MEKK2介导促进骨形成的替代性β-连环蛋白途径

MEKK2调节成骨细胞中β-连环蛋白的稳定性。

先前的一项研究报道，E3泛素连接酶SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶1（SMURF1）通过下调MEKK2介导的JNK-MAPK激活来抑制成骨细胞分化(8,17). 然而，与之前的观察相反，RNAi介导的MEKK2敲低降低了成骨细胞中JNK的活化(17)、JNK1和-2的磷酸化水平以及活性JNK调节的研究充分的转录靶点的表达，六月和Fos相关抗原1(第1帧) (18)，正常或轻微增加Mekk2型^−/−COB公司(图S2A类和B类). 此外，尽管SMURF1/MEKK2/JNK通路被描述为对体外成骨细胞中骨形态发生蛋白（BMP）刺激的反应至关重要(17)，对BMP的反应在Mekk2公司^−/−COB公司(图S2C类和D类). 因此，在所检测的条件下，MEKK2对于成骨细胞中的JNK活化是不必要的。因此，我们通过鉴定成熟成骨细胞中的MEKK2-相互作用蛋白，研究了MEKK2控制成骨细胞分化的替代机制。为了在具有矿化能力的成骨细胞的大体积均质培养中研究这些机制，我们在本研究中使用稳定表达WNT 10b的ST2成骨细胞系，通过激活WNT信号来驱动成骨细胞分化(19). 将表达WNT10b的ST2成骨细胞的裂解液与GST-MEKK2孵育后，用抗GST抗体偶联琼脂糖免疫沉淀GST-MEKK2结合蛋白，并对洗脱液进行质谱分析。该方法将成骨细胞分化的关键转录调控因子β-catenin确定为MEKK2的假定结合伙伴(图2A类). 这种相互作用通过与HEK293细胞中外源性表达蛋白和永生COB中内源性蛋白的共免疫沉淀得到证实(图2B类和C类). 此外，这种相互作用直接发生，不需要MEKK2激酶活性，纯化的WT和激酶ead（KD）MEK02与GST-β-catenin的共免疫沉淀证明了这一点(图2D类)。

在单独的窗口中打开

图2。

MEKK2增加β-catenin的稳定性。(A类)GST或GST-MEKK2与表达WNT10的ST2细胞的裂解物孵育，用抗GST抗体偶联的琼脂糖免疫沉淀，并用抗β-连环蛋白抗体免疫印迹。(B类)用载体或Flag–β-catenin和HA-MEKK2转染HEK293细胞，用抗Flag抗体偶联琼脂糖免疫沉淀裂解物，并对所示抗体进行免疫印迹。(C类)裂解COBs，用抗β-连环蛋白或IgG对照和蛋白G偶联的Dynabeads进行免疫沉淀，并用抗MEKK2抗体进行免疫印迹。(D类)GST-β-catenin与纯化的HA-MEKK2（WT或KD突变体）孵育，用抗GST抗体偶联琼脂糖免疫沉淀，并用指示的抗体免疫印迹。输入表示纯化HA-MEKK2的装载控制。(E类)用不同数量的MEKK2以及TOPflash-luciferase和雷尼利亚。转染48小时后测量荧光素酶活性，并将其归一化为雷尼利亚.P（P）单因素方差分析显示<0.01。(F类)主COB与Mekk2公司^+/+和Mekk2公司^−/−用TOPflash荧光素酶和雷尼利亚并在成骨细胞分化条件下培养6天。荧光素酶活性标准化为雷尼利亚. ***P（P）< 0.001. (G公司)用载体或HA-MEKK2（WT或KD突变体）以及Flag–β-catenin和EGFP转染HEK293细胞，并用所示抗体对裂解产物进行免疫印迹。EGFP作为转染对照。(H（H）)Mekk2型^+/+和Mekk2公司^−/−COB在成骨细胞分化条件下培养7或14天，用所示抗体印迹裂解产物。(我)1周龄胫骨β-catenin的免疫组织化学研究Mekk2公司^+/+和Mekk2公司^−/−老鼠。(J型)将载体或HA-MEKK2与Flag–β-catenin一起转染HEK293细胞，通过脉冲相标记法测定β-catentin的稳定性[³⁵S] 蛋氨酸然后放射自显影。(K（K）)以下菌株股骨BV/TV和皮质厚度的量化：Mekk2^+/+;Ctnnb公司^{飞行/飞行} (^+/+),Mekk2公司^+/−;Ctnnb公司^{飞行/飞行} (^+/+),Mekk2公司^+/+;Ctnnb公司^{佛罗里达州/+};Prx1型(^+/−)、和Mekk2公司^+/−;Ctnnb公司^{佛罗里达州/+};Prx1系列(^+/−)老鼠。(n个=每组5只小鼠）。在皮层厚度和BV/TV比较中，P（P）通过双向方差分析，两者均<0.05Mekk2公司和Ctnnb公司以及这些组之间的交互**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，Bonferroni修正学生t吨测验。

