小环指蛋白Z驱动沙粒病毒萌芽：抗病毒策略的意义

摘要

沙粒病毒包括拉沙热病毒（LFV）和南美出血热（HF）病毒。这些病毒会导致严重的人类疾病，并作为生物恐怖主义的代理人构成威胁(1). 淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）是研究急性和持续病毒感染的重要模型(2). 此外，LCMV为研究HF沙型病毒的分子和细胞生物学的基本方面提供了一个极好的系统。

LCMV是一种包膜病毒，其基因组由两个负义单链RNA片段组成，分别称为L（7.2 kb）和S（3.4 kb）。每个片段使用一个双义编码组织来指导两个方向相反的基因产物的合成，每个片段由基因间区域分隔(三)S RNA编码核蛋白（NP）和两种表面病毒糖蛋白（GPs），即GP-1和GP-2，它们是通过前体多肽GP-C的蛋白水解裂解而获得的(4). GP-1和GP-2在病毒膜上形成尖峰，并通过与宿主细胞表面受体的相互作用介导细胞进入(5). L RNA指导病毒RNA依赖性RNA聚合酶（L蛋白）和一种称为Z（11kDa）的小环指蛋白的合成(6). NP与病毒基因组RNA物种和L结合形成病毒核糖核蛋白（RNP）核心，该核心能够进行转录和RNA复制，并构成最小感染单位(7). Z在病毒生命周期中的作用尚不清楚，在其他负链（NS）RNA病毒中未发现Z的同源物。Z是病毒的结构成分(8)据报道，在感染细胞中，Z与多种细胞因子相互作用，包括早幼粒细胞白血病蛋白(9)以及真核生物翻译起始因子4E，后者被认为可以抑制CAP依赖的翻译(10,11). 此外，早期研究表明Z在病毒转录调控中的作用(12).

我们已经为LCMV开发了一个反向遗传系统，允许病毒转录和RNA复制的细胞内重建，以及感染颗粒的组装和萌发。通过使用该系统，我们发现LCMV聚合酶介导的RNA合成不需要Z(13)，但Z对LCMV转录和RNA复制都表现出剂量依赖性的抑制作用(7). 随后，新世界沙粒病毒Tacaribe病毒（TV）的Z蛋白也有类似的发现(14).

我们还表明，产生感染性病毒样颗粒（VLP）需要GP和Z(15). Arenavirus从质膜出芽，这涉及病毒RNP核心与高度富集病毒GP的宿主衍生膜的结合(16). 对于许多NS RNA病毒，这个过程主要由病毒基质（M）蛋白介导(17). 逆转录病毒和NS RNA病毒的Gag和M蛋白分别含有晚期（L）结构域，这些结构域在病毒出芽的最后步骤中起着重要作用(18,19). 到目前为止，病毒L结构域中已定义了三种类型的基序：P（T/S）AP、PPxY和YxxL(18,19)，其中“x”是任何氨基酸。L结构域是高度保守的，已被证明可以介导与病毒出芽所需的宿主细胞蛋白的相互作用。因此，据报道，E类空泡蛋白分选（VPS）细胞机制的组成部分Tsg101与埃博拉病毒VP40和HIV-Gag蛋白的PTAP基序相互作用。这种相互作用将Tsg101招募到粒子组装位置，这是高效形成HIV-1病毒和埃博拉病毒VLP所必需的(20,21). 另一方面，细胞泛素连接酶Nedd4的WW结构域与Rous肉瘤病毒（RSV）Gag、埃博拉病毒VP40和VSV M蛋白上的PPxY基序相互作用(22). 这种相互作用导致泛素共价添加到病毒Gag和M蛋白中，并随后形成粒子(18,19).

