N个[3-（4′-氟苯基）-3-（4′苯氧基）丙基]肌氨酸（NFPS）是甘氨酸转运的选择性持久抑制剂

摘要

介绍

氨基酸甘氨酸是谷氨酸受体NMDA亚型与谷氨酸的协同激动剂(McBain&Mayer，1994年). GLYT1亚型甘氨酸转运体与NMDA受体共定位，被认为调节兴奋性突触的甘氨酸浓度。甘氨酸转运蛋白是Na⁺/氯离子⁻神经递质转运体的依赖性家族(阿马拉和库哈尔，1993年)已鉴定出来自两个不同基因的六种甘氨酸转运体亚型。GLYT1有四种亚型，GLYT2有两种亚型(瓜斯泰拉等., 1992;汉利等., 2000;基姆等., 1994;刘等., 1992;1993;蓬斯等., 1998;史密斯等., 1992). GLYT1亚型具有2Na离子通量耦合的化学计量比⁺：1Cl⁻：1甘氨酸(阿拉贡等., 1987)，由此可以计算平衡甘氨酸浓度。在标准离子条件下，细胞外甘氨酸的平衡浓度预计为150 n个M（M）(阿特维尔等., 1993). 欧盟委员会₅₀据报道，甘氨酸与NMDA受体甘氨酸位点结合的值在0.2范围内 – 1.7 μM（M）针对各种NMDA受体亚型(Hollmann和Heinemann，1994年;McBain&Mayer，1994年). 如果静止甘氨酸浓度低至150 n个M（M）则转运体活性的变化将导致细胞外甘氨酸的波动，并且考虑到EC的变化₅₀NMDA受体的甘氨酸活化值，以及NMDA受体亚型选择性调节的预期值。在最近一项使用新型甘氨酸转运阻断剂的研究中，N个[3-（4′-氟苯基）-3-（4′苯氧基）丙基]肌氨酸（NFPS）(图1) (贝杰隆等., 1998)抑制甘氨酸摄取增强了谷氨酸能EPSCs NMDA成分的振幅。这表明甘氨酸转运受阻导致细胞外甘氨酸浓度升高和NMDA受体活性增强，这意味着甘氨酸转运蛋白将含有NMDA受体的突触局部区域的甘氨酸水平维持在亚饱和水平。

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图1

NFPS的结构。肌氨酸是甘氨酸的N-甲基化衍生物，是GLYT1的竞争性底物抑制剂，但不是GLYT2转运体。NFPS由一个大的亲脂尾和一个肌氨酸头部组组成。

在本研究中，我们研究了NFPS对甘氨酸转运蛋白GLYT1亚型的作用机制，以及与甘氨酸转运蛋白GLYT2a亚型相比其作用的选择性程度。NFPS由甘氨酸的N-甲基衍生物、肌氨酸组成，带有一个大的疏水基团。肌氨酸是甘氨酸转运体GLYT1亚型的底物，但不是GLYT2转运体(Supplisson&Bergman，1997年). 可以预测，转运体亚型之间底物选择性的这种差异可能为GLYT1亚型相对于GLYT2亚型甘氨酸转运体的NFPS选择性提供分子基础。NFPS也有一个大的疏水基团连接到肌氨酸部分。对于其他神经递质转运抑制剂来说，化合物的大小是决定该化合物是竞争性底物还是非转运性抑制剂的一个非常重要的因素(岛本等., 1998). 在本研究中，我们研究了NFPS对甘氨酸转运体作用机制的多个方面，这将为理解这种具有潜在治疗作用的抗精神病药物的药理作用提供基础，也可以更好地理解甘氨酸转运体在调节突触NMDA受体活性中的作用。