在单独的窗口中打开

图S2。

MEKK2对成骨细胞中JNK的激活和对BMP的反应是不可或缺的。(A类)主要COB从Mekk2公司^+/+和Mekk2型^−/−幼鼠，在成骨细胞分化条件下培养7d，并用所示抗体进行免疫印迹。(B类)或者，表示六月和第1帧通过RT-PCR分析。P（P）=N.S.，不显著。(C类和D类)原代COB在有或无100 ng/mL BMP2/7的成骨细胞分化条件下培养7天，通过ALP活性测定BMP诱导的成骨分化(C类)和ALP染色(D类). 在C类,P（P）=所有比较的N.SMekk2公司^+/+和相应的Mekk2公司^−/−样品。P（P）双向值t吨样品±BMP2/7的测试表明：***P（P）< 0.001.

为了确定这种相互作用的重要性，使用β-catenin应答报告基因分析MEKK2对β-catentin转录活性的影响。MEKK2的过度表达导致β-连环蛋白活性的剂量依赖性增加(图2E类)而β-catenin活性在原发性Mekk2型^−/−分化第7天的COB(图2F类). β-catenin活性的诱导需要MEKK2激酶活性(图S3A类); 含有激酶结构域的MEKK2的C末端片段足以增加β-catenin活性(图S3B类). MEKK2对β-catenin转录活性的影响反映了β-catentin蛋白丰度的变化，因为MEKK1的过度表达增加了β-catanin蛋白水平，而这种作用在KD MEK02突变株中消失(图2G公司). 同样，在Mekk2公司^−/−COBs、β-catenin蛋白水平在分化第7天时显著降低，而在分化第14天时几乎检测不到(图2H（H）). β-catenin水平的降低也在成骨细胞中观察到Mekk2公司^−/−长骨(图2我和图S3C类). MEKK2增加β-catenin水平的能力源于翻译后β-catentin稳定性的调节，因为β-catening转录水平不会因MEKK1的缺失而改变(图S3D类)β-catenin水平较低Mekk2公司^−/−通过蛋白酶体抑制剂MG132阻断β-catenin的蛋白酶体降解，可以挽救COB(图S3E类). 接下来，进行脉冲相分析，直接测试MEKK2稳定β-catenin的能力(图2J型和图S3F类). MEKK2的强制表达使β-连环蛋白的半衰期从~4.5小时增加到6小时，表明MEKK2是β-连环蛋白稳定性的正调节因子。最后，我们试图通过测试杂合子是否存在来确认这种效应的体内意义Mekk2公司-以及β-连环蛋白–空等位基因显示遗传相互作用。具有以下任一无效等位基因的小鼠Mekk2公司(Mekk2公司^+/−)或β-连环蛋白(β-连环蛋白^+/−)或两者兼而有之(Mekk2公司^+/−;β-连环蛋白^+/−)进行繁殖，并通过显微CT分析检测骨量(图2K（K）). 尽管两种基因的杂合性β-连环蛋白–或Mekk2公司-单独的null等位基因不足以使小鼠骨质疏松，两种基因杂合的小鼠小梁骨量减少了～50%。因此，Mekk2公司-以及β-连环蛋白–空等位基因显示正向上位相互作用，支持MEKK2对β-catenin稳定性的控制对体内骨量的调节至关重要的观点。

