MEKK2是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激酶基因家族MEKK/Ste11亚群的成员，是c-Jun N末端激酶（JNK）MAPK级联的主要上游激活物(2,4,6,10). 除激活JNK外，MEKK2还被证明激活细胞外信号调节激酶（ERK）和p38 MAPK(2,6,20). MEKK2在多种组织中表达(23)但其在不同组织中的功能尚不清楚。在小鼠T细胞系D10中，MEKK2被重新分配到质膜区域，在该区域T细胞和抗原呈递细胞在刺激后结合，表明MEKK1在T细胞受体（TCR）/CD3介导的T细胞激活信号转导中起重要作用(20). 有趣的是，ERK而不是JNK被认为是这个激活过程的目标(20). 使用Jurkat T细胞，我们发现MEKK2参与TCR介导的JNK活化和白细胞介素2（IL-2）基因诱导(23). 然而，Jurkat T细胞中ERK的激活并不是由MEKK2介导的(23). 胚胎干细胞的基因靶向研究表明，MEKK2在免疫球蛋白E（IgE）和c-Kit诱导的细胞因子基因表达中发挥作用(11). 尽管这些体外研究表明，MEKK2可能在T细胞和其他造血细胞中发挥重要作用，但尚不清楚哪种MAPK级联参与体内MEKK_2信号的转导。
ERK、JNK和p38 MAPK级联是TCR/CD3复合物下游的关键信号传感器，在调节T细胞功能中发挥重要作用(12,13,19,24,25,28,33). c-Jun/AP-1转录复合物是JNK途径的主要靶点，其激活也依赖于静息T细胞中TCR和CD28的协同刺激，或通过使用药理试剂十四烷基佛波酯和钙2+电离层(16,24). 在活化受损的无能性T细胞中，JNK及其靶点AP-1的活化也被阻断(7,13). 通过使用携带编码JNKs、JNKK1（SEK1或MKK4）和JNKK2（MKK7）基因的靶向突变的突变小鼠，已经证明JNK-MAPK级联在T细胞激活和分化中起重要作用，但在胸腺T细胞发育中不起重要作用(8,9,14,15,17,18,26,30). 相反，其他地方已经证明相关的ERK级联在胸腺T细胞的发育中起着至关重要的作用(1,5,15). 然而，这些MAPK级联是如何被激活的，以及在淋巴细胞发育和激活过程中通过哪些上游激活物被激活，这在很大程度上尚不清楚。
在这项研究中，我们用靶向性的Mekk2公司同源重组突变。对这些小鼠的T细胞发育和活化进行了研究。我们发现，尽管MEKK2对正常的T细胞和B细胞发育是不可或缺的，Mekk2公司−/−与野生型T细胞相比，T细胞对抗CD3单克隆抗体刺激表现出更强的增殖反应，并产生更多的细胞因子IL-2和γ-干扰素（IFN-γ）。Mekk2公司−/−胸腺细胞比野生型胸腺细胞更容易受到抗CD3-MAb诱导的细胞死亡的影响，但不易受到Fas、紫外线或地塞米松诱导的细胞凋亡的影响。有趣的是Mekk2公司在T细胞中，不抑制TCR/CD3诱导的JNK激活，也不影响ERK和p38的激活。相反，Mekk2型−/−T细胞在抗CD3单克隆抗体刺激下表现出比野生型T细胞更高的JNK激活。总之，我们的研究结果表明，在T细胞刺激期间，MEKK2可能在部分通过JNK而不是ERK和p38 MAPK级联来控制TCR信号强度方面发挥复杂的作用。
材料和方法
的生成Mekk2公司-基因靶向的缺陷小鼠。
14.5-kb小鼠Mekk2公司从129sv文库中分离出含有MEKK2催化结构域部分序列编码的基因组DNA克隆，并用于构建Mekk2公司通过标准技术瞄准载体。目标向量（图。)在pBluescript中构建，pBluesscript包含磷酸甘油激酶-胸苷激酶盒和内部核糖体进入位点（IRES）-LacZ-Neo对磁带在5′端两侧各有一个2kbXho公司我-巴姆HI基因组DNA片段，外显子编码MEKK2氨基酸351-426，3′端为7-kbXho公司我-萨尔I DNA片段。因此，在靶向等位基因中，含有部分Mekk2公司外显子被IRES-LacZ-Neo替换对暗盒（图。). 插入盒式磁带还破坏了巴姆HI站点（由于巴姆HI（高）-Bgl公司II结扎），从而创造了一个新的14-kb巴姆该位点的HI片段代替内源性10-kb片段。P1（5′-CAGGGATCTGGAATCA）、P2（5’-AATTCTAGAGTCCACTCCA）和P3（5'-GGCAGCAATGCAATGTCAGTACAAAA）是用于基因分型的引物。通过标准程序生成靶向ES细胞，并通过Southern杂交进行基因分型Hin公司dIII DNA片段如图所示。作为探针。将靶向ES细胞注射到C57BL/6囊胚中以生成嵌合小鼠，并通过PCR基因分型和免疫沉淀（IP）-Western blot分析（见下文）确认靶向小鼠。
