引物5′CCGCTCGAGCAAGGCATTGAGGACTGTTGCT3′合成了5′端探针。该304 bp探针覆盖nt+215至+518（ATG起始密码子的A指定为+1）。用5′GATGCAGTCCCTGCTATCA3′引物合成了3′端探针，5′GAACAAGCCTTTAACTTGGTTTC3′引子合成了反义链（TOPO3′）。这个465 bp的探针覆盖了nt+2469到+2933，刚好在终止密码子之前结束。
还合成了一种检测人类细胞质C的探针1-THF合成酶。质粒pUC13/HS230（从麦吉尔大学R.E.MacKenzie获得），在人类细胞质C的3′端附近含有230 bp片段1-THF合成酶cDNA(21)通过SacI消化线性化。按照试剂盒制造商的说明，使用线性PCR扩增方法合成探针。所用的反义引物为5′GTAAAACGACGGCACGT3′，与插入物两侧的载体序列互补。
在42°C下，使用超杂交超敏杂交缓冲液（Ambion）对膜进行1h预杂交。10时添加探针6cpm/ml杂交缓冲液，并允许在42°C下在滚筒瓶中杂交过夜。然后用NorthernMax低浓度洗涤液（Ambion；相当于2XSSC）将膜洗涤两次，每次10分钟，用Northern Max高浓度洗涤液洗涤两次（相当于0.1XSSC），每次30分钟，全部在42°C下进行。然后将膜暴露在储存荧光屏（分子动力学）下48小时，并使用分子动力学445 SI磷光成像仪成像。根据试剂盒制造商的说明，剥离并重组相同的印迹，以便与每个探针杂交。
成绩单映射--使用Ambion的First Choice RLM-RACE试剂盒，通过RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增（RLM-RASE）对转录物的5′端和3′端进行定位。人类胎盘总RNA（Ambion）用于绘制转录物的5′端。设计了针对cDNA的嵌套反义引物，与试剂盒中提供的两个嵌套5′RACE引物一起使用。cDNA特异性内引物（GSI2:5′CGCCTCGAG公司ACGGCTGTTCTCAGGGGACAC3′；XhoI位点下划线）是对5′UTR中nt-9至-30的补充。cDNA特异性外引物（GSO2:5′AGCGCGACAGGCCACACGGGAG3′）与nt+93～+73互补。5′RACE内引物和cDNA特异性内引物的5′端分别有BamH1和Xho1位点，便于克隆。
为了绘制1.1 kb转录物的3′端，使用提供的3′RACE适配器从人类胎盘总RNA合成第一链cDNA。设计了针对该cDNA的嵌套义引物，以便与试剂盒中提供的两个嵌套3′RACE引物一起使用。cDNA特异性内引物（3′RACE GSI:5′CGCCTCGAG公司GAACTTGTTTAGCAACAAAGTCCT3′；XhoI站点下划线）相当于+485到+508。cDNA特异性外引物（3′RACE GSO:5′CGCCTCGAGCTCCCTCCAGATAGCAGTGAA3′）相当于+390到+410。3′RACE内引物和cDNA特异性内引物的5′端分别有BamH1和Xho1位点，便于克隆。
对5′和3′RACE“内部”PCR反应中产生的PCR片段进行凝胶纯化，用BamHI和XhoI消化，并分别连接到BamH1/Xho1消化的pBluescript II KS（+）载体（Stratagene，La Jolla，CA）。将连接反应转化为具有化学活性的XL1蓝细胞（Stratagene），并在YT+氨苄青霉素平板上选择阳性菌落。用T7反向（5′GTAATACGACTATAGAGGC3′）和T3正向（5′AATTAACCCACTAAGGGG 3′）载体引物进行PCR筛选，制备质粒进行序列分析。这个1.1 kb的cDNA有GenBank登录#{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AY374131”，“term_id”：“34811727”，“term_text”：“A374131”}}AY374131年.
结果
cDNA鉴定与克隆–编码ORF的cDNA，与人类细胞质C高度相似1-德国基因组计划（RZPD）（GenBank）从人类子宫RNA中克隆了THF合成酶{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AL117452”，“term_id”：“5911902”，“term_text”：“A117452”}}电话：117452). 同源性延长了蛋白质的长度，表明这编码了另一个三功能C1-THF合成酶(). 该cDNA编码917个氨基酸，加上390 nt个3′非编码序列和一个聚（a）尾，但缺少起始密码子，表明它在5′端被截断。根据人类基因组数据库（NCBI）对该序列进行爆破，发现6号染色体上对应的基因位于6q25.2。该基因全长236 kbp，编码27个外显子的整个cDNA序列，外加一个额外的5′外显子，该外显子编码60个额外的N末端氨基酸。预测的起始密码子位于接近完美的扩展Kozak共识序列中(32). 这个N末端延伸的前半部分具有线粒体先导序列的特征，包括形成带正电荷的两亲性α螺旋的潜力。原始cDNA克隆的截短是由于第一外显子3′端附近存在Not1位点；Not1用于cDNA克隆过程(20). 随后，RIKEN老鼠基因百科全书项目(33)鉴定了一个全长小鼠cDNA（ID:22289），该cDNA预测一种与人类蛋白质具有88%同源性的蛋白质，包括N末端延伸(). 小鼠cDNA缺少导致人类cDNA截断的Not1位点。这些数据表明，人类6号染色体上的基因编码线粒体C1-THF合成酶。
人和小鼠线粒体C的比对1-THF合成酶与人细胞质C1-THF合成酶。黑框表示身份，白框表示三分之二蛋白质中的保守替换或身份。这条路线是由法国国家公路局（INRA）在法国国家赛马场实验室（Laboratoire de Génétique cellulaire）的服务器制作的(http://prodes.toulouse.inra.fr/mulalin/mulalin.html网站)使用MultAlin算法(56)输出由同一站点的ESScript程序生成。人机界面；人线粒体C1-THF合成酶；mmito，小鼠线粒体C1-THF合成酶；hcyto，人细胞质C1-THF合成酶。
RACE利用人类子宫RNA构建全长cDNA的尝试失败，可能是因为第一外显子的G+C含量极高（>80%）。相反，使用基因组PAC克隆（dJ44A20；英国桑格中心）PCR扩增5′外显子。然后通过SOE PCR将其拼接到剩余的cDNA上，构建编码人类蛋白质的全长cDNA（GenBank Accession#{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AY374130”，“term_id”：“34811725”，“term_text”：“A374130”}}第374130天).