在单独的窗口中打开

图S3。

MEKK2调节β-catenin的活性和稳定性。(A类)用不同数量的MEKK2（KD）或MEKK1（WT）以及TOPflash-luciferase和雷尼利亚.转染48小时后测量荧光素酶活性，并将其归一化为雷尼利亚. (B类,上部)显示MEKK2截短突变体的图表。(下部)将MEKK2与TOPflash-luciferase和雷尼利亚.CT，C端子；FL，全长；NT、N端。(C类)1周龄胫骨β-catenin的免疫组织化学研究Mekk2公司^+/+和Mekk2型^−/−老鼠。（放大倍数：40×。）(D类和E类)主要COB从Mekk2型^+/+和Mekk2公司^−/−将幼崽和幼崽在成骨细胞分化条件下培养7d(D类)通过RT-PCR分析β-catenin的表达。(E类)用10μM MG132处理细胞8 h，并用抗β-连环蛋白抗体进行免疫印迹。(F类)将载体（vec）或HA-MEKK2与Flag–β-catenin一起转染HEK293细胞，并用脉冲相标记法测定β-catentin的稳定性[³⁵S] 蛋氨酸随后进行放射自显影和ImageJ分析。(G公司)质谱数据证明丝氨酸675是β-连环蛋白中MEKK2-介导磷酸化的位点。

MEKK2通过S675的磷酸化稳定β-连环蛋白。

因为调节β-连环蛋白的稳定性需要MEKK2激酶的活性，所以我们检测了MEK02磷酸化β-连环素的能力。使用纯化蛋白进行的体外激酶分析表明，MEKK2磷酸化GST–β-catenin，并且随着激酶激活突变，MEK02中的这种活性大大降低(图3A类). 为了确定磷酸化位点，使用Flag–β-catenin和HA-MEKK2（WT或KD突变）的联合免疫沉淀进行了磷酸化质谱分析。该研究确定丝氨酸675（人类{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“NP_001895.1”，“term_id”：“4503131”，“term_text”：“NP_0018951”}}NP_001895.1号p.Ser675，鼠标{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“NP_031640.1”，“term_id”：“6671684”，“term_text”：“NP_031640.2”}}NP_031640.1型p.Ser675）作为WT-MEK2而不是KD突变体的磷酸化位点(图S3G公司). 携带丝氨酸675突变为丙氨酸的β-连环蛋白（S675A）在很大程度上对MEKK2介导的磷酸化和MEKK2诱导的β-连环蛋白转录活性的增加都是难治的(图3B类和C类). 接下来，在补偿β-catenin S675A稳定性降低后，我们评估该结构是否对β-catentin转录活性有任何进一步影响。通过大幅增加Flag–β-catenin S675A的输入DNA量，WT和S675Aβ-catening的表达水平基本相当(图S4A类). 当出现同等蛋白水平时，S675A突变体显示出与WTβ-catenin相当的转录活性。因此，MEKK2介导的S675磷酸化对β-catenin活性的影响似乎仅限于蛋白质稳定性。为了评估S675磷酸化对成骨细胞分化过程中β-catenin稳定性的影响，通过慢病毒介导传递在原发性β-catentin缺乏的COB中重建Flag–β-catening（WT或S675A）(图3D类). 分化第7天，β-catenin（S675A）蛋白的稳定性与WTβ-catening相比显著降低。这种效应是翻译后失稳的结果，因为S675A的转录水平与WTβ-catenin的转录水平相当(图S4B类). 同样，在存在MEKK2的情况下，S675Aβ-catenin相对不稳定，WTβ-catelin的半衰期从～4.5小时减少到S675Aα-catenin3小时(图3E类和图S4C类). 因此，MEKK2诱导的S675磷酸化对β-catenin稳定性至关重要。