小鼠的靶向突变Mekk2公司基因。（A） 针对Mekk2公司轨迹。Murine公司Mekk2公司显示了MEKK2催化结构域中编码氨基酸349至438的基因组DNA外显子（黑箱）（顶面板）。靶向载体显示在中间面板中，靶向等位基因显示在底部面板中。全新14-kb巴姆显示由目标事件创建的HI片段。打开的盒子是Hin公司dIII片段用作Southern杂交基因分型探针。P1、P2和P3是用于基因分型的三个引物。pBS、pBluescript。（B） 野生型和靶向ES细胞基因组DNA的Southern blot分析Hin公司dIII碎片作为探针（见面板a）。（C） 一窝猪的PCR基因分型Mekk2公司+/−父母。（D） MEKK2蛋白表达的IP-Western-blot（WB）分析。从100 mg的脑、肾、胸腺（Thy）和脾脏（Spl）或107从野生型、，Mekk2公司+/−，或Mekk2公司−/−小鼠，用对照兔血清或抗MEKK2抗血清1128进行IP。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离免疫复合物，并用抗MEKK2抗血清1129进行Western blotting分析。免疫前血清；N.B.，非特异性带。
IP-Western-blot分析。
通过PCR对6至8周龄小鼠解剖的组织进行基因分型，并在1 ml全细胞裂解缓冲液中均匀化100 mg组织。通过在Eppendorf微型离心机中以14000 rpm的转速在4°C下离心10分钟，去除细胞碎片。将上清液与免疫前血清（对照）或抗MEKK2-特异性抗血清1128（针对MEKK2催化域提出）一起进行IP。彻底清洗免疫复合物，然后用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后用MEKK2特异性抗体1129（针对MEKK2中的N末端非催化结构域提出）进行蛋白质印迹进一步分析。
细胞制备和流式细胞术分析。
制备胸腺、脾脏和淋巴结细胞的单细胞悬浮液，采用标准程序进行染色，并在FACScan流式细胞仪上进行分析（Becton Dickinson，Franklin Lakes，N.J.）。用尼龙毛柱纯化脾脏和淋巴结的总T细胞。CD4细胞+根据制造商的建议，用抗体鸡尾酒和磁性微球（干细胞技术公司，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华）通过阴性选择纯化T细胞。
增殖分析。
由野生型和Mekk2公司−/−小鼠（6至8周大）在10岁时被置于U型底部96周的微量滴定板（Costar Co.，Cambridge，Mass.）中5添加10%胎牛血清、1×抗生素（西格玛，密苏里州圣路易斯）和50 mMβ-巯基乙醇的RPMI细胞/孔。将平板在37°C的CO中孵育2培养箱，在48小时培养期的最后8小时内，每孔用1μCi的氚胸腺嘧啶（Amersham，Arlington Heights，Ill.）进行脉冲处理。细胞用Tomtec细胞采集器采集，用1205倍他泊液闪烁计数器计数。所有结果均表示为三份培养物的平均值±标准偏差。
细胞因子ELISA检测。
从野生型和Mekk2公司−/−如上所述，用抗CD3抗体（2C11）在96周的平板中刺激小鼠24小时，并根据制造商的说明收集上清液，以通过酶联免疫吸附试验（ELISA）（Pharmingen，San Diego，Calif.）测量IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和IFN-γ。所有实验均一式三份，数据表示为平均值±标准偏差。
体内胸腺细胞死亡试验。
野生型和Mekk2公司−/−同窝（8周龄）小鼠腹腔注射对照正常小鼠IgG或抗CD3抗体2C11，18小时后处死。通过标准程序分离胸腺T细胞，并用碘化丙啶（PI）染色以进行荧光激活细胞分选分析。结果显示为每组三只小鼠的平均值。
体外凋亡检测。