CHO细胞的表达和亚细胞定位-为了确定该cDNA编码的蛋白质实际上是否为线粒体，我们在CHO细胞中表达了该cDNA。将全长cDNA克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1D/V5-His-TOPO中。该结构将14-氨基酸V5表位和6-His标记融合到2934 bp编码区的C末端。插入物在哺乳动物细胞中的表达由CMV启动子驱动。将该质粒pcDNA/humito转染到CHO细胞中，筛选并培养G418-耐药菌落。按照实验程序所述，分离转染和未转染（对照）CHO细胞的细胞溶质和线粒体部分。对每个组分进行线粒体标记酶谷氨酸脱氢酶和细胞质标记酶乳酸脱氢酶的分析。线粒体组分中的谷氨酸脱氢酶活性为68-95μmol/min/mg蛋白质，而细胞质组分中为2.4-4μmol/min/mg蛋白质。线粒体部分的乳酸脱氢酶活性仅为细胞质部分的1/7。然后使用V5表位抗体对这些亚细胞组分进行SDS-PAGE和免疫印迹(). 在转染CHO细胞系的线粒体部分（通道2）中检测到约107 kDa的清晰信号，但在细胞质部分（通道1）中未检测到。这种流动性与表位标记结构的预期大小一致（～1000个氨基酸）。在未转染CHO细胞系（3、4区）的任一部分均未发现信号。这些结果证实，该cDNA编码一种蛋白质，该蛋白质仅定位于哺乳动物细胞系中的线粒体。
表位标记的人线粒体C的亚细胞定位1-CHO细胞中表达的THF合成酶考马斯蓝染色SDS-PAGE（左）和免疫印迹（右），来自转染pcDNA3/humito（1、2道）或未转染对照（c）（3、4道）的CHO细胞的细胞质（c）和线粒体（m）部分。每条通道含有80μg总蛋白质。
酵母中的表达-人类线粒体全长C1-THF合成酶cDNA，包括62密码子N末端延伸，被亚克隆到酵母表达载体（pVT103U）中，并转化为ade3（ade3）缺失菌株DAY3。对ADE3型编码细胞质C的基因1-THF合成酶，导致酵母细胞具有非常低的10-甲酰-THF合成酶和5,10-亚甲基-THF脱氢酶活性；残余活性是由于线粒体同工酶(34). 与空载体转化的细胞相比，pVT-humito转化的DAY3细胞过度表达10-甲酰-THF合成酶活性约为9倍（64.6与7.1毫单位/毫克蛋白质）。然而，我们没有发现携带pVT-humito质粒的细胞中5,10-亚甲基-THF脱氢酶活性增加，使用NADP或+或NAD+作为辅因子。C的第三个活动1-THF合成酶，即5,10-甲苯基-THF环水解酶，未进行检测，因为难以准确测量粗提取物中的这种活性。这些结果以及上述线粒体定位数据证实，该cDNA编码一种具有10-甲酰-THF合成酶活性的蛋白质，进一步支持其被鉴定为人类线粒体C1-THF合成酶。
基因结构-编码C的人类基因1-THF合成酶在6号染色体上跨越236 kbp(). 编码序列由28个外显子组成，被长度为89-55350 bp的27个内含子中断。起始密码子出现在第一个外显子中，外显子1的5′端延伸至ATG起始密码子上游107 bp（参见下文的转录图谱）。终止密码子存在于外显子27中，外显子28编码3′UTR的360 nt，包括多聚腺苷酸化信号（AATAAA）。外显子1富含GC（>80%G+C），包含一个CpG岛和一个Not1限制酶位点（GCGGCCGC）。由于在克隆过程中使用了Not1连接子，因此Not1位点的存在阻止了全长cDNA的克隆(20). 所有内含子-外显子剪接位点都遵循GT/AG规则(35)，除了末端外显子（8a和28）之后（表二）。TESS网络服务器对5′侧翼序列的扫描(http://www.cbil.upenn.edu/tesss网站)使用TRANSFAC v4.0数据库预测了许多潜在的转录因子结合位点，包括Sp1、RARαq和C/EBPα。5′侧翼序列包含一个位于-985的TATAA序列。
Northern分析-从Ambion中获得了一个预先与人类多聚（A）RNA结合的Northern印迹膜。一个304碱基对5′端探针，跨越人线粒体C的nt 215-5181-THF合成酶cDNA显示出两条带：一条约3.6 kb，另一条约1.1 kb(). 上面的波段对应于全长转录本的预期大小。为了确保1.1 kb的频带不是伪影，我们在50°C的高强度清洗缓冲液中额外清洗膜30分钟。额外的洗涤并没有消除任何一条带子。上下带分布非常相似，最高转录水平出现在胎盘、胸腺和大脑中。在肝脏和骨骼肌中表达较低，在心脏中几乎检测不到。
线粒体C的Northern印迹分析1-成人组织中THF合成酶转录物将多人组织RNA印迹与32人线粒体C的5′端（A组）或3′端（B组）的P标记探针1-THF合成酶cDNA。在C组中，膜与来自人类细胞质C的3′端的探针杂交1-THF合成酶cDNA。每个膜上的泳道包含来自（从左到右）大脑、胎盘、骨骼肌、心脏、肾脏、胰腺、肝脏、肺、脾脏和胸腺的RNA。下图显示了3.6 kb和1.1 kb转录本上用于面板A和B的探针的相对位置。