方法

结果

NFPS是GLYT1的选择性阻断剂

高亲和力甘氨酸转运体1（GLYT1）对甘氨酸的摄取伴随着两个钠的共转运⁺离子和一个Cl⁻离子(阿拉贡等., 1987;Roux&Supplisson，2000年)导致每个甘氨酸分子净转移一个正电荷。甘氨酸在表达甘氨酸转运体GLYT1b亚型的卵母细胞中的应用，电压钳制在−60 mV，导致具有EC的剂量依赖性内向电流₅₀20±4 μM（M）(奥布里等., 2000). 100的共同应用 μM（M）甘氨酸与300 n个M（M）NFPS导致向内电流逐渐减少69±4%(n个=10）3后抑制 最小值(图2a). 仅应用NFPS不会产生电流，这表明NFPS不是GLYT1b的可运输抑制剂。300的共同应用 n个M（M）NFPS与30 μM（M）甘氨酸3 与应用NFPS前的甘氨酸电流相比，表达GLYT1a或GLYT1c的卵母细胞在min时分别产生66±5%和77±3%的抑制。这些结果表明，NFPS对甘氨酸转运体的所有GLYT1亚型的作用速度相当(图2c). 与GLYT1亚型相比，应用最多1种 μM（M）表达GLYT2a的卵母细胞的NFPS对甘氨酸转运电流没有影响(图2b). 因此，NFPS似乎是GLYT1甘氨酸转运体的选择性抑制剂。在以下实验中，我们更详细地描述了NFPS对GLYT1b甘氨酸转运体的作用机制。

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图2

NFPS是甘氨酸转运蛋白GLYT1亚型的选择性阻断剂。表达GLYT1b（a）和GLYT2a（b）的卵母细胞的代表性痕迹电压钳制在−60 mV.100μM（M）首先使用甘氨酸（实心棒），然后在冲洗后使用，100 μM（M）甘氨酸（实心棒）和300 n个M（M）NFPS（开放式酒吧）共申请3次 min.再过10分钟 无药缓冲液中的最小输液量，300 n个M（M）仅应用NFPS（开放栏）。在表达GLYT2a（b）的卵母细胞中30 μM（M）甘氨酸和300 n个M（M）在控制剂量的甘氨酸（30 μM（M）). 在未注射的卵母细胞中，甘氨酸和NFPS一起或单独应用都不会产生电流。（c） NFPS同样抑制其他GLYT1转运体亚型。30μM（M）甘氨酸和300 n个M（M）如上所述，NFPS用于表达GLYT1a、b和c以及GLYT2a的卵母细胞，3天后测量抑制率 NFPS最小风险敞口。使用Kruskal-Wallis检验进行统计分析。重要性(P（P）⩽0.05）用*表示。

在甘氨酸转运电流达到峰值之前，NFPS对甘氨酸转运流的抑制不会变得明显（参见图2a). 这可能表明NFPS在抑制转运之前需要转运蛋白的活性状态。我们首先将表达GLYT1b的卵母细胞暴露于30 μM（M）甘氨酸以测量控制传输电流，然后冲洗甘氨酸。然后将卵母细胞暴露于300、100或30 n个M（M）无甘氨酸条件下的NFPS 3 分钟，然后洗2次 min。随后单独使用甘氨酸导致传输电流降低76±6%(n个=3) (图3a); 41±6% (n个=5）和22±3%(n个=3），与应用NFPS之前测量的甘氨酸转运电流相比。这表明，首先，甘氨酸转运体不必处于激活状态，阻滞剂才会有效，其次，NFPS从浴液中洗脱后抑制作用仍然明显。GLYT1b对甘氨酸的结合和转运依赖于钠的存在⁺和Cl⁻离子(阿拉贡等., 1987)因此，我们研究了NFPS与GLYT1b结合需要Na的可能性⁺或Cl⁻首先将甘氨酸应用于在正常蛙环肌缓冲液中表达GLYT1b的卵母细胞，以测量对照反应，在甘氨酸冲洗后，将缓冲液切换为Na⁺游离缓冲液（胆碱替代）或Cl⁻游离缓冲液（葡萄糖酸盐替代），然后是300、100或30 n个M（M）NFPS申请3 分钟。将NFPS从浴液中洗出，然后返回到正常蛙鸣缓冲液中，重新施用甘氨酸。甘氨酸转运电流减少了87±10%(n个=3); 40±1% (n个=3）和30±3%(n个=4）分别在胆碱替代缓冲液和92±11%(n个=3); 45±3% (n个=4）和24±4%(n个=6）分别在葡萄糖酸盐替代缓冲液中，与应用NFPS之前观察到的电流相比。Na中每种NFPS剂量的抑制水平没有显著差异⁺或Cl⁻替代缓冲液，与相同剂量的NFPS在正常蛙鸣液中的抑制作用进行比较（Kruskal-Wallis试验）。这表明与GLYT1b结合的NFPS不需要Na的存在⁺或Cl⁻进一步表明，甘氨酸转运体不需要处于活性构象才能结合NFPS。