在单独的窗口中打开

图3。

MEKK2通过S675的磷酸化稳定β-连环蛋白。(A类)GST或GST–β-catenin与纯化的HA-MEKK2（WT或KD突变体）孵育，通过体外激酶分析MEKK2激酶活性。(B类)纯化的HA-MEK2与GST或GST-β-catenin[WT或S675A（SA）突变体]孵育，并通过体外激酶分析MEKK2激酶活性。(C类)将载体或β-连环蛋白（WT或S675A突变）连同TOPflash-luciferase和雷尼利亚在不存在或存在MEKK2的情况下。转染48小时后测量荧光素酶活性，并将其归一化为雷尼利亚.P（P）单因素方差分析结果<0.05。P（P）< 0.05;P（P）Bonferroni修正学生的值t吨测试：**P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001. (D类)用Flag–β-Catenin WT或S675A突变体通过慢病毒介导的传递重组β-catening缺失的COB，并在成骨细胞分化条件下培养7天。用所示抗体对裂解液进行免疫印迹。(E类)将Flag–β-catenin WT或S675A突变体与HA-MEKK2一起转染HEK293细胞，通过脉冲相标记法测定β-catentin的稳定性[³⁵S] 蛋氨酸然后放射自显影。(F类)将Flag–β-catenin WT或S675A突变体与不同量的HA-ubiquitin共同转染HEK293细胞，并在裂解前用10µM MG132处理8 h。泛素化β-连环蛋白通过抗病毒抗体偶联琼脂糖免疫沉淀，并与抗HA抗体免疫印迹。(G公司)使用重组蛋白进行β-连环蛋白的体外泛素化测定。激活的His–β-catenin与重组SCF孵育^SKP1型复合物、泛素、ATP、E1和E2，无论是否存在重组MEKK2。用Ni-NTA琼脂糖免疫沉淀泛素化β-连环蛋白，进行SDS/PAGE，并用抗泛素抗体进行免疫印迹。免疫印迹证实了MEKK2对S675β-catenin的磷酸化。(H（H）)对WT永生化COB进行裂解，用抗β-连环蛋白或IgG对照物和蛋白G-结合Dynabeads进行免疫沉淀，并用指示的抗体进行免疫印迹。

在单独的窗口中打开

图S4。

MEKK2通过S675磷酸化调节β-连环蛋白的稳定性。(A类)用不同数量的β-catenin（WT或S675A突变）以及TOPflash-luciferase和雷尼利亚.转染48小时后测量荧光素酶活性，并将其归一化为雷尼利亚用抗β-连环蛋白抗体通过免疫印迹分析β-连环蛋白的表达。(B类)用Flag–β-Catenin WT或S675A突变体通过慢病毒介导的传递重组β-catening缺失的COB，并在成骨细胞分化条件下培养7d。通过RT-PCR测定Flag-β-catentin的转录水平。P（P）Bonferroni校正双向学生的值t吨测试表明：**P（P）< 0.01; N.S.，不显著。(C类)将Flag–β-catenin（WT或S675A突变体）与HA-MEKK2一起转染HEK293细胞，通过脉冲相位标记法测定β-catentin的稳定性[³⁵S] 蛋氨酸随后在ImageJ中进行放射自显影和分析。

因为之前的研究报告称蛋白激酶a（PKA）能够磷酸化丝氨酸675和552的β-连环蛋白(20)，我们评估了MEKK2上调β-catenin活性的能力是否需要PKA活性。PKA抑制剂H-89不影响MEKK2诱导的β-catenin活化(图S5A类)，并且PKA磷酸化β-catenin S675不需要MEKK2，因为PKA激活剂forskolin在没有MEKB2的情况下仍然能够诱导S675磷酸化(图S5B类). 因此，MEKK2与β-catenin之间的功能相互作用与PKA活性无关。除了PKA，CK1和GSK3β也被鉴定为β-连环蛋白激酶，通过蛋白酶体依赖性降解调节其稳定性(21). 体外激酶分析表明，MEKK2介导的S675磷酸化并不影响CK1和GSK3β对β-catenin的磷酸化，CK1介导的S45磷酸化位点或GSK3介导的S33/S37/T41磷酸化位点的基础磷酸化在Mekk2公司^−/−COB公司(图S5C类和D类). 因此，MEKK2独立于先前已知的β-连环蛋白激酶PKA、CK1和GSK3β。