沙粒病毒没有在许多其他NS RNA病毒中发现的M蛋白的对应物。Z对VLP产生的需求表明它可能在沙粒病毒出芽中起作用。在这里，我们提供证据证明Z是沙粒病毒萌芽的主要驱动力。我们还表明，LCMV和LFV Z蛋白都具有真正出芽病毒蛋白的特征，包括自出芽活性和替代无关L结构域的能力(18,19). Arenavirus Z蛋白在其C末端含有保守的脯氨酸基序，其与几种Gag和M蛋白的L结构域中存在的脯氨酸基序相似。LCMV Z的C末端存在的PPPY基序对于VLP的有效组装和出芽是严格要求的，而LFV Z介导的出芽则需要非重叠的L结构域PTAPP和PPPY。LCMV和LFV Z蛋白在质膜上与Tsg101共定位，并且通过RNA干扰（RNAi）靶向Tsg102，对VLP产生产生强烈抑制。这些结果表明，Z是从质膜上萌发的包膜NS RNA病毒中存在的M蛋白的功能对等物，而Tsg101在沙粒病毒出芽中起着重要作用。我们的发现提高了靶向正在萌芽的沙粒病毒作为对抗HF沙粒病毒的抗病毒策略的可能性。

材料和方法

病毒、细胞、转染程序和西方印迹。LCMV Armstrong（ARM）53b株在幼仓鼠肾脏（BHK）-21细胞中生长(23). vTF7–3由B.Moss（贝塞斯达国立卫生研究院）提供(24). 将人胚胎肾（HEK）-293T和非洲绿猴肾COS-1细胞保存在补充有2 mM谷氨酰胺和10%热失活FCS的高糖DMEM中。BHK-21细胞保存在补充有10%FCS、2 mM谷氨酰胺、1×胰蛋白酶磷酸盐肉汤、1 mM丙酮酸钠和0.5%葡萄糖的DMEM中。如前所述，用脂质体（Invitrogen）转染HEK-293T和COS-1细胞(15).

为了进行Western blot分析，在样品缓冲液中收集细胞（50 mM Tris·HCl，pH 8.0/62.5 mM EDTA/1%Nonide P-40/0.4%脱氧胆酸盐）。如前所述，通过Western blotting分析细胞裂解物（CE(25). 使用Boehringer-Mannheim化学发光试剂盒（Roche Molecular Biochemicals）对蛋白质进行免疫检测。我们使用兔抗血凝素（HA）（圣克鲁斯生物技术）和GFP（分子探针）的多克隆抗体。

质粒。质粒pC-L、pC-NP、pC-Z和pC-GP分别表达LCMV的聚合酶、NP、Z和GP，并已被描述(15). 质粒pC-VSV G(26)和pC-T7(15)分别表达VSV G和噬菌体T7 RNA聚合酶（T7RP）。质粒pC中的主干和DNA聚合酶II启动子与质粒pCAGGS中的启动子相同(27). LCMV和LFV Z cDNA在其C末端用流感病毒HA表位标记，方法是使用贴片PCR策略(28)，然后在生态RI和Bgl公司pCAGGS的II个位点，或介于Nco公司我和巴姆pUCIRES的HI位点。使用Stratagene定点突变试剂盒引入富含脯氨酸基序的突变。

通过删除质粒pMG#7中T7RP启动子的两个3′端G残基生成质粒pMG#7Δ2G(29). 在表达T7RP的细胞中，pMG#7Δ2G允许合成由LCMV ARM S片段的5′和3′UTR和基因间区域组成的小基因组（MG）RNA，以及替代NP ORF的氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因。MG#7Δ2G RNA的5′端起始于据报道存在于沙型病毒基因组和抗原RNA物种5′端的非模板G残基(三).

质粒pC-Tsg101myc(30)和pSUPER(31)分别从S.N.Cohen（斯坦福大学医学院，加利福尼亚州斯坦福）和R.Agami（荷兰癌症研究所，阿姆斯特丹）处获得。质粒pS-EGFP是C.H.McGowan（斯克里普斯研究所）和pS-Tsg101赠送的礼物，可通过H1 RNA启动子介导的细胞内表达，该启动子为小干扰RNA，专门针对增强型GFP（EGFP）和Tsg101。

为了生成pS-Tsg101，两个退火的64-bp寡核苷酸被克隆到Bgl公司II和Hin公司pSUPER的dII克隆位点。据报道，所使用的19-nt序列可有效促进RNA干扰对Tsg101的降解(20). 为了生成质粒pS.EGFP，使用OLIGONGINE WORKSTATION程序完成目标区域（核苷酸11–30）的选择。