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图3

与GLYT1b结合的NFPS不需要甘氨酸、钠⁺或Cl⁻.表达GLYT1b电压钳制于−60的代表性卵母细胞的电流迹线 毫伏（a）。在正常蛙式振铃器缓冲区中，30 μM（M）首先应用甘氨酸（固体棒），然后在青蛙振铃器中冲洗。三百牛顿M（M）然后单独应用NFPS 3次 分钟（开放酒吧），然后是一个清洗期的无毒蛙铃声。30μM（M）然后重新施用甘氨酸（固体棒）。（b） 实验在胆碱替代钠中进行⁺游离缓冲液或葡萄糖酸盐取代氯⁻释放缓冲区。使用30后 μM（M）甘氨酸用于测量控制响应，切换镀液并使其平衡2 300、100或30之前的最小值 n个M（M）NFPS申请了3次 1分钟后 离子替代缓冲液中NFPS的最小冲洗时间，缓冲液切换回标准蛙式振铃器缓冲液，30 μM（M）重新涂抹甘氨酸。介绍了三种NFPS处理后甘氨酸转运电流的抑制百分比。Na的缺失⁺或Cl⁻没有显著改变任何治疗的抑制水平（Kruskal-Wallis试验）。

NFPS对^三测量GLYT1b对H-甘氨酸的摄取，以确认甘氨酸转运电流的减少反映了甘氨酸转运速率的降低。未注射的卵母细胞（每皿五个）和表达GLYT1b的卵母公司（每皿5个）与30个 μM（M） ^三H-甘氨酸在室温下保持10 三种不同条件下的min。首先，10之后 卵母细胞与1的min预孵育 μM（M）NFPS，第二个，增加1个 μM（M）NFPS同时^三H-甘氨酸，第三，在不存在NFPS的情况下(图4). 未注射的卵母细胞显示低水平的^三H-甘氨酸摄取，不受NFPS存在的影响（预培养或联合应用）。在表达GLYT1b的卵母细胞中，^三与未注射的卵母细胞和用1 μM（M）10的NFPS min，摄取水平显著降低（Kruskal-Wallis试验后进行Dunns试验），达到未注射卵母细胞的水平。在卵母细胞中1 μM（M）NFPS和30 μM（M） ^三与预先孵育的卵母细胞相比，H-甘氨酸的联合应用降低了抑制程度，但这种降低没有达到显著性。这些观察结果与NFPS阻断传输电流的传输电流测量结果一致，并且抑制的开始是缓慢和渐进的，在10 这个实验的分钟数。

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图4

NFPS抑制^三表达GLYT1b的卵母细胞对H-甘氨酸的摄取。^三如方法所述，测量未注射卵母细胞（C1、2和3）和表达GLYT1b的卵母细胞的H-甘氨酸摄取。C1和T1:30 μM（M） ^三仅含H-甘氨酸。C2和T2:30 μM（M） ^三H-甘氨酸和1 μM（M）NFPS。C3和T3 30 μM（M） ^三H-甘氨酸和1 μM（M）10后的NFPS min预孵育1 μM（M）NFPS。在每种情况下，结果均为五个卵母细胞的平均值±标准偏差平均值，然后使用Kruskal-Wallis和Dunns检验来评估统计显著性。P（P）⩽0.05用*表示。