为了确定3.6 kb和1.1 kb转录物的关系，合成了一个465 bp探针，该探针在终止密码子之前结束。这个3′探针只检测到3.6 kb的转录本()这表明1.1 kb的转录本仅代表cDNA的5′端。
我们还比较了线粒体C的组织分布1-THF合成酶转录到细胞质同工酶的转录。使用来自细胞质C 3′端的230 bp探针1-THF合成酶cDNA(21)，观察到3.3kb的转录本(). 该转录物的组织分布与线粒体同工酶的组织分布不同，在肝脏、肾脏和骨骼肌中最高。因此，人类线粒体和细胞质C1-THF合成酶同工酶由不同的转录物编码，这些转录物在这些探针和洗涤条件下不会杂交。
成绩单映射-通过5′RACE实验确定转录起始位点。使用10μg人胎盘总RNA通过逆转录合成第一链cDNA，按照实验程序进行5′RACE。随后进行了第一轮PCR（外PCR），没有检测到特定产物。在第二轮PCR中使用两μl的外PCR产物和嵌套引物（内PCR），产生大小小于300 bp的特定产物。最终PCR产物经凝胶纯化和亚克隆。通过PCR筛选了9个菌落，所有菌落的产物大小在220至298 bp之间。对9个克隆中的3个进行了测序，所有克隆在ATG起始密码子上游均显示出相同的5′端107 bp(). 这些结果表明，该基因的大多数转录物起始于或接近-107，并且似乎3.6 kb和1.1 kb转录物都起始于该位点。
人线粒体C的5′侧翼序列和外显子11-THF合成酶基因核苷酸以ATG起始密码子的A作为+1进行编号。编码核苷酸为大写；小写核苷酸代表5′非编码或内含子序列。5′RACE中使用的cDNA特异性外引物和内引物由箭头分别标记为GSO2和GSI2。这个箭头起始于–107表示基于5′RACE的转录起始位点。这个星号指出人类EST数据库中发现的EST的5′端。
替代拼接-进行3′RACE实验以确定在Northern印迹上观察到的1.1kb短转录物的3′端(). 1μg人胎盘总RNA用于第一链cDNA合成。随后进行了第一轮PCR（外PCR），没有检测到特定的RACE产物。在第二轮PCR中使用1μl的外PCR产物和嵌套引物（内PCR）。在2%琼脂糖凝胶上可检测到四种不同的PCR产物，其大小分别为500 bp、350 bp、200 bp和100 bp（也可观察到凝胶顶部的涂片，由全长转录物生成）。根据短转录本的1.1kb长度和内引物的位置，分别对500和350bp RACE产物进行凝胶纯化和克隆。对6个克隆进行测序，以确定克隆的3′范围。所有这些克隆都是短转录本，其中第7外显子剪接到之前未被识别的外显子，称为第8a外显子（位于第7和第8外显子之间的内含子）(). 外显子8a看起来有139长，但在一个克隆中，3′端延伸了162 bp。它在45个核苷酸后含有一个终止密码子，在其3′端附近有一个多聚腺苷化信号。因此，3.6 kb和1.1 kb转录本共享前7个外显子，然后在外显子8/8a处发散。1.1 kb的转录本将被翻译成275个氨基酸的蛋白质，其中前260个氨基酸与全长蛋白质相同，然后是15个不相关的氨基酸()（GenBank接入#{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AY374131”，“term_id”：“34811727”，“term_text”：“A374131”}}AY374131年).
人线粒体C的选择性剪接1-THF合成酶转录本。 一个基因结构和剪接模式。备选外显子8a位于外显子7和8之间的内含子中。在3.6 kb的转录本中，外显子7与外显子8剪接。在1.1 kb的转录本中，外显子7剪接到外显子8a。外显子8a在15个义密码子之后含有一个终止密码子（黑点），在其3′端附近含有一个多聚腺苷酸化信号（AATAAA）。外显子8a和8之间没有同源性。B类.潜在的蛋白质产品。长转录物被翻译成978个氨基酸的蛋白质，而短转录物被翻译成275个氨基酸的蛋白质。通过前7个外显子，这两种蛋白质的氨基酸序列是相同的，编码260个氨基酸。短蛋白从外显子8a中有15个氨基酸，而不是由外显子8编码的氨基酸。脱氢酶/环水解酶（D/C）和合成酶（SYN）结构域之间的连接预计位于aa 330-350(). 星号（*）表示外显子6/7连接处的可变3′剪接位点选择（参见).C类外显子8a编码序列的核苷酸和氨基酸序列。序列3′到终止密码子未显示。
在对3′RACE克隆进行测序时，观察到一个额外的变异。一些克隆在第6和第7外显子的连接处+643位含有额外的密码子(). 这个额外的缬氨酸密码子似乎是由外显子6到外显子7剪接期间3′剪接受体位点的变异引起的。5′剪接位点具有一致的GT作为内含子的第一个2nt。3′剪接位点在内含子的3′端有两个AG共有二核苷酸。如果使用第一个AG二核苷酸，第7外显子包含3个额外的nt；如果使用第二个，则第7外显子中不存在这三个nt。
外显子6/7连接处的可变3′剪接位点选择。 顶部第6外显子3′端和第7外显子5′端为内含子/外显子连接。内含子的前两个nt和可选的AG剪接受体位点被加下划线。底部，如果使用第一（左）或第二（右）AG受体位点，则为替代拼接产品。每个产品编码的氨基酸序列显示在nt序列下面，额外的密码子和氨基酸位于大胆的.