质粒pSV。梅尔，pSV。RSV Gag和pSV。已描述VSV M-GagN(32). 为了产生LCMV或LFV Z RSV Gag嵌合体，通过PCR扩增相应的ORF以引入Nde公司我在8月的网站上Spe公司在每个Z ORF的最后一个密码子之后定位。该PCR产物与130-nt连接上海I–Nde公司I片段携带pSV的5′UTR。Myr公司。通过使用跨越上游的5′引物对连接片段进行扩孔上海I站点和3′Spe公司含I的底漆。该cDNA用上海我和Spe公司我并克隆到pSV中。Myr，并用相同的酶消化。

通过DNA测序验证质粒构建和突变。用于克隆和诱变的引物序列以及详细的实验条件可按要求提供。

VLP的产生和感染性。HEK-293T电池（1.5×10⁶)用编码NP（0.8μg）、L（1μg）和GP（0.4μg）的质粒转染生长在35-mm直径孔中的细胞，Z（0.1μg），T7RP（1μg）和MG#7Δ2G（0.5μg）。缺少任何支持质粒的对照转染接受空pCAGGS质粒，以保持每个孔中转染的DNA总量恒定。所有质粒DNA均采用Qiagen（Valencia，CA）技术制备。在转染后72小时，保存上清液（SP）（1.5 ml），并按所述制备CE用于CAT分析(29). 用等分的澄清SP（600μl）感染12孔板中BHK-21细胞的新鲜单层。吸附4小时后，移除接种物，并以3倍感染率（moi）添加LCMV ARM辅助病毒。吸附2 h后，去除接种物并添加新鲜培养基。72小时后，制备CE并进行CAT分析。

VLP中RNA的分离与分析。在转染后72小时，收集含有VLP的SP并以低速澄清。将等分（0.9 ml）分层放置在20%蔗糖垫上，并在TLS55转子上以50000 rpm在4°C下离心90 min。使用Tri试剂（辛辛那提分子研究中心）从含有VLP的颗粒中提取RNA。在使用SuperScript II和BsmICAT引物进行反转录反应之前，使用不含DNA的试剂盒（德克萨斯州奥斯汀Ambion）去除可能的污染物DNA。PCR使用塔克聚合酶（Roche Diagnostics，Indianapolis）和特异性引物BsmICAT（5′-GATGAATGCTCATCCGGAATTCG-3′）和PfmlICAT（5'-CCCAGGATTGGCTGACAAAAAACATC-3′）扩增CAT ORF中280个碱基对的片段。

萌芽试验。为了分析Z的自萌芽特性，COS-1细胞以10 moi感染vTF7-3，然后转染指定的T7启动子表达质粒。细胞代谢标记为[³⁵S] 已见面/[³⁵S] Cys，转染后2 h开始，10 h后，按所述收集细胞和培养SP(33)和通过免疫沉淀法进行分析(34)使用抗LCMV豚鼠血清、α-LCMV Z兔多克隆血清或α-HA兔多克隆血浆。

如前所述，在COS-1细胞中进行嵌合Gag蛋白的出芽试验(32). 转染后48小时，细胞标记2.5小时[³⁵S] 已见面/[³⁵S] 使用识别Gag蛋白及其裂解产物的抗RSV血清，通过免疫沉淀法分析培养基中的Cys和Gag相关蛋白以及CE。

免疫荧光。用所示质粒转染生长在盖玻片上的BHK-21细胞。48小时后，用甲醇：丙酮固定细胞，并用α-HA、α-myc（9E10）或两种抗体孵育。作为二级抗体，我们使用了抗小鼠IgG的荧光结合抗体或抗兔IgG罗丹明X结合抗体（杰克逊实验室）。使用Bio-Rad MRC1024共聚焦显微镜和浸油×63物镜对染色进行可视化。所有2D共焦图像都显示了在接近细胞中线的位置捕获的单个Z截面。