肌氨酸是GLYT1的替代底物，但不是GLYT2甘氨酸转运体(瓜斯泰拉等., 1992;基姆等., 1994)当作用于表达GLYT1电压钳制在−60时的卵母细胞时，产生剂量依赖性电流 mV.考虑到NFPS(图1)我们假设NFPS对GLYT1的选择性是由于NFPS的肌氨酸部分与GLYT1上的甘氨酸结合位点的相互作用。为了验证这个假设，将表达GLYT1的卵母细胞暴露在30的控制剂量下 μM（M）甘氨酸，在a 2之后 分钟洗涤-将细胞暴露于30或300 n个M（M）0、30或3000的NFPS μM（M）甘氨酸3次 最小值(图5)研究增加底物浓度是否可以保护GLYT1免受NFPS的抑制。NFPS和甘氨酸被冲洗5次 30分钟前 μM（M）再次施加甘氨酸，并与对照甘氨酸电流进行比较。在30或300人在场的情况下 n个M（M）仅NFPS，甘氨酸电流被抑制22±3%(n个=8）和76±6%(n个=3），与对照组相比。暴露于30后 n个M（M）NFPS以及30或3000 μM（M）甘氨酸转运电流降低28±2%(n个=3）和22±2%(n个=3），暴露于300后 n个M（M）NFPS以及30或3000 μM（M）甘氨酸，转运电流降低72±2%(n个=3）和71±1%(n个=3）。显然，在甘氨酸存在的情况下，这两种剂量的NFPS的抑制程度没有显著变化（Kruskal-Wallis试验），这表明在这些条件下，甘氨酸对NFPS的作用没有任何显著的保护作用。使用肌氨酸而非甘氨酸保护GLYT1b免受NFPS结合的类似实验并没有改变NFPS的抑制程度。甘氨酸缺乏保护可能是由于转运蛋白处于活性状态，并且在完成转运循环后，NFPS可能会接触到底物结合位点，从而消除甘氨酸的保护作用。为了确保GLYT1转运体不处于可能暂时暴露甘氨酸结合位点的活性状态，在没有Na的情况下按照类似方案进行了进一步的实验⁺和Cl⁻（在胆碱或葡萄糖酸盐替代的缓冲液中）以防止运输。细胞在相关缓冲液和300 n个M（M）NFPS申请了3次 在存在饱和肌氨酸的情况下为min。在这些条件下，NFPS的抑制作用仍然没有显著改变（Kruskal-Wallis试验，数据未显示）。这些实验表明，甘氨酸或肌氨酸在这些条件下不能对NFPS提供任何保护。

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图5

NFPS不与甘氨酸竞争甘氨酸结合位点。30感应的控制电流 μM（M）在表达GLYT1b的卵母细胞中测量甘氨酸，电压固定在−60 mV.三百或30 n个M（M）NFPS与0、30或3000共同应用 μM（M）甘氨酸3 分钟，然后是5 最小冲刷。30μM（M）再次应用甘氨酸并与控制电流进行比较。抑制程度为300（a）或30 n个M（M）（b） 3之后的NFPS 在0、30或3000的情况下，min应用没有显著改变 μM（M）甘氨酸（Kruskal-Wallis试验）。

NFPS是GLYT1b的持续抑制剂

在图2a与对照值相比，从浴液中洗脱NFPS后，甘氨酸转运电流降低了69±4%，这表明从浴液去除NFPS后抑制作用持续存在。进一步调查了这一观察结果(图6a)首先施加10的控制剂量 μM（M）甘氨酸和运输电流达到峰值时(图6a，点1）300 n个M（M）添加了NFPS。3之后 甘氨酸和NFPS暴露min后，NFPS被去除，甘氨酸转运电流重新建立（第2点）。在2之后 用正常蛙铃溶液最少冲洗甘氨酸，重复使用10 μM（M）与对照值相比，甘氨酸单独诱导了类似的降低电流（第3点(n个=6,图6b)（Kruskal-Wallis测试）。这种减小的电流在90秒内保持稳定 NFPS冲洗后min（数据未显示）。我们通过将一批表达GLYT1b的卵母细胞与1 μM（M）10的NFPS 在接下来的3天里，每天至少更换5次蛙鸣缓冲液，重复清洗卵母细胞。在单次NFPS施用后的3天内测量甘氨酸转运电流。3天后，甘氨酸转运电流略有恢复，可能是由于产生了新的转运蛋白，但没有恢复到从表达GLYT1但未经NFPS处理的同一批卵母细胞测得的控制电流(图7a)（学生的t吨-测试）。