讨论
这里描述的实验证实了人类表达线粒体C1-THF合成酶的性质与之前描述的细胞质同源物非常相似。全长人类cDNA编码978个氨基酸的蛋白质，包括一个N端线粒体靶向序列。当全长cDNA在CHO细胞中表达时，靶向序列将蛋白质专门定向到线粒体(). 推导的氨基酸序列和人类细胞质C的比对1-THF合成酶（935个残基）在推测的线粒体蛋白中显示出62个残基的N末端延伸(). PSORT II分析(http://psort.nibb.ac.jp/form2.html)预测一个线粒体靶向序列，其裂解位点在残基31和32之间。接下来的31个残基，在与细胞质蛋白开始对齐之前，包括9个不寻常的连续甘氨酸和几个基本残基。预测小鼠蛋白的N端延伸非常相似(). 排除这个N末端延伸，与人类细胞质C的同源性1-THF合成酶相当高（61%同源性），推测的线粒体蛋白似乎具有相同的结构域。在细胞质蛋白中，N末端脱氢酶/环水解酶域约为300个残基，C末端合成酶域约700个残基(9). 这两种人类蛋白质在脱氢酶/环水解酶结构域中具有31%的同源性，在合成酶结构域（包括保守的活性位点残基和合成酶域中的10-甲酰-THF结合位点）中具有73%的同源(31). 然而来自人和小鼠的假定线粒体蛋白在两个结构域之间的连接处附近缺乏12个氨基酸（位置318，).
酵母中全长cDNA的表达显示10-甲酰-THF合成酶活性升高，进一步支持其被鉴定为人类线粒体C1-THF合成酶。我们无法使用NADP检测这些细胞中5,10-亚甲基-THF脱氢酶活性的增加+或NAD+作为辅因子。人类线粒体酶的功能与酵母类似吗？鉴于脱氢酶/环水解酶结构域中人类细胞质同工酶和线粒体同工酶之间的同源性较低（31%），可以想象线粒体蛋白已经失去了这些活性。然而，该家族的其他成员也有同样或更多的分歧（例如，酵母MTD1p，参考(30)并且仍然保留5，10-亚甲基-THF脱氢酶活性。第二种可能性是，人体酶的脱氢酶活性低于粗酵母提取物的检测水平。根据物种的不同，这些三功能酶的脱氢酶活性仅为合成酶活性的1/2至1/10(2-9). 最后，我们在酵母中表达的结构包含全部62个氨基酸的N末端延伸。10-甲酰-THF合成酶活性在可溶的细胞质部分中发现，但在线粒体部分中未发现（数据未显示），这表明前序列未被处理。如果保留，这种延伸可能会干扰蛋白质N末端结构域中的脱氢酶/环水解酶活性，而不影响C末端合成酶结构域。这些问题有待于重组酶的纯化。
在大多数人类组织中检测到该基因的表达，但在胎盘、胸腺和大脑中的转录物最高。在肝脏和骨骼肌中表达较低，在心脏中几乎检测不到。一个小鼠cDNA也被鉴定出来，它预测了一种与人类蛋白质具有88%同源性的蛋白质，包括N末端延伸，这表明线粒体C1-所有哺乳动物都会发现THF合成酶。
编码这种酶的人类基因有几个有趣的特征。该基因很大，在6号染色体6q25.2处跨越236 kbp。该基因包含29个外显子（表二），包括外显子7和8之间内含子中的可选外显子8a(). 在小鼠10号染色体上发现的小鼠同源物中也观察到了相同的内含子/外显子结构，只是小鼠基因中没有替代外显子8a。此外，细胞质C的基因1-来自大鼠、小鼠和人类的THF合成酶均显示包含28个外显子，内含子位于几乎相同的位置(36,37). 这表明祖先C1-THF合成酶基因产生于7500万年前人类和啮齿动物谱系分化之前(38)编码线粒体和细胞质同工酶的基因可能与基因复制事件有关。
全长3.6 kb的转录物编码在28个外显子中。一个较短的1.1 kb转录本由另一个剪接事件产生，其中外显子7剪接到外显子8a而不是8(). 该转录物编码一个275个氨基酸的蛋白质，其中前260个氨基酸与全长蛋白质相同，然后是其他C中未发现的15个氨基酸1-THF合成酶。这15个末端氨基酸中的前11个氨基酸也被发现，其中一个错配位于人类α亚型2的C末端附近1安培-肾上腺素能受体，编码这些氨基酸的核苷酸序列与铝重复子家族(39). 外显子8a的前91 nt与共识的右半部分有87%的一致性铝-Sc亚家族（GenBank加入#｛“type”：“entrez nucleotide”，“attrs”：｛“text”：“U14571”，“term_id”：“551540”，“term_text”：“U14571”｝U14571型)表明外显子8a来源于铝以反义方向插入外显子7和8之间内含子的元件。这种插入在小鼠同源物中不存在，因为铝元素只存在于灵长类动物中(40). 该基因的外显子和选择性剪接铝人类线粒体C的序列1-THF合成酶基因显然是由于铝产生功能性3′剪接位点的元件(41).
