兔亲素3A C2结构域的PIP2结合模式

钙²⁺-C2A域的IP3-绑定模式

兔亲素3A的C2A结构域的晶体结构不含任何有序钙²⁺离子(^{Biadene等人，2006年}). 因此，我们探测了Ca²⁺-核磁共振研究C2结构域的结合性质。A类¹⁵N个-¹H基于HSQC的Ca²⁺从0到20 mM的滴定主要引起Ca中残留物的化学位移变化²⁺-结合区（CBR）(图2A)与之前关于该结构域结合Ca的能力的观察结果一致²⁺(^{Montaville等人，2007年}). N端和C端末端也受到中度影响，这是因为它们在空间上接近CBR。C2A结构域在5 mM Ca时达到饱和²⁺.没有额外的低亲和力钙²⁺-在较高浓度下发现了结合位点。根据Ca拟合CBR附近残留物的化学位移扰动²⁺浓缩是可能的方程式3（见材料和方法），表示合作绑定。获得了1.1±0.01 mM的总离解常数，希尔系数为2.24±0.03(图2B). 这表明两个Ca²⁺离子以合作的方式结合到兔子蛋白3A的C2A结构域。

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图2。

钙²⁺-兔亲素3A C2A结构域的结合特性。(A类)¹H（H）-¹⁵添加5 mM Ca后，根据C2A结构域片段（371–510）序列绘制的N化学位移扰动δΔ（见材料和方法）²⁺缺失的化学位移偏差与pH 7.0下无钙时中间化学交换率的交叉峰有关²⁺和脯氨酸残基。三个Ca的位置²⁺-绑定循环（CBL1、CBL2和CBL3）突出显示在顶部. (B类)根据Ca对六个残基主链HN交叉峰的化学位移扰动进行同步拟合²⁺使用希尔方程的浓度(方程式3; 参见材料和方法）。

饱和钙浓度下C2A结构域的D-肌醇-1,4,5-三磷酸（IP3，即PIP2头组）滴定²⁺（5 mM）对位于核心域凹侧（位置1）的有限残基组显示出较大的化学位移扰动(图3A). 结合发生在快速交换时间尺度上，表明溶液中配体的亲和力相当低，尽管对IP3的识别涉及明确的结合位点。此外，属于CBL3残基和β3和β4链之间的环的HN共振在pH 7.0时被加宽，但出现在高IP3浓度的光谱中（数据未显示）。这表明围绕C2A结构域β-槽的这两个环的整体动力学在结合时发生变化，并且这些环可能积极参与结合。当配体过量五倍时达到饱和。同时配合方程式1（见材料和方法）使用来自12 HN交叉峰的化学位移扰动给出了K（K）_D类55±4μM的值(图3B).

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图3。

兔亲素3A C2A结构域的IP3-结合模式。(A类)残留物¹H（H）-¹⁵在2.75 mM IP3和5 mM Ca的存在下，N个交叉峰经历了显著的化学位移扰动²⁺映射在C2A域晶体结构上（PDB访问号2chd）。定义位点1的残留物被染成品红色；确定位点2的残基用蓝色表示。(B类)在5 mM Ca存在下进行IP3滴定时，对来自IP3结合位点1的12个残基主链HN交叉峰的化学位移扰动进行同步拟合²⁺使用方程式1（见材料和方法）。(C类)在5 mM Ca存在下IP3滴定时，对四个残基主链HN交叉峰的化学位移扰动进行同步拟合²⁺使用方程式2（见材料和方法）。这些残基对应于第二个IP3结合位点（位点2）。

主要位于CBL2和CBL1（位置2）残基的HN交叉峰的第二个子集(图3A)与位于核心结构域（位置1）凹侧的残基相比，IP3结合的影响不同。实际上，CBL2上残基N443和T444以及CBL1上G416和L417的IP3-结合(图3C)由S形曲线描述。与站点1残留物的结合曲线相比，50%结合对应的IP3浓度更高。残基G416、L417（CBL1）、N443和T444（CBL2）的交叉峰的化学位移扰动的同时拟合使用方程式2（见材料和方法），考虑到第一个位点结合耗尽的自由配体浓度，给出了一个K（K）_D类540±45μM(图3C). 这些观察结果表明第二个低亲和力IP3结合位点（定义为位点2），涉及位于CBL2和CBL1上的残基(图3A). 由于这两个站点在拓扑上彼此接近，IP3绑定中可能会发生协作。为了探索这一点，对与位点1残基对应的结合曲线进行了拟合方程式3。拟合数据与使用方程式1Hill系数为0.95±0.02，表明两个站点之间没有合作性。