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图6

NFPS是一种明显的不可逆抑制剂。（a） 表达GLYT1b电压钳制在−60的卵母细胞的代表性电流轨迹 mV。控制后（10 μM（M）)甘氨酸反应 μM（M）)重新施加，直到电流达到最大响应（点1），然后共同施加300 n个M（M）NFPS。三分钟后，NFPS被洗出浴缸，但仍有10人在场 μM（M）甘氨酸（第2点）。甘氨酸洗脱5次后 最小值，10 μM（M）重新涂抹甘氨酸（第3点）。随后施加10产生的电流 μM（M）甘氨酸高达90 min后保持相同且显著的抑制（Kruskal-Wallis试验）。（b） 应用10的当前响应 μM（M）在指示点（1）测量甘氨酸 – 3） 并用条形图表示(n个=6). 重要性(P（P）⩽0.05）用*表示。

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图7

NFPS与卵母细胞膜相互作用。（a） 表达GLYT1b的卵母细胞暴露于1 μM（M）10的NFPS min，然后在接下来的3天里每天至少清洗三次。在NFPS暴露后1、2和3天，测量卵母细胞的甘氨酸转运电流，并与未暴露卵母细胞进行比较（Student’st吨-测试）。在第1天和第2天，电流被显著抑制，但在第3天，可变性很高，尽管降低了，但这种降低并没有达到显著性。数据表示平均值±s.e.mean，n个⩾3适用于每种情况。（b） 注射GLYT1b cRNA后，立即按指定剂量将NFPS应用于卵母细胞10 min，然后在标准缓冲液中进行大量清洗。3天后测量甘氨酸转运电流，并与未暴露的卵母细胞进行比较。数据为平均值±标准平均值，n个=每种情况下为3。（c） 类似的协议图7b使用了，除了1 μM（M）NFPS申请了10次 最小值和30 注射cRNA后立即min。所示数据来自平均值±标准平均值，n个每种情况=10。对照实验也包括注射GLYT2a cRNA而不是GLYT1b，在每种情况下，NFPS对甘氨酸转运电流没有影响。使用Kruskal-Wallis检验和Dunns检验对b和c进行数据分析。重要性(P（P）⩽0.05）用*表示。

鉴于NFPS具有庞大的亲脂侧链，我们研究了NFPS是否通过并入脂质膜而产生抑制的不可逆性。将GLYT1b cRNA注入卵母细胞后，立即将卵母细胞暴露于1 μM（M），300或30 n个M（M）10的NFPS 至少在cRNA注射后约3天，GLYT1b才在卵母细胞的细胞表面表达，因此，如果NFPS确实与脂质膜的一种成分不可逆地结合，那么NFPS预表达引起的抑制应与在以下条件下观察到的抑制相当图7a.暴露于1 μM（M）10的NFPS 与对照组相比，min确实减少了GLYT1b介导的甘氨酸转运电流，但这种减少没有达到显著性（Kruskal-Wallis试验）(图7b). GLYT1b介导的甘氨酸转运电流在暴露于300 n个M（M）(n个=3）或30 n个M（M）(n个=3）与对照组相比，GLYT1b表达前的NFPS没有改变。然而，接触高剂量NFPS（1 μM（M）)较长时间（30 min）导致甘氨酸转运电流显著降低(图7c)（Kruskal-Wallis和Dunns检验），这与以下观察结果更具可比性3 最小接触低剂量NFPS（参见图2a). 这些结果表明，在没有转运蛋白的情况下，NFPS确实能够并入脂质膜，但所需的暴露时间和剂量明显大于先前所见的GLYT1b基本不可逆抑制所需的时间和剂量。因此，单靠NFPS/脂质双层相互作用不足以使NFPS永久存在于卵母细胞膜中。在对照实验中，卵母细胞注射GLYT2 cRNA并立即暴露于1 μM（M）NFPS用于30 至少三天后，甘氨酸转运电流与未经处理的细胞相比没有显著差异，这表明NFPS降低甘氨酸转运流对GLYT1亚型具有选择性，并且NFPS不会干扰细胞表面蛋白表达所需的细胞内机制。

NFPS长期抑制的另一种可能机制是它可能穿过细胞膜并作用于细胞内识别位点。这一观点也与NFPS作用开始相对缓慢的观察结果一致，也可以解释NFPS缺乏有效的冲洗作用。测量控制甘氨酸电流后，50 nL，共20个 μM（M）将NFPS注射到表达GLYT1b的卵母细胞的细胞质中。假设这会在细胞质内产生均匀分布的NFPS，并且卵母细胞的内部体积约为1 μl，NFPS的细胞内浓度约为1 μM（M）然而，甘氨酸转运电流，测量值高达15 分钟后，不受细胞质中NFPS的影响(图8). 随后共同申请30 μM（M）甘氨酸和1 μM（M）NFPS对细胞外浴溶液造成缓慢起效和不可逆抑制。这些结果表明，NFPS的作用位点不能从细胞质中获得。