从野生型和Mekk2型−/−小鼠在10岁时被播种6细胞/孔置于2 ml含有10%胎牛血清的RPMI培养基中，放入6孔板中，预涂有10μg对照IgG或抗CD3抗体/ml，培养12和24小时，或与0.5μg抗Fas抗体（克隆jo-2；Pharmingen）/ml或50 nM地塞米松（Fluka Chemical Corp.，Ronkonkoma，N.J.）孵育12和24 h，或与60 J UVC/m孵育2然后在完全培养基中培养24小时。细胞死亡通过异硫氰酸荧光素（FITC）-膜联蛋白V（Pharmingen）染色细胞并用FACSan细胞仪进行分析来确定。仅在培养基中培养的胸腺细胞作为细胞自发死亡的对照。细胞死亡表示为刺激诱导的膜联蛋白V阳性细胞的百分比。实验一式三份，数据代表四个独立的实验。
用抗磷-JNK、-ERK和-p38抗体进行蛋白质印迹。
从野生型和Mekk2公司−/−根据制造商的说明，使用抗磷蛋白-JNK、-ERK和-p38抗体（马萨诸塞州波士顿新英格兰生物实验室）对同窝鼠（6至8周龄）和从T细胞制备的100μg全细胞提取物进行分析。
结果
中断Mekk2公司在小鼠中通过同源重组。
为了研究MEKK2在体内的生理作用，我们破坏了Mekk2公司基因同源重组。通过替换Xho公司我-巴姆HI片段来自Mekk2公司IRES轨迹-拉奇-尼奥对基因盒（图。). 更换Xho公司我-巴姆HI片段导致MEKK2催化结构域中192个氨基酸缺失。Southern印迹分析（图。)在956个新霉素耐药ES细胞克隆中，鉴定出3个携带靶向性Mekk2公司突变。其中一只被注射到C57BL/6囊胚中以产生嵌合体小鼠。目标Mekk2公司如PCR基因分型所示，等位基因成功地从嵌合体小鼠传递到其后代（图。). β-半乳糖苷酶活性在两种Mekk2公司+/−和Mekk2型−/−小鼠，但非野生型小鼠（数据未显示）。用两种针对NH的MEKK2特异性抗体进行Western blot分析2-重组MEKK2蛋白的末端（1129）和部分催化（1128）结构域在两种蛋白中均未检测到任何截短的MEK02蛋白Mekk2公司+/−或Mekk2公司−/−小鼠，表明MEKK2蛋白的N末端非催化部分未表达（图。).
这个Mekk2公司−/−小鼠表现正常，有生育能力。因此，这些结果表明，MEKK2要么不参与正常胚胎发育，要么其功能被另一个可能的同源基因所补偿。
MEKK2的破坏不会改变正常的T细胞和B细胞发育。
为了研究MEKK2在淋巴细胞发育和功能中的作用，我们检测了来自野生型和野生型胸腺、脾脏和骨髓的T细胞和B细胞Mekk2公司−/−用流式细胞仪对小鼠进行分析。如图所示。、T细胞和B细胞亚群的分布Mekk2公司−/−小鼠的胸腺、脾脏和骨髓与野生型小鼠无明显区别。此外，0-12周龄的胸腺和脾脏大小没有显著差异Mekk2公司−/−和野生型小鼠（数据未显示）。胸腺和外周T细胞的数量Mekk2公司−/−这些年龄段的野生型小鼠也没有显著差异（数据未显示）。我们还分析了来自Mekk2公司+/−并发现与野生型小鼠没有差异（数据未显示）。因此，这些结果表明，主要淋巴细胞的发育可以在缺乏Mekk2公司基因产物。
正常T细胞和B细胞发育不需要MEKK2。所示为流式细胞术分析野生型和Mekk2公司−/−胸腺、脾脏和骨髓。显示了分析中使用的抗体。每个配置文件中的数字是总细胞数的百分比。框R3、R4和R5中所示的细胞分别是前B细胞、前B细胞和前B细胞以及成熟B细胞。
增殖过度Mekk2公司−/−T细胞对抗CD3抗体刺激的反应。
以前有报道称，MAPKs JNK1和JNK2的靶向突变并没有阻止T细胞的发育，但会损害T细胞的活化和分化(9,17,30). 由于体外研究表明MEKK2是T细胞JNKs的主要上游激活物，因此可能Mekk2公司−/−T细胞可能受到与JNK缺陷型T细胞类似的影响。为了研究这种可能性，我们纯化了6-8周龄的总脾脏T细胞Mekk2公司−/−然后用抗CD3单克隆抗体2C11或2C11加抗CD28单克隆抗体刺激这些T细胞。令我们惊讶的是，我们发现Mekk2公司−/−与野生型T细胞相比，T细胞在抗CD3单克隆抗体刺激下增殖更为旺盛（图。和B）。我们还分析了CD4+从淋巴结引流液中纯化的T细胞亚群Mekk2公司−/−和野生型小鼠，发现CD4+的子集Mekk2公司−/−T细胞对抗CD3-MAb也具有增强的增殖反应（数据未显示）。因此，这些结果表明，MEKK2可能对T细胞的激活起负调节作用。
野生型（WT）和Mekk2公司−/−T细胞。（A和B）纯化4-8周