假设翻译了简短的抄本体内，得到的蛋白质不太可能保留5,10-亚甲基-THF脱氢酶或5,10-亚甲基-THF环水解酶活性。将人线粒体蛋白质序列模拟到人细胞质C脱氢酶/环水解酶结构域的X射线结构上1-THF合成酶(42)揭示了短转录本中缺失的外显子8和9编码NADP-结合位点Rossman折叠的主要部分，以及形成叶酸结合位点一面墙的关键α-螺旋。缺少这些结构元素的截短蛋白质很可能不会折叠成稳定的结构，并会迅速降解。然而，在不知道这15种新型氨基酸如何影响结构的情况下，仍然有可能产生功能改变的稳定蛋白质。正在进行实验以确定是否表达了截短形式的蛋白质体内.
使用来自人类胎盘的RNA，通过5′RACE鉴定了一个位于–107的5′转录起始位点(). 似乎3.6 kb和1.1 kb的转录物都是从这个位点启动的，因为只鉴定出一个5′端。在人类EST数据库中对人类cDNA的5′端进行爆炸式搜索，发现了100多个条目。四个EST超出位置–107().{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“BG481636”，“term_id”：“13413915”，“term_text”：“FG481636“}}BG481636标准（-276）和{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”BE735249“，”term_id“：”10149241“，”term_text“：”BE73 5249“}}比利时735249（-268）来自绒毛膜癌mRNA；{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”BQ062382“，”term_id“：”19889161“，”term_text“：”BQD62382“}}BQ062382号(-119); 和{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”BQ055629“，”term_id“：”19814969“，”term_text“：”BQD55629“}}BQ055629号（-118）是从淋巴瘤细胞系中分离出来的。因此，根据组织或细胞类型，5′转录起始位点可能存在一些异质性。
发现了一个额外的剪接变异。一些转录本在第6外显子和第7外显子交界处的+643位含有额外的密码子(). 这种缬氨酸密码子似乎是由于交替使用由1nt分隔的AG剪接受体位点而产生的。这种剪接位点选择的变异在其他哺乳动物基因中也有发现，包括人类原胸腺素α(43)和大鼠TGF-βI型受体(44). 在我们测序的大多数3′RACE克隆中都观察到了额外的密码子，并且可以在代表全长转录物的许多人类EST中找到。没有证据表明这种替代性剪接位点选择是一个受监管的过程。这可能仅仅是由于当两个AG剪接受体位点如此紧密地落在一起时，剪接机制中的“草率”所致。
基于人类细胞质C脱氢酶/环水解酶结构域的X射线结构1-THF合成酶(42)，额外的缬氨酸预计位于α-螺旋D之间的暴露环上2和β-链e。该环不是脱氢酶/环水解酶活性位点或该结构域二聚化界面的一部分。因此，在此位置可以耐受额外的缬氨酸，而不会影响蛋白质的稳定性或活性。另一方面，我们不知道脱氢酶/环水解酶和合成酶结构域是如何相互作用的，因此有必要表达含有额外缬氨酸的蛋白质来确定其作用。
线粒体C的组织分布1-THF合成酶与细胞质同工酶截然不同(). 虽然细胞质转录物在肝脏和肾脏中最丰富，但线粒体同工酶的转录物在这些组织中相对较低，但在胎盘中最高，其次是胸腺、脾、脑和肺。肝线粒体同工酶的低表达可能是我们早期从肝线粒体中纯化蛋白质的困难的原因。虽然两种转录物的比率因组织而异，但两者都存在于所检测的每个组织中，甚至心脏中(). 大脑中的短转录本显著减少。未来的工作将着眼于理解线粒体同工酶的代谢作用以及该作用与观察到的组织分布之间的关系。
线粒体C的人类基因的发现1-THF合成酶证实了我们的哺乳动物细胞叶酸介导的单碳代谢分区模型(). 基于线粒体C的存在1-酵母中的THF合成酶(三,45)，我们提出哺乳动物线粒体也含有这种三功能酶(10). C的所有三项活动1-哺乳动物线粒体中发现THF合成酶(10). 更重要的是，完整的大鼠肝线粒体和线粒体提取物通过叶酸依赖途径将丝氨酸的碳3氧化为甲酸（线粒体反应1-4）(11). 然而，我们从大鼠肝线粒体中纯化这些活性的所有尝试都失败了。
在同一时间段内，MacKenzie及其同事鉴定了一种哺乳动物双功能NAD依赖性5,10-亚甲基-THF脱氢酶/5,10-甲苯基-THF环水解酶，该酶最初是从腹水肿瘤细胞中分离出来的(12,13). 这种双功能酶缺乏催化10-甲酰-THF合成酶活性的大C末端结构域，因此无法生成甲酸盐。当这种酶被证明定位于线粒体时(14,15)，MacKenzie提出哺乳动物线粒体缺乏三功能C1-THF合成酶，这种双功能NAD依赖性脱氢酶/环水解酶是线粒体三功能酶的哺乳动物同源物(18,19). 然而，这项提议有几个问题。首先，双功能酶主要在转化的哺乳动物细胞和胚胎或非分化组织中检测到(12). 在成人分化组织中，NAD依赖性5,10-亚甲基-THF脱氢酶活性仅在大鼠肾上腺组织中检测到，而在成人肝脏中检测不到(16). 其次，我们在大鼠肝线粒体中检测到的5,10-亚甲基-THF脱氢酶活性依赖于NADP+，而非NAD+(11). 最后，成年大鼠肝线粒体能够通过叶酸依赖性途径产生甲酸(11)，甲酸盐的生产需要10-甲酰-THF合成酶活性(，反应1），其是双功能酶中缺失的。显然，只有三函数C1-THF合成酶具有NADP依赖的5,10-亚甲基-THF脱氢酶活性，与生化数据一致。