在单独的窗口中打开

图S5。

MEKK2在成骨细胞中独立于其他已知的β-连环蛋白激酶发挥作用。(A类)用编码MEKK2的构建物以及TOPflash-luciferase和雷尼利亚转染后12小时，用不同浓度的PKA抑制剂H-89培养细胞，测量荧光素酶活性并将其归一化为雷尼利亚. (B类)主COB与Mekk2公司^+/+和Mekk2公司^−/−在不同的时间点用10μM forskolin刺激幼鼠，用所示抗体对裂解产物进行免疫印迹。(C类)GST-β-catenin与重组GSK3β孵育(顶部)或CK1(中部)在存在或不存在MEKK2的情况下，利用磷酸化-β-catenin特异性抗体的免疫印迹分析GSK3β或CK1对β-catentin磷酸化的影响。(底部)在没有或存在GSK3β的情况下，将GST-β-catenin与重组MEKK2孵育，用抗磷酸化-β-catentin（S675）抗体免疫印迹分析MEKK2-诱导的β-catening磷酸化。(D类)主COB与Mekk2公司^+/+和Mekk2型^−/−用所示抗体对幼鼠进行裂解和免疫印迹。

众所周知，β-连环蛋白的稳定性主要由泛素介导的蛋白酶体降解调节(22). 因为我们观察到S675A突变使成骨细胞中的β-catenin不稳定(图3D类和E类)，我们检测了MEKK2介导的S675磷酸化对β-连环蛋白泛素化的影响。如中所示图3F类β-catenin泛素化水平在S675A突变体中显著增加。然而，在使用S期激酶相关蛋白1（SKP1）作为E3连接酶的无细胞测定中，MEKK2介导的S675磷酸化没有损害泛素对β-连环蛋白的添加，这表明MEKK2可能调节β-连环蛋白的去泛素化(图3G公司). 为了了解S675磷酸化如何影响β-连环蛋白和蛋白酶体周转，使用Flag–β-catenin（WT或S675A）和MEKK2的联合免疫沉淀物进行质谱分析，以鉴定选择性招募到S675磷酸β-catentin的蛋白质。该方法表明DUB USP15优先与WT结合，但不与S675Aβ-catenin结合；HEK293细胞中过表达蛋白的共免疫沉淀证实了这一发现(图S6)并通过共免疫沉淀成骨细胞内源性蛋白(图3H（H）). 接下来，我们进行了一系列共免疫沉淀实验，以评估MEKK2或USP15是否是调节β-连环蛋白周转的破坏复合物的一部分(图S7). 有趣的是，MEKK2与该复合物的几个组分相互作用，包括泛素E3连接酶β-TrCP、Axin1/2和GSK3β，但不与APC和CK1相互作用。仅与APC、Axin1和β-TrCP发生相互作用。因此，MEKK2和USP15与调控β-catenin周转的破坏复合体相关，表明MEKK2-介导的β-catentin调控可能与Axin复合体的成分相关。

在单独的窗口中打开

图S6。

β-连环蛋白与USP15相互作用。用载体或β-catenin（WT或S675A突变株）和Flag-USP15转染HEK293细胞，用抗Flag抗体偶联琼脂糖进行免疫沉淀，并用指示的抗体进行免疫印迹。