结果

小环指Z蛋白是沙粒病毒萌芽的主要驱动力。LCMV GP和Z蛋白是生产感染性LCMV样颗粒（VLP）所必需的(15). 由于GP在受体识别和病毒进入中的作用，预计需要GP(35)而对Z的需要表明该蛋白可能在病毒组装和出芽中发挥作用。我们假设Z可能是介导其他NS RNA病毒出芽的M蛋白的砂状病毒功能对等物。为了验证这一假设，我们研究了LCMV蛋白对高效生产VLP的需求。在本研究中，我们用不同的质粒组合转染HEK-293T细胞(图1A类). 根据CE中CAT活性水平测定转染细胞中LCMV MG的表达(图1A类). 与我们之前的调查结果一致(7)L和NP足以有效表达MG，而Z对LCMV MG表达具有抑制作用(图1A类，比较车道1和3）。GP的共表达降低了Z的抑制作用(图1一个，比较车道3和5）。此外，在几个独立的实验中，我们一致观察到，来自含有Z和GP的转染细胞的裂解物，除了最小的反式病毒因子L和NP外，还具有较高水平的CAT活性(图1，比较车道1和5）。含Z小泡释放到转染细胞的SP中不需要GP和NP(图1B类). 接下来，我们研究了Z是否能够介导含有真正病毒核衣壳（NC）的VLP的生成。为此，将转染细胞的培养SP中存在的VLP粒化，分离其相关RNA，并使用特异性引物对LCMV MG RNA的CAT ORF中的一个区域进行RT-PCR扩增(图1C类). 正如预测的那样，NP的缺乏阻止了可纳入VLP的含MG NC的形成(图1C类，车道4和5）。缺乏GP仅导致VLP产量略有下降(图1C类，比较车道2和6）。相反，Z的缺失导致VLP产量急剧下降(图1C类，第8和第9车道）。总之，这些结果表明Z是LCMV萌芽的主要驱动力。

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图1。

VLP的生产严格要求使用LCMV Z。(A类)在LCMV蛋白的不同组合存在下，LCMV MG表达CAT。非乙酰化（NAc）和单乙酰化（MAc）氯霉素。(B类)释放含有Z蛋白的囊泡。转染细胞SP中存在的VLP通过20%蔗糖缓冲液超速离心获得，并通过Western blotting进行分析。(C类)通过RT-PCR检测与VLP相关的MG RNA，VLP存在于转染细胞的SP中。

LCMV Z具有善意出芽蛋白的特征，并包含Z介导出芽所必需的富含脯氨酸的基序（PPPY）。我们首先检查了LCMV Z是否具有真正的病毒出芽蛋白的自出芽活性特征。用vTF7-3感染并用Z转染的细胞，或作为对照，用NP或空质粒转染的细胞，用放射性标记[³⁵S] 免疫沉淀法（IPP）分析Met和等量CE或培养SP(图2A类). 转染细胞中合成的Z蛋白总量的约25%释放到SP中(图2A类 上部)而SP中检测到<2%的NP(图2A类 下部)这可能反映了与细胞转染相关的实验条件导致的轻微细胞损伤。病毒芽生蛋白的另一个特征是其L结构域的灵活性。一个L结构域替代另一个结构域促进病毒释放(18). 为了研究这个问题，我们检测了Z-Gag嵌合蛋白的出芽特性，其中Z融合到一个缺乏膜靶向和结合信号（M域）和L域的RSV-Gag蛋白(32). 通过正确加工的Gag蛋白的裂解产物（衣壳蛋白和蛋白酶）的外观来监测Gag颗粒在SP中的萌发。Z有效取代RSV Gag蛋白中的M和L结构域(图2B类，车道7）。作为额外的对照，我们使用Gag蛋白，其中其M和L结构域已被VSV M的前74个氨基酸取代，从而产生嵌合VSV M-GagN蛋白。如报告所述(32)，这个嵌合体也有能力促进萌芽(图2B类，车道6）。

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图2。

Z具有真正的出芽蛋白的特征。(A类)Z有自我萌芽的活动。Z从转染细胞的SP中免疫沉淀，并用代谢标记[³⁵S] 已见面/[³⁵S] 赛斯。作为对照，用编码LCMV-NP的质粒转染细胞。(B类)Z可以替代RSV L域。用所示结构转染细胞的裂解物和SP中存在的蛋白质，并用[³⁵S] 已见面/[³⁵S] 免疫沉淀Cys以检测Gag裂解产物。(C类)砂状病毒Z和不同病毒Gag和M蛋白中富含脯氨酸基序的比较。