线粒体C1-THF合成酶可能支持哺乳动物线粒体中的几种代谢过程。叶酸介导的单碳代谢参与合成甲酰基-甲硫酰基-tRNA以合成线粒体蛋白(46,47) (反应8），以及通过二甲基甘氨酸脱氢酶和肌氨酸脱氢酶氧化胆碱甲基(48). 线粒体C1-THF合成酶也可能在同型半胱氨酸代谢中发挥重要作用。最近对非酮症高甘氨酸血症（NKH）患者的研究揭示了线粒体磷酸化甘氨酸裂解系统（GCS）之间的联系(，反应5）和同型半胱氨酸代谢。NKH是一种常染色体隐性脑病，由GCS亚单位缺陷引起，导致甘氨酸水平升高(49). 除了甘氨酸升高外，GCS活性的丧失还可能导致线粒体单碳单位的缺乏。与这一假设相一致，最近的两项研究报告NKH患者血浆和脑脊液中同型半胱氨酸轻度升高(50,51). 此外，Randak等人(51)发现通过单碳供体5-甲酰-THF（亚叶酸、亚叶酸）治疗，三名患者的血浆同型半胱氨酸水平轻度升高。这一观察提供了强有力的证据，表明同型半胱氨酸升高是由于缺乏一个碳单位导致同型半月氨酸再甲基化缺陷所致。检查提示线粒体GCS活性的丧失可能导致细胞质单碳单位缺乏的两种方式。首先，Van Hove等人建议(50)缺乏功能性GCS的细胞可能通过SHMT增加丝氨酸进入线粒体进行代谢的转运，以弥补线粒体5,10-亚甲基-THF的不足。这反过来会导致细胞质中丝氨酸的缺乏，从而导致单碳单位的缺乏。第二种可能性是NKH患者线粒体中甲酸盐的产生有缺陷。正如我们展示的那样在体外，带有大鼠肝线粒体(10,11)，以及体内在酵母中(28,52)线粒体5,10-亚甲基-THF迅速转化为甲酸盐并运输到胞浆中，在胞浆中通过胞浆10-甲酰-THF合成酶激活为10-甲酰基-THF(线粒体反应3，2，1+细胞质反应1）。然后通过细胞质反应将10-甲酰-THF还原为同型半胱氨酸再甲基化所需的5-甲基-THF。与此解释一致的是，GCS活性受胰高血糖素刺激(53)胰高血糖素降低大鼠血浆同型半胱氨酸(54)可能是通过增加线粒体甲酸盐的生成。一项优雅的人体稳定同位素研究(55)进一步支持线粒体单碳单位在同型半胱氨酸重甲基化中的作用。Gregory等人(55)结果表明，注入氘化丝氨酸后，细胞质和线粒体的单碳单位最终都位于蛋氨酸的甲基基团中。这一结果有力地支持线粒体甲酸盐的产生是细胞质单碳单位的重要贡献者体内在哺乳动物中，线粒体C1-THF合成酶位于该途径的中心。
表一
人类线粒体C的内含子/外显子剪接连接1-THF合成酶基因
| 外显子数 | 外显子大小（bp） | 内含子序列 | 外显子序列 | 内含子序列 | 内含子大小（bp） | 内含子数b条 |
|---|
| | 5′接头 | 3′接头 | | |
|---|
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工具书类
1应用DR。美国财务会计准则委员会J。1991;5:2645–2651.[公共医学][谷歌学者] 2Paukert JL、Williams GR、Rabinowitz JC。生物化学。生物物理学。Res.Comm.公司。1977;77:147–154.[公共医学][谷歌学者] 三。Shannon KW，Rabinowitz JC公司。生物学杂志。化学。1986;261：12266–12271。[公共医学][谷歌学者] 4Paukert JL、Straus LDA、Rabinowitz JC。生物学杂志。化学。1976;251:5104–5111.[公共医学][谷歌学者] 5Tan LUL，MacKenzie RE公司。可以。生物化学杂志。1979;57:806–812.[公共医学][谷歌学者] 6Smith GK、Mueller WT、Wasserman GF、Taylor WD、Benkovic SJ。生物化学。1980;19:4313–4321.[公共医学][谷歌学者] 7Villar E、Schuster B、Peterson D、Schirch V。生物学杂志。化学。1985;260:2245–2252.[公共医学][谷歌学者] 8Cheek WD、Appling DR。架构（architecture）。生物化学。生物物理学。1989;270:504–512.[公共医学][谷歌学者] 9嗯DW，MacKenzie RE。保护。工程师。1991;4:493–500.[公共医学][谷歌学者] 10Barlowe CK，应用博士。生物因子。1988;1:171–176.[公共医学][谷歌学者] 11Garcia-Martinez LF，应用博士。生物化学。1993;32:4671–4676.[公共医学][谷歌学者] 12Mejia NR、MacKenzie RE。生物学杂志。化学。1985;260:14616–14620.[公共医学][谷歌学者] 13Mejia NR、Rios-Orlandi EM、MacKenzie RE。生物学杂志。化学。1986;261:9509–9513.[公共医学][谷歌学者] 14Mejia NR、MacKenzie RE。生物化学。生物物理学。Res.Comm.公司。1988;155:1–6.[公共医学][谷歌学者] 15Belanger C，MacKenzie RE公司。生物学杂志。化学。1989;264:4837–4843.[公共医学][谷歌学者] 16Smith GK、Banks SD、Monaco TJ、Rigual R、Duch DS、Mullin RJ、Huber BE。架构（architecture）。生物化学。生物物理学。1990;283:367–371.[公共医学][谷歌学者] 17Peri KG，MacKenzie RE公司。生物化学。生物物理学。行动。1993;1171:281–287.[公共医学][谷歌学者] 18Yang X-M，MacKenzie RE公司。生物化学。1993;32：11118–11123。[公共医学][谷歌学者] 19Di Pietro E、Sirois J、Tremblay ML、MacKenzie RE。分子细胞生物学。2002;22:4158–4166. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Wiemann S、Weil B、Welleruther R、Gassenhuber J、Glassl S、Ansorge W、Bocher M、Blocker H、Bauersachs S、Blum H、Lauber J，Dusterhoft A、Beyer A、Kohrer K、Strack N、Mewes HW、Ottenwalder B、Obermaier B、Tampe J、Heubner D、Wambutt R、Korn B、Klein M、Poustka A。基因组研究。2001年；11:422–435. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Hum DW、Bell AW、Rozen R、MacKenzie RE。