钙²⁺IP3绑定对C2A域的依赖性

研究钙之间可能的协同作用²⁺在不添加Ca的情况下，我们对C2A结构域进行了IP3滴定²⁺到缓冲区。在约10 mM IP3时达到饱和(图4A). 受影响残留物与方程式1适用于除K423、L427和L468之外的所有残留物，这些残留物在IP3浓度很高的情况下可能会产生副作用(图3A). 对其他受影响的残留物进行拟合，得到K（K）_D类800±50μM，表明在没有Ca的情况下²⁺C2A结构域的亲和力大约是饱和钙浓度下的16倍²⁺这表明Ca²⁺促进IP3绑定。接下来，我们执行了一个Ca²⁺在饱和（10 mM）IP3条件下滴定(图4B). 受影响残留物的同时拟合使用方程式3（参见材料和方法）导致K（K）_D类320±9μM，Hill系数为1.49±0.04，表明Ca的协同性有限下降²⁺-在IP3饱和的情况下结合。Ca公司²⁺在这些条件下亲和力增加了三倍。这些数据表明，尽管IP3的内在亲和力较低，但它能够促进钙的补充²⁺揭示了钙之间的协同作用²⁺和IP3结合到兔亲素3A的C2A结构域。

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图4。

钙²⁺IP3绑定到C2A域的依赖性。(A类)在不添加Ca的情况下，对IP3滴定时IP3结合位点1的10个残基主链HN交叉峰的化学位移扰动进行同步拟合²⁺缓冲区使用方程式1（见材料和方法）。(B类)根据Ca对七个残基主链HN交叉峰的化学位移扰动进行同步拟合²⁺使用希尔方程的浓度(方程式3; 见材料和方法）。

IP3-绑定到C2B域

接下来，使用IP3来探索兔亲素3A的C2B结构域如何与PIP2头组结合。存在1 mM Ca时²⁺，一个¹⁵N个-¹基于H HSQC的IP3滴定显示C2B域光谱中有限数量的交叉峰发生了化学位移扰动(图5A)，与PS相反(^{Montaville等人，2007年}). 与C2A结构域类似，所有受影响的残基都位于C2B结构域的凹面基槽中。然而，IP3结合不仅影响β链3和4的残基，也影响β链6和7的残基(图5B). 出乎意料的是，位于兔非蛋白3A C末端尾部的极性残基，即His 680、Ser 682和Ser 683，出现了最强的位移。这个C末端尾部（Q674–D684）被认为是柔性的，因为它的大部分不包括在C2B结构域的核磁共振结构中(^{Ubach等人，1999年})这些残基在晶体结构中也不是有序的(^{Montaville等人，2007年})此域的。值得注意的是，E678位于β链7附近的两个结构中，使最后的柔性残基朝向C2B结构域的凹侧（补充图1）。因此，对位于β-链7上的残基观察到的化学位移扰动可能是受到强烈影响的C末端尾部残基对IP3结合的间接影响。IP3与核心结构域残基的相互作用发生在快速交换速率的时间尺度上，表明亲和力相当低，这在没有膜界面的情况下是可以预期的。对于这些残留物，根据IP3总浓度绘制的化学位移偏差可以用单一结合位点模型进行拟合(方程式1;图5C). 通过同时拟合11个残基的化学位移扰动（参见图5C)直接或间接参与IP3绑定。

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图5。

兔亲素3A C2B结构域的IP3-结合模式。(A类)¹H（H）-¹⁵N在1 mM Ca存在下添加4.3 mM IP3后，根据C2B结构域片段（519–684）序列绘制的化学位移扰动δΔ（见材料和方法）²⁺.参与结合的二级结构元素，β-链3、4、6和7，Ca²⁺-绑定回路3和C端子尾部突出显示在顶部. (B类)残留物¹H（H）-¹⁵在IP3滴定时大于0.07ppm的N个化学位移扰动被映射到C2B晶体结构上（PDB登录号2cm6，链B）。(C类)根据IP3浓度对11个残基主链HN交叉峰的化学位移扰动进行同步拟合，使用方程式1（见材料和方法）。

钙存在和不存在时IP3-结合C2B结构域光谱的叠加²⁺表明，即使在没有钙的情况下，参与IP3结合的残基的交叉峰也能保持IP3结合²⁺(图6)，表示IP3-结合不依赖于Ca²⁺-绑定。为了验证IP3在C2B结构域上探测PIP2结合位点的应用，我们使用亚微米浓度的1,2-二辛醇-PIP2（DOPIP2）。单体DOPIP2诱导的HN峰间位移对应于中等IP3浓度促进的同一组残基的化学位移扰动（数据未显示）。