沙粒病毒Z含有富含脯氨酸的基序，类似于几种病毒Gag和M蛋白L结构域中的基序(图2C类). LCMV的Z蛋白包含一个PPPY基序，而高致病性沙型病毒LFV的Z蛋白同时包含八个氨基酸分离的PTAP基序和PPPY模序。为了确定PPPY基序是否对LCMV Z介导的芽接至关重要，我们在PPPY基序中引入了丙氨酸取代，可以是单独的，也可以是各种组合的(图3A类). 在ΔSPPPYE突变的情况下，整个基序被删除。为了便于检测这些蛋白质，在它们的C末端用HA表位标记。所有突变体的表达水平相似(图3A类). PPPY基序的突变不会影响MG RNA的转录和复制水平(图3B类)，但所有这些都导致含MG NC的VLP水平降低(图3C类). 此外，突变Z蛋白替代RSV-Gag蛋白L结构域的能力受损(图3D类). 这些结果表明，LCMV Z蛋白上的PPPY基序是一个功能性L结构域。

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图3。

PPPY基序负责LCMV Z的出芽活性(A类)显示了带有突变PPPY基序的Z蛋白的序列和表达。标识由虚线表示。蛋白质用α-HA抗体进行Western blot检测。(B类)突变蛋白对MG衍生CAT活性没有影响。(C类)PPPY基序的突变导致VLP的产生急剧减少。通过RT-PCR扩增与VLP相关的MG RNA。(D类)PPPY中含有Z的突变未能恢复缺乏L结构域的RSV-Gag蛋白的出芽特性。通过IPP分析转染细胞的裂解物和SP中存在的蛋白质。CA，衣壳蛋白；PR，蛋白酶。

LFV Z PTAP和PPPY母体都是VLP有效萌芽所必需的。接下来，我们研究了高致病性沙粒病毒（LFV）的Z蛋白是否也具有真正的出芽蛋白的特性。我们首先检测了LFV Z是否具有自萌芽活性，以及是否可以替代RSV Gag蛋白的L结构域。感染vTF7-3并转染pUC-LFVZHA的COS-1细胞用放射标记[³⁵S] 已见/[³⁵S] 使用抗HA抗体通过IPP分析Cys、SP和CE。在转染细胞中合成的总LFV Z蛋白中，约有40%存在于SP中(图4A类). 此外，LFV Z能够恢复缺乏M和L结构域的RSV Gag突变蛋白的出芽特性(图4B类). 此外，LFV Z在VLP形成分析中非常有效地替代了其LCMV对应物(图4C类).

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图4。

PTAP和PPPY基序都是LFV Z介导的有效芽接所必需的(A类)LFV Z有自我萌芽的活动。转染细胞SP标记的LFV Z的IPP[³⁵S] 已见面/[³⁵S] 赛斯。(B类)LFV Z可以在功能上替代RSV Gag的L域。存在于裂解物中的蛋白质的IPP和转染细胞的SP揭示了Gag切割产物的存在。(C类)LFV Z可有效替代LCMV Z形成传染性VLP。(D类)富含脯氨酸基序突变的LFV Z的序列和表达。突变残留物为灰色。完整的图案由方框表示。蛋白质用α-HA抗体进行Western blot检测。(E类)PTAP和PPPY基序的突变都会损害VLP的产生。通过RT-PCR扩增与VLP相关的MG RNA。

LFV Z包含两个L结构域基序：PTAP和PPPY，由八个氨基酸分开。为了评估每个单独的基序对出芽的贡献，我们分别同时对每个基序进行突变(图4D类)在LFV Z蛋白的C末端标记有HA表位。突变LFV Z蛋白在转染细胞中高效表达(图4D类)根据转染细胞SP中未检测到的VLP-相关MG RNA水平，所有这些细胞的出芽活性均受损(图4E类). 这些结果表明，LFV Z介导的高效芽接需要两个富含脯氨酸的结构域。

LCMV和LFV野生型和突变Z蛋白的细胞内定位。突变Z蛋白的出芽活性受损可能是因为它们在细胞内定位错误，并且无法定位到细胞膜。为了解决这个问题，我们使用间接免疫荧光和共焦显微镜来分析表达野生型或突变Z蛋白的细胞(图5). 野生型和突变型Z蛋白都表现出相同的染色模式，包括与质膜的明显结合。仅用空载体转染的细胞作为阴性对照。因此，突变Z蛋白不能促进病毒组装和出芽不是因为它们定位错误，而是与L结构域功能受损有关。