生物学杂志。化学。1988;263:15946–15950.[公共医学][谷歌学者] 22Horton RM、Ho SN、Pullen JK、Hunt HD、Cai Z、Pease LR。方法酶制剂。1993;217：270–279。[公共医学][谷歌学者] 23Lin B-F、Huang R-FS、Shane B。生物学杂志。化学。1993;268:21674–21679.[公共医学][谷歌学者] 24施密特·E·因：酶分析方法。第二届Bergmeyer HU，编辑。第2卷。学术出版社；纽约：1974年。第650-656页。[谷歌学者] 25科恩伯格A。方法。酶制剂。1955;1:441–443. [谷歌学者] 26布拉德福德MM。分析。生物化学。1976;72:248–254.[公共医学][谷歌学者] 27Vernet T、Dignard D、Thomas DY。基因。1987;52:225–233.[公共医学][谷歌学者] 28West MG、Horne DW、Appling DR。生物化学。1996;35:3122–3132.[公共医学][谷歌学者] 30West MG、Barlowe CK、Appling DR。生物学杂志。化学。1993;268:153–160.[公共医学][谷歌学者] 31Kirksey TJ，Appling博士。架构（architecture）。生物化学。生物物理学。1996;333:251–259.[公共医学][谷歌学者] 32科扎克M。分子生物学杂志。1987;196:947–950.[公共医学][谷歌学者] 33Kawai J、Shinagawa A、Shibata K、Yoshino M、Itoh M、Ishii Y、Arakawa T、Hara A、Fukunishi Y、Konno H、Adachi J、Fukuda S、Aizawa K、Izawa M、Nishi K、Kiyosawa H、Kondo S、Yamanaka I、Saito T、Okazaki Y、Gojobori T、Bono H、Kasukawa T、SaitoR、Kadota K、Matsuda HA、Ashburner M、Batalov S、Casavant T、Fleischmann W、Gaasterland T、Gissi C、国王B、，Kochiwa H、Kuehl P、Lewis S、Matsuo Y、Nikaido I、Pesole G、Quackenbush J、Schriml LM、Staubli F、Suzuki R、Tomita M、Wagner L、Washio T、Sakai K、Okido T、Furuno M、Aono H、Baldarelli R、Barsh G、Blake J、Boffelli D、Bojunga N、Carninci P、de Bonaldo MF、Brownstein MJ、Bult C、Fletcher C、Fujita M、Gariboldi M、Gustinich S、Hill D、Hofmann M、，休谟·DA、神户·M、李·NH、里昂·P、马尔基奥尼·L、马岛·J、马扎雷利·J、蒙巴茨·P、诺顿·P、环B、林华德·M、罗德里格斯一世、坂本·N、佐佐木·H、佐藤·K、肖巴赫·C、塞亚·T、柴田·Y、斯托奇·K、铃木·H，东冈康克·K、王·K、魏茨·C、惠塔克·C、威尔明·L、温沙·博里斯·A、吉田·K、长谷川·Y、川崎·H、小铃木·S、草崎I Y。自然。2001年；409:685–690.[公共医学][谷歌学者] 35Breathnach R、Chambon P。生物化学年度收益。1981;50:349–383.[公共医学][谷歌学者] 36Patel H、Christensen KE、Mejia N、MacKenzie RE。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。2002;403:145–148.[公共医学][谷歌学者] 37Howard KM、Muga SJ、Zhang L、Thigpen AE、Appling DR。基因2003年出版[公共医学][谷歌学者] 38Waterston RH、Lindblad-Toh K、Birney E、Rogers J、Abril JF、Agarwal P、Agarwarla R、Ainscow R、Alexandersson M、An P、Antonarakis SE、Attwood J、Baertsch R、Bailey J、Barlow K、Beck S、Berry E、Birren B、Bloom T、Bork P、Botcherby M、Bray N、Brent MR、Brown DG、Brown-SD、Bult C、Burton J、Butler J、Campbell RD、Carnincin P、Cawley S、Chiaromonte F、，Chinwalla AT、Church DM、Clamp M、Clee C、Collins FS、Cook LL、Copley RR、Coulson A、Couronne O、Cuff J、Curwen V、Cutts T、Daly M、David R、Davies J、Delehaunty KD、Deri J、Dermitzakis ET、Dewey C、Dickens NJ、Diekhans M、Dodge S、Dubchak I、Dunn DM、Eddy SR、Elnitski L、Emes RD、Eswara P、Eyras E、Felsenfeld A、Fewell GA、Flicek P、Foley K、，弗兰克尔WN、富尔顿LA、富尔顿RS、富利TS、盖奇D、吉布斯RA、格鲁斯曼G、格内尔S、高盛N、古斯塔特L、格拉芙姆D、格雷夫斯TA、格林ED、格雷戈里S、吉戈里R、盖耶M、哈迪逊RC、豪斯勒D、哈日崎Y、希利尔LW、辛里希斯A、拉维娜W、霍尔泽T、徐福F、华阿、哈伯德T、亨特A、杰克逊I、杰斐DB、约翰逊LS、琼斯M、琼斯TA、乔伊A、，Kamal M、Karlsson EK、Karolchik D、Kasprzyk A、Kawai J、Keibler E、Kells