在单独的窗口中打开

图S7。

MEKK2和USP15与Axin复合物的成分相互作用。用指示的构建体转染HEK293细胞，如指示进行免疫沉淀，并用指示的抗体免疫印迹随后的免疫复合物。

USP15促进β-连环蛋白稳定性和成骨细胞分化。

为了确定USP15是否需要通过MEKK2调节β-连环蛋白活性，我们研究了USP15对MEKK2-诱导的β-连环素活化的影响(图4A类和B类和图S8A类). 将USP15添加到β-catenin结构中诱导了β-catentin转录活性的进一步增加，并且敲除USP15降低了MEKK2-诱导的β-catening激活。为了直接测试USP15是否稳定β-catenin，我们进行了脉冲相实验。USP15的过度表达增加了β-catenin的稳定性(图4C类)而MEKK2介导的β-连环蛋白稳定作用因USP15的敲除而显著降低(图4D类). 因此，分化6天后，USP15缺陷成骨细胞中的β-catenin水平降低(图4E类). 伴随泛素化分析表明，USP15敲除增加了泛素化β-连环蛋白的总水平(图S8B类). 正如预期的那样，仅添加USP15就诱导了β-连环蛋白的去泛素化，而添加MEKK2则通过增强泛素化的β-连环素与USP15之间的相互作用进一步促进了β-联环蛋白的脱泛素化(图4F类和G公司). 因此，MEKK2介导的磷酸化足以促进USP15介导的β-catenin去泛素化，而无需额外的因素。这些结果支持这样的观点，即MEKK2介导的S675磷酸化增强了β-连环蛋白与USP15的结合亲和力，USP15反过来会使泛素化的β-连环素组成，阻止其蛋白酶体依赖性降解。如果MEKK2通过促进USP15对β-catenin的作用来调节其对成骨细胞分化的影响，那么USP15的缺失会损害成骨细胞的分化。因此，USP15的敲除阻断了成骨细胞的分化，如矿化活性几乎完全丧失和特征性成骨细胞转录特征的丧失，如Opn（操作）,阿尔卑斯山,第1a1列、和英国标准普尔(图4H（H）和我)。

在单独的窗口中打开

图4。

USP15促进β-catenin稳定性和成骨细胞分化。(A类)USP15或载体对照与TOPflash-luciferase和雷尼利亚β-catenin的缺失或存在。转染后48小时测量萤光素酶活性，并将其标准化至雷尼利亚.P（P）单因素方差分析结果<0.05。P（P）Bonferroni校正学生的值t吨测试：**P（P）< 0.01. (B类)C3H10T1/2细胞感染表达对照或使用15shRNAs，并用Flag–β-catenin、TOPflash-luciferase和雷尼利亚存在或不存在MEKK2 WT或KD突变体。转染48小时后测量荧光素酶活性，并将其归一化为雷尼利亚.P（P）单因素方差分析结果<0.05。P（P）Bonferroni修正学生的值t吨测试：*P（P）< 0.05. (C类)将Flag–β-catenin与载体或USP15一起转染HEK293细胞，通过脉冲相标记法测定β-catentin的稳定性[³⁵S] 蛋氨酸然后放射自显影。数字表示相应波段的密度测量值与时间=0时的值之比。(D类)HEK293细胞感染表达对照或使用15shRNA。用Flag–β-catenin和MEKK2转染所得细胞，并通过脉冲追逐标记测定β-catenin的稳定性[³⁵S] 蛋氨酸然后放射自显影。(E类)人骨髓间充质干细胞感染指示慢病毒，并在成骨细胞分化条件下培养6天，然后进行免疫印迹。(F类)使用重组蛋白进行β-连环蛋白的体外泛素化测定。激活的His–β-catenin与重组SCF孵育^SKP1型复合物、泛素、ATP、E1和E2，无论是否存在重组MEKK2或USP15。免疫印迹证实了MEKK2对S675β-catenin的磷酸化。(G公司)使用重组蛋白进行了泛素化β-连环蛋白与USP15的体外相互作用分析。在有或无重组MEKK2的情况下，将标记的泛素化β-连环蛋白与重组USP15孵育，用标记抗体-琼脂糖免疫沉淀，并用指示抗体免疫印迹。MEKK2介导的β-连环蛋白S675磷酸化通过抗磷酸化β-连环素（S675）抗体免疫印迹证实。(H（H）和我)人类骨髓间充质干细胞感染了表达对照或使用15shRNAs，在成骨细胞分化条件下培养21天(H（H）)茜素红染色测定成骨细胞矿化活性。(我)培养10天后，用RT-PCR分析成骨细胞标记基因的表达。对于每个图形，P（P）单因素方差分析结果<0.05。P（P）Bonferroni校正学生的值t吨测试：*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***;P（P）< 0.001.