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图5。

野生型和突变型LCMV和LFV Z蛋白在BHK-21细胞中表达时具有相同的细胞内分布模式。PPPY结构域突变为AAPA的AAPA、Z蛋白；LTAL，PTAP基序突变为LTAL的Z蛋白。

Tsg101在沙粒病毒萌芽中的作用。Tsg101通过与Gag和VP40 L结构域中的PTAP基序相互作用，与HIV-1和埃博拉病毒的萌芽有关(36,37). LFV Z中的PTAP基序表明其可能与Tsg101相互作用。对与LFV Z-HA或LCMV Z-HA和Tsg101-myc共转染细胞的共焦显微镜研究表明，LFV和LCMV Z蛋白与Tsg101共定位(图6A类). 为了评估Tsg101在沙粒病毒出芽过程中可能的功能作用，我们检测了降低Tsg102细胞水平对VLP出芽的影响。由于缺乏Tsg101缺陷的细胞株，我们考虑使用RNAi。为此，我们生成了质粒pSTsg101。该质粒在H1启动子序列和终止子序列之间包含一个源自Tsg101基因的19-nt序列，该序列由相同19个核苷酸的反向补体的短间隔序列分离。作为对照，我们使用质粒pS-EGFP，该质粒包含允许细胞内产生特异性靶向EGFP mRNA的siRNA的序列。与pS-EGFP和pC-EGFP共转染的细胞显示EGFP的表达水平显著降低(图6B类). 联合转染pS-Tsg101而非pS-EGFP对照，导致Tsg101-myc表达水平严重降低(图6C类). 然后，我们在pS-Tsg101或对照质粒pS-EGFP存在下，将HEK-293T细胞与VLP形成所需的所有质粒共转染。在转染混合物中加入pS-EGFP不会影响VLP的产生。相比之下，pS-Tsg101的共转染导致VLP生成显著减少，这是通过传递到新鲜BHK-21单层的CAT活性的减少来测量的(图6D类 上部，比较泳道3和4）。当LCMV Z被LFV Z取代时，观察到同样的效果（数据未显示）。

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图6。

(一个)BHK-21细胞中LCMV Z-HA（红色）和Tsg101-myc（绿色）的Z共表达导致这两种蛋白的共定位。(B类)通过Western blot或直接荧光检测到，转染一个指导EGFP特异性siRNA合成的质粒（pS-EGFP）导致EGFP蛋白水平降低。(C类)用质粒Tsg101-myc和pS-Tsg101共同转染细胞会导致Tsg102-myc蛋白的表达水平严重降低。(D类)Tsg101特异性siRNA的细胞内表达导致VLP形成受损。

讨论

沙状病毒出芽的机制以前还没有被提及。在大多数被包裹的NS RNA病毒中发现的M蛋白在病毒组装和出芽中起着关键作用(16). 然而，砂型病毒似乎没有M蛋白，交联研究表明GP2和病毒RNP核心之间可能存在直接相互作用，而不需要M样蛋白。

沙粒病毒编码一个小环指蛋白Z，在其他NS RNA病毒中没有明显的对应物。Z在病毒生命周期中的作用尚不清楚。在本研究中，我们表明Z是沙粒病毒萌芽的主要驱动力(图1). 因此，Z可以被认为是在许多其他包膜NS RNA病毒中发现的M蛋白的砂状病毒功能对应物。Z显示了真正出芽蛋白质的特性，包括自出芽(图2A类)以及取代RSV的不相关L结构域的能力(图2B类). 我们研究中使用的Z-Gag嵌合结构缺乏Gag M和L结构域(32). 因此，Z-Gag颗粒的萌芽需要Z也能够提供膜靶向和结合活性。存在于其N端的保守肉豆蔻酰化序列基序可能为Z蛋白提供膜靶向特性。与这个想法一致，G的突变₂A导致Z蛋白在出芽活性上有缺陷（M.P.和J.C.d.l.T.，未发表的结果）。与它们的出芽特性一致，Z蛋白的C末端包含L域中发现的富含脯氨酸的基序（PPxY和PT/SAP）（参考文献。18和图2C类). 这些基序的完整性是VLP高效Z介导发芽的严格要求（图。​（图3三和4C–F类). 具有突变L结构域基序的野生型Z和Z蛋白表达水平相似，并且表现出相似的细胞内表达模式（图。​（图3A类三A类,​,4D类,4D类、和​和5），5)这表明突变Z蛋白缺乏芽殖活性与病毒离开最后一步的缺陷有关。