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图8

当注射到卵母细胞的细胞质中时，NFPS不抑制转运。表达GLYT1b电压钳制于−60的卵母细胞的代表性电流轨迹 mV。将电压钳电极插入卵母细胞后，用一根含有20个 μM（M）NFPS插入卵母细胞。控制电流响应30 μM（M）测量甘氨酸（实心棒），然后测量50 nL，共20个 μM（M）将NFPS注入卵母细胞（箭头所示）。基线电流稳定后，30 μM（M）再次施加甘氨酸（实心棒）并测量电流。甘氨酸洗脱后，30 μM（M）甘氨酸（实心棒）和1 μM（M）NFPS（开条）共同应用于镀液中。

GLYT1的NFPS抑制的剂量依赖性时间过程见图950%抑制所需时间（t_1/2)30产生的电流 μM（M）甘氨酸是NFPS浓度的函数。该图表明高剂量下的抑制率（1 μM（M）)相当快（t_1/2=58±10 s） 然后以较低剂量（t_1/2(10 n个M（M）)=904±90 s） ●●●●。虽然剂量较低（<10 n个M（M）)可能在抑制转运方面有效，卵母细胞不能在达到50%抑制所需的时间内保持足够稳定。由于我们无法测量NFPS/GLYT1相互作用的关闭率，因此无法对这种抑制进行进一步的动力学分析。

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图9

NFPS以时间和剂量依赖的方式抑制GLYT1b。卵母细胞内电压钳制在−60 mV a对照甘氨酸（30 μM（M）)电流首次建立。然后是NFPS，剂量从10到1000 n个M（M），与30人共同申请 μM（M）甘氨酸。允许抑制持续，直到电流减少到对照甘氨酸电流的一半，并测量达到完全抑制一半所需的时间（t_1/2). 数据表示平均值±标准平均值n个=每NFPS剂量5。

讨论

甘氨酸转运体的GLYT1和GLYT2亚型在底物选择性方面存在差异，基于此，很容易推测NFPS的肌氨酸部分是甘氨酸转运体的GLY T1和GLYT2a亚型之间产生选择性的原因。然而，我们没有发现支持这一观点的证据。甘氨酸或肌氨酸不会与NFPS竞争，也不会对NFPS运输抑制提供任何保护（有关这一点的更多讨论，请参阅后面的部分）。我们还表明，NFPS从浴溶液中洗脱后，运输抑制仍然存在。因此，我们必须得出结论，NFPS是GLYT1b的非竞争性、持久性抑制剂。这些观察结果提出了许多问题，例如NFPS如何与转运蛋白结合，以及转运蛋白功能持续抑制的基础是什么？虽然我们的研究主要集中在GLYT1b亚型，但预计这些结果可以推广到其他GLYT1亚型。