在单独的窗口中打开

图S8。

USP15调节β-连环蛋白的泛素化。(A类)靶向人类的shRNA构建效率美国15通过RT-PCR和免疫印迹法测定。(B类)HEK293细胞感染表达对照或使用15shRNAs，然后转染HA-ubiquitin（HA-Ub）和Flag–β-catenin。泛素化β-连环蛋白用抗旗帜抗体偶联琼脂糖免疫沉淀，用抗HA抗体免疫印迹。

成骨细胞培养和分化测定。

通过三重胶原酶/dispase II消化法从5天龄新生儿中分离出原发性COB。细胞在含有抗坏血酸和β-甘油磷酸的分化培养基中培养。按照制造商（Lonza）的描述，培养hMSCs并将其分化为成骨细胞。在含有10%FBS、2 mM我-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、1%肝素和1%非必需氨基酸，并与抗坏血酸和β-甘油磷酸区分。所有细胞常规检测为支原体阴性。

对于细胞外基质矿化的Von Kossa染色，用10%中性缓冲福尔马林固定细胞，并用2.5%硝酸银（Sigma-Aldrich）染色。对于碱性磷酸酶（ALP）活性，成骨细胞用10%中性福尔马林缓冲液固定，并用含有固蓝和萘酚（Sigma-Aldrich）的溶液染色。或者，用10倍稀释的Alamar Blue溶液培养成骨细胞，清洗并用含有6.5 mM Na的溶液培养₂一氧化碳_三，18.5 mM NaHCO_三，2 mM氯化镁₂和磷酸酶底物（Sigma-Aldrich）。ALP活性通过光度计（热电公司）测量。

显微CT分析、组织学、原位杂交、免疫组织化学和组织形态计量学。

使用上述参数在Scanco Medical Micro-CT 35系统上进行Micro-CT分析(38). Micro-CT分析由一名对所分析动物的基因型不知情的研究人员进行。如前所述进行石蜡包埋、原位杂交和免疫组化(39)。

用于组织形态计量学，8周龄Mekk2公司^−/−在尸检前的第7天和第2天，分别对小鼠及其同胞对照组进行皮下注射25 mg/kg钙黄绿素和40 mg/kg脱氯环素。胫骨被移除并嵌入甲基丙烯酸甲酯中，没有脱矿。未脱钙的5μm切片在不染色的情况下切割和安装，以量化MAR和BFR/骨表面（BS）比率。连续切片用甲苯胺蓝染色，以量化成骨细胞和破骨细胞的数量。使用OsteoMeasure系统（Osteometrics，Inc.）进行组织形态计量学分析。面积约1.2 mm的采样点²在胫骨干骺端的继发性海绵状组织中建立，结果根据标准化命名表示(40)。

体外激酶分析、免疫沉淀和免疫印迹。

将重组MEKK2、GSK3β或CK1（200 ng）在30°C的激酶缓冲液中培养15分钟[20 mM Hepes（pH 7.5），20 mM MgCl₂含β-catenin蛋白的1 mM EDTA、2 mM NaF、2 mM甘油磷酸、1 mM DTT、10μM ATP]和10μCi（γ32P）ATP（PerkinElmer）。然后通过SDS/PAGE解析底物，并通过放射自显影术观察磷酸化蛋白。

在TNT裂解缓冲液中裂解细胞（10 mM Tris、50 mM NaCl、5 mM EDTA、2 mM NaF、30 mM肽、5μg/mL抑肽酶、1%Triton X-100），并在4°C下将裂解产物与Flag-、β-连环蛋白-或MEKK2-共轭琼脂糖珠孵育过夜。用TNT缓冲液洗涤珠子三次，用Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad）洗脱免疫沉淀。洗脱液通过SDS/PAGE分离并转移到Immobilon-P膜（Millipore）。用抗GAPDH抗体进行免疫印迹，使蛋白质水平正常化。在含4%脱脂奶的TTBS缓冲液[100 mM Tris●HCl（pH 7.5），150 mM NaCl，0.1%吐温-20]中封闭膜，然后与指示抗体孵育。最后，清洗膜，用HRP结合的二级抗体孵育，并用ECL（Thermo Scientific）开发。