对已知沙粒病毒Z蛋白的比较表明，TV是Z蛋白不包含PPxY或PT/SAP四肽基序的唯一家族成员。相反，TV-Z含有逆转录病毒马免疫性贫血病毒L结构域中发现的YxxL基序(38). 此外，TV Z包含一个ASAP序列，部分模仿L域PSAP。含PSAP的L结构域介导的出芽似乎需要与细胞蛋白Tsg101相互作用(18). 在L结构域的第一个位置，P变为A，将其与Tsg101的结合减少了3倍(20). 因此，TV Z的ASAP基序可能仍然支持与Tsg101的交互。同样，据报道，LCMV的WE菌株的Z具有LPPY序列，而不是在其他LCMV菌株中发现的PPPY序列。然而，在重新查看WE Z基因的序列后，我们确定氨基酸位置85是P，而不是L，因此，WE Z也具有PPPY基序。

LFV是一种HF沙粒病毒，包含PTAP和PPPY基序，由八个氨基酸分开。有趣的是，PTAP和PPPY基序也被发现在氨基酸7-13中重叠(₇PTAPPEY公司₁₃)埃博拉病毒出芽蛋白VP40中(18,19,39)是另一种严重心衰的病原体。在埃博拉病毒VP40的病例中，每一个基序单独作为L结构域激活(39). 相反，破坏PTAP或PPPY基序的含有LFV Z的突变在促进VLP生成的能力上严重受损(图4C–E类). 这一发现表明，在LFV Z的情况下，每个基序可能涉及不同的寄主因子，所有这些都是高效LFV Z介导的出芽所必需的。

LCMV和LFV Z蛋白与Tsg101在质膜附近共定位(图6A类). 令人信服的证据表明，含有PTAP的L结构域病毒的出芽需要Tsg101和四肽PTAP之间的相互作用(18)然而，在LCMV Z中发现的L结构域属于PPxY类，这表明LCMV Z招募Tsg101可能不是由于直接相互作用，而是由能够与两者结合的第三种蛋白质介导的。在这方面，泛素连接酶Nedd4蛋白通过与PPxY基序的相互作用参与了几种病毒的出芽，但Nedd4也与Tsg101相互作用(40).

据我们所知，沙粒病毒Z是第一个环指蛋白作为NS RNA病毒出芽的关键调节因子的例子。环指结构域介导蛋白质-蛋白质相互作用，这可能有助于沙状病毒出芽所需的细胞蛋白Z募集。与这种观点一致的是，突变Z蛋白未能促进VLP的出芽（未显示），其中环指的第一个环被位置32和35的保守C的a突变破坏。

越来越多的证据表明，病毒从质膜出芽涉及病毒蛋白和VPS细胞机制成员之间的复杂相互作用，包括Tsg101、VPS4和Nedd 4(18). 使用RNAi降低Tsg101的细胞内表达导致LCMV或LFV Z蛋白介导的出芽显著减少，这表明Tsg102在沙粒病毒出芽中起着基本作用。其他细胞蛋白可能有助于沙粒病毒出芽。这些细胞蛋白的鉴定，以及它们与Z的相互作用的表征，将为靶向沙粒病毒萌芽作为抗病毒策略以抗击包括LFV在内的高致病性HF沙粒病毒开辟了可能性。

致谢

笔记

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：LCMV，淋巴细胞脉络膜脑膜炎病毒；LFV、拉沙热病毒；电视、塔卡里布病毒；五十、 迟到；VLP，类病毒颗粒；HF，出血热；NP，核蛋白；GP，糖蛋白；NS，负链；M、 病毒基质；RSV、Rous肉瘤病毒；RNA干扰；BHK，幼仓鼠肾；HEK，人类胚胎肾脏；HA、血凝素；MG，微基因组；EGFP，增强型GFP；氯霉素乙酰转移酶；SP，上清液；CE，细胞裂解物；NC，核衣壳；IPP，免疫沉淀。

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