NFPS不包含任何可能在生理条件下与转运蛋白形成共价键的反应基团，但它确实能够与脂质双层和蛋白质形成多重范德华相互作用和氢键，从而形成高度稳定的复合物。浓度（10 n个M（M） – 1 μM（M）)如果没有甘氨酸转运体，我们在这些实验中使用的NFPS暴露时间似乎不会不可逆地并入脂质膜(图7b)然而，在表达转运体的卵母细胞中，浓度更高，暴露时间更长（1 μM（M）对于30 最小值，图7c)NFPS在细胞膜中停留至少3天，浓度足以抑制转运。这些结果表明，NFPS确实具有并入膜的能力。运输抑制的低浓度和较短暴露时间表明，在GLYT1的存在下，NFPS并入膜可能会稳定。因此，我们提出了NFPS和GLYT1之间的以下相互作用。NFPS可能有两种相互作用模式，第一种是非特异性并入脂质双层，第二种是与GLYT1蛋白的特异性相互作用。脂质双层可为NFPS提供一个“汇”，长期暴露可使NFPS累积到显著更高的浓度，从而有效增加可用于与膜蛋白相互作用的浓度。在没有GLYT1的情况下，NFPS可能会被冲洗掉或通过膜翻转被清除，但在有GLYT1.的情况下膜中现成可用的NFPS会特别结合通过一个脂类易接近的位点，与GLYT1具有高亲和力。甘氨酸或肌氨酸对NFPS位点缺乏保护，表明GLYT1上的NFPS位点不同于底物结合/移位位点。然而，对这个实验的另一种解释是应用30或300 n个M（M）NFPS到3个单元格 在饱和甘氨酸（或肌氨酸）剂量下，min导致NFPS仅并入脂质双层，而不与转运蛋白结合。NFPS和甘氨酸从浴液中洗脱后，仍在膜中的NFPS可能会通过膜扩散，并与转运体上的甘氨酸结合位点结合，抑制随后的转运体活性。为了更全面地测试这一想法，需要一个快速流动系统，其中溶液的快速切换可能有助于澄清这两个过程的动力学，以及底物的存在是否会减缓NFPS与GLYT1的特异性结合速率。无论GLYT1特异性抑制的分子基础的性质如何，高亲和力特异性相互作用与易于获得的抑制剂来源相结合，而抑制剂来源只是缓慢地被洗掉，这将导致明显的不可逆相互作用。

在本研究中，我们利用了爪蟾卵母细胞表达系统，并且根据NFPS抑制甘氨酸转运的拟议作用机制，一个重要的问题是，本研究获得的结果是否可以外推到其他细胞表达系统以及体内准备工作。阿特金森等.（已提交）已报告50 n个M（M）NFPS对鹌鹑成纤维细胞中表达的GLYT1c也有类似的长期抑制作用。该组检测到甘氨酸转运体功能恢复非常缓慢，13天后恢复50% h冲洗。这一观察结果可能反映了NFPS与甘氨酸转运体的解离非常缓慢，或者所观察到的甘氨酸摄取的恢复也可能是由于与GLYT1结合的NFPS被隔离到细胞中，以及新的转运体蛋白在细胞表面的合成和表达。如控制测量中观察到的图7a，GLYT1蛋白在细胞膜中的周转率爪蟾卵母细胞在3天内没有明显增加。在这方面，我们的结果可能与鹌鹑成纤维细胞中GLYT1的表达不同。这种差异可以解释本研究结果与阿特金森研究结果之间的明显差异等.（已提交）。贝杰隆等. (1998)，报道称，在大鼠海马中，NFPS对甘氨酸转运的影响在其全细胞膜片钳记录期间似乎是可逆的。在现阶段，这些差异背后的原因尚不清楚，但根据本文和Atkinson的结果等.（已提交）切片制备中NFPS作用的可逆性值得进一步研究

NFPS抑制甘氨酸转运的拟议作用机制与xanomeline对M1毒蕈碱受体的作用机制类似(赫里斯托普洛斯等1998年;1999)以及沙美特罗对β肾上腺素能受体的刺激(安德森等., 1994;罗德斯等., 1992). 这些药物在广泛洗脱后表现出持续的受体刺激，结合两种相互作用模式的模型也被用来解释这一现象。第一种模式涉及与经典激动剂结合位点的可逆水相相互作用，第二种模式涉及对第二个位点的持续附着。二级位点的性质尚未确定，一种可能性是，脂质双层可能为药物提供“汇”，因此从脂质膜扩散的速度较慢可能会降低药物的有效脱靶率，或者脂质双层可能是二级位点。

精神分裂症的假定机制之一是NMDA受体活性降低，并且，由于甘氨酸是NMDA接收器的一种必要的协同激动剂，因此，甘氨酸浓度升高可能为治疗这种衰弱性疾病提供一种新的治疗策略(赫里斯科·列维等., 1999). 如果兴奋性突触内甘氨酸的静息浓度不足以饱和NMDA受体(伯杰等., 1998;Danysz&Parsons，1998年)那么，药物升高突触甘氨酸浓度可能会选择性地刺激NMDA受体(贝杰隆等1998年). NFPS具有以这种方式发挥作用的潜力，本研究的结果为理解NFPS的药理作用提供了基本框架。

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