GST下拉。

将1微克GST或相关GST融合蛋白与重组蛋白在IPP-150缓冲液（10mM Tris·HCl、150mM NaCl和0.1%Nonidet P-40）中孵育1小时，并加入20µL GST珠，在4°C下旋转孵育90分钟。对于质谱分析，使用抗GST抗体结合琼脂糖将10μg GST或GST-MEKK2嵌入柱中，然后在4°C下与2 mg从表达WNT 10b的ST-2成骨细胞获得的细胞裂解物孵育过夜。用IPP-150缓冲液清洗色谱柱三次，并用含有谷胱甘肽的IPP-325缓冲液（325 mM NaCl，0.1%Nonide P-40，10 mM Tris●HCl）洗脱。

脉冲追逐试验。

HEK293T细胞保持在37°C，5%CO₂.转染前一天，细胞被置于一个6孔板中，板厚为4.2×10⁵细胞/mL。转染48小时后，将细胞换成饥饿培养基（Cys/Met-freed DMEM，3%透析FBS，Gln，Hepes），并在37°C，5%CO下培养1小时₂然后收集细胞并用2mL饥饿培养基（含1mCi）重新悬浮³⁵S（Perkin-Elmer），在37°C、5%CO的摇床上培养1小时₂培养后，用PBS洗涤细胞，并在1300×克持续5分钟。将培养基改为追逐培养基（DMEM，5%FBS，+Cys，+Met），并将细胞在摇床上在37°C，5%CO下孵育0、3、6或9小时₂培养后，收集细胞，用Flag M2珠（Sigma）进行免疫沉淀，并用放射自显影术检测洗脱蛋白。

体外泛素化/去泛素化试验。

将UbcH3（500 nM）（Millipore）、0.1μg SCFβ-TrCP1（活化；Millipoer）、100 nMβ-catenin（活化；Millipore）和2μM泛素混合在含有25 mM 3的泛素化缓冲液中-(N个-吗啉基）丙基磺酸（pH 7.5），0.01%吐温20，5 mM MgCl₂、2 mM ATP和1 mM DTT。通过添加100 nM重组MEKK2（Invitrogen）并在30°C下培养1 h来启动磷酸化。随后，添加10 nM E1（Millipore）以启动泛素化，并将该混合物在37°C下培养1 h。然后，在室温下添加5 mM EDTA 15分钟以停止泛素化反应。最后，添加400 nM重组USP15（Enzo Life Sciences）进行氘化，并在37°C下培养1 h。添加SDS样品缓冲液以停止反应。

萤光素酶报告基因测定。

使用Effectene（QIAGEN）瞬时转染生长在12孔板上的C3H10T1/2细胞，其中含有0.5μg TOPflash质粒和50 ng表达质粒雷尼利亚萤光素酶（Promega）。转染后12小时，在无血清培养基中添加100 ng/mL Wnt3a（R&D Systems）24小时。为了抑制Wnt信号，在Wnt3a处理前1小时添加1μg/mL DKK1（R&D-Systems）。使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）获得标准化荧光素酶活性。

我们感谢Antonios Aliprantis博士、邹伟国博士和Marc Wein博士的有益讨论；Nicholas Brandy、Yeon-Suk Yang和Steven Doty提供技术支持；以及许多提供宝贵试剂的个人。M.B.G.获得了Burroughs Wellcome基金颁发的医学科学家职业奖，并得到了美国国立卫生研究院院长早期独立奖1DP5OD021351的支持。J.-H.S.获得了肌肉骨骼移植基金会奖的支持，这项工作部分得到了国家自然科学基金会31470845和81430033（给B.S.）的资助。