C、Kent WJ、Kirby A、Kolbe DL、Korf I、Kucherlapati RS、Kulbokas EJ、Kulp D、Landers T、Leger JP、Leonard S、Letunic I、Levine R、Li J、Li M、Lloyd C、Lucas S、Ma B、Maglott DR、Mardis ER、Matthews L、Mauceli E、Mayer JH、McCarthy M、McCombie WR、McLaren S、麦克雷K，McPherson JD、Meldrim J、Meredith B、Mesirov JP、Miller W、Miner TL、Mongin E、Montgomery KT、Morgan M、Mott R、Mullikin JC、Muzny DM、Nash WE、Nelson JO、Nhan MN、Nicol R、Ning Z、Nusbaum C、O'Connor MJ、Okazaki Y、Oliver K、Overton Larty E、Pachter L、Parra G、Pepin KH、Peterson J、Pevzner P、Plumb R、Pohl CS、Poliakov A、Ponce TC、Ponting CP，Potter S、Quail M、Reymond A、Roe BA、Roskin KM、Rubin EM、Rust AG、Santos R、Sapojnikov V、Schultz B、SchultzJ、Schwartz MS、Schwarz S、Scott C、Seaman S、Searle S、Sharpe T、Sheridan A、Shownken R、Sims S、Singer JB、Slater G、Smit A、Smith DR、Spencer B、Stabenau A、Stange-Thomann N、Sugnet C、Suyama M、Tesler G、Thompson J、Torrents D、，Trevaskis E、Tromp J、Ucla C、Ureta-Vida A、Vinson JP、Von Niederhausern AC、Wade CM、Wall M、Weber RJ、Weiss RB、Wendl MC、West AP、Wetterstrand K、Wheeler R、Whelan S、Wierzbowski J、Willey D、Williams S、Wilson RK、Winter E、Worley KC、Wyman D、Yang S、Yang SP、Zdobnov EM、Zody MC、Lander ES。自然。2002;420:520–562.[公共医学][谷歌学者] 39Chang DJ、Chang TK、Yamanishi SS、Salazar FH、Kosaka AH、Khare R、Bhakta S、Jasper JR、Shieh IS、Lesnick JD、Ford AP、Daniels DV、Eglen RM、Clarke DE、Bach C、Chan HW。FEBS信函。1998;422:279–283.[公共医学][谷歌学者] 41Lev-Maor G、Sorek R、Shomron N、Ast G。科学。2003;300:1288–1291.[公共医学][谷歌学者] 42Schmidt A、Wu H、MacKenzie RE、Chen VJ、Bewly JR、Ray JE、Toth JE、Cygler M。生物化学。2000;39:6325–6335.[公共医学][谷歌学者] 43Manrow RE，Berger SL公司。分子生物学杂志。1993;234:281–288.[公共医学][谷歌学者] 44Agrotis A、Condron M、Bobik A。FEBS信函。2000;467:128–132.[公共医学][谷歌学者] 45Shannon KW，Rabinowitz JC公司。生物学杂志。化学。1988;263:7717–7725.[公共医学][谷歌学者] 46Galper JB，Darnell JE。生物化学。生物物理学。Res.Comm.公司。1969;34:205–214.[公共医学][谷歌学者] 47Bianchetti R、Lucchini G、Crosti P、Tortora P。生物学杂志。化学。1977;252：2519–2523。[公共医学][谷歌学者] 48Lewis KF、Randolph VM、Nemeth E、Frisell WR。架构（architecture）。生物化学。生物物理学。1978年；185:443–449.[公共医学][谷歌学者] 49Hamosh A、Johnston MV、Valle D.Scriver CR、Beaudet AL、Sly WS、Valle D。遗传病的代谢和分子基础1995我1337–1348.麦格劳-希尔；纽约：第73卷。[谷歌学者] 50Van Hove JL、Lazeyras F、Zeisel SH、Bottiglieri T、Hyland K、Charles HC、Gray L、Jaeken J、Kahler SG。J继承元疾病。1998;21:799–811.[公共医学][谷歌学者] 51Randak C、Rosschinger W、Rolinski B、Hadorn HB、Applegarth DA、Roscher AA。J继承元疾病。2000;23:520–522.[公共医学][谷歌学者] 52Pasternack LB，Laude DA，Jr.，Appling博士。生物化学。1994;33:74–82.[公共医学][谷歌学者] 53Jois M、B厅、Fewer K、Brosnan JT。生物学杂志。化学。1989;264:3347–3351.[公共医学][谷歌学者] 54House JD、Jacobs RL、Stead LM、Brosnan ME和Brosnan JT。高级酶调节。1999;39:69–91.[公共医学][谷歌学者] 55Gregory JF，第三，Cuskelly GJ，Shane B，Toth JP，Baumgartner TG，Stacpoole PW。美国临床营养学杂志。2000;72:1535–1541.[公共医学][谷歌学者] 