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图6。

钙²⁺-独立IP3绑定到C2B域。区域的覆盖¹H（H）-¹⁵N HSQC C2B域谱。红色共振对应于Ca²⁺-结合C2B结构域（1 mM Ca²⁺)，Ca的蓝色共振²⁺游离C2B结构域（10 mM EGTA），与Ca的品红色共振²⁺-和IP3结合的C2B结构域（1 mM Ca²⁺，4 mM IP3）和Ca的青色共振²⁺自由，IP3绑定C2B域（10 mM EGTA，4 mM IP3）。黑色箭头表示交叉峰（Ca）的化学位移偏差²⁺自由和绑定）。

C2A域-PIP2对接模型

到目前为止，还没有获得PIP2头基配合物中C2结构域的核磁共振或晶体结构。此外，常规方法的核磁共振结构研究，如RDC或分子间NOE的测量，由于C2结构域和IP3之间的低亲和力而受到阻碍。此外，由于IP3分子的质子密度低（只有五个质子位于糖环中），使用特定的核磁共振方法来研究低亲和力络合物，如STD或Tr-NOESY实验，受到影响。在这些情况下，化学位移图是唯一可用的直接结构信息。它不允许区分活性（直接配体相互作用）和被动（无直接配体交互作用）残基。因此，使用特定的对接协议可能有助于识别积极参与结合过程的残基，即使它不能完全解决化学位移映射数据的固有模糊性。HADDOCK是一种强大的对接方法，它利用模糊的实验数据来驱动对接计算(^{Dominguez等人，2003年}). 由于在IP3结合时对兔亲素3A C2A结构域进行了化学位移映射，因此很容易使用这些数据生成C2A结构区与PIP2复合物的模型。该模型提供了一个相当明确的相对蛋白质-配体定位和定向。在C2A/PIP2综合体中(图7A、B)PIP2垂直指向β片的凹面，类似于其与PKCαC2结构域的相互作用(^{Guerrero-Valero等人，2007年}). 对接模型(图7B)表明位于β-链3和4上的碱性残基直接参与配体结合。类似地，这些基本残基在PKCαC2结构域中保守，并且对于该C2结构域与PIP2的相互作用至关重要(^{Rodríguez-Alfaro等人，2004年;Evans等人，2006年}).

核磁共振测量

核磁共振实验是使用DRX 700 MHz Bruker光谱仪进行的，该光谱仪配有298K下的TXI 3轴梯度探针。使用NMRPipe/NMRDraw处理所有光谱(^{Delaglio等人，1995年})和Sparky一起分析(http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/). 使用来自Calbiochem的D-myo-Inostol-1,4,5-三磷酸（IP3）进行¹⁵N个-¹H基于HSQC的滴定。甘油磷酸丝氨酸是根据专利WO/05024进行化学合成的，1,2-二辛酰基PIP2（DOPIP2）是从Avanti Polar Lipids购买的。HN交叉峰的赋值取自C2A域的BMRB条目6787(^{Montaville等人，2006年})C2B域的BMRB条目4360(^{Ubach等人，1999年}).

装配程序

用钙评价标记C2结构域的滴定实验²⁺和IP3，根据配体浓度绘制了受显著影响的残基的化学位移偏差。使用Igor Pro（Wavemetrics，Inc.）和以下等式进行同步拟合。单结合位点模型(^{Auguin等人，2004年}):

其中[铂], [书信电报],K（K）_D类、和B类 _最大值分别是总蛋白质浓度、配体浓度、离解常数和饱和时的化学位移偏差。

为了在第二结合位点的残基的IP3滴定中拟合HN化学位移扰动，该残基的亲和力低于第一结合位点，必须调整总配体浓度，以考虑高亲和力结合位点中配体的结合：

哪里

和[铂], [书信电报],K（K）_{D类 1},K（K）_{D类 2}、和B类 _最大值分别是总蛋白浓度、配体浓度、第一位点的离解常数（高亲和力）、第二位点的离合常数（低亲和力）和饱和时的化学位移偏差。A类表示结合到高亲和力结合位点的配体浓度，根据方程式1。因此[书信电报]-A类是亲和力较低的结合位点所经历的总配体浓度。

对于协同结合模型，在Hill方程中使用总配体浓度来计算游离配体浓度：

其中[铂], [书信电报],K（K）_达普,n个、和B类 _最大值分别是总蛋白质浓度、配体浓度、总离解常数、希尔系数和饱和时的化学位移偏差。

我们感谢卡米拉·萨巴赫的技术帮助，感谢克里斯蒂安·格里辛格的有益讨论和慷慨支持。M.Z.获得了DFG海森堡拨款（ZW 71/2-1和3-1）的支持。这项工作也得到了马克斯·普朗克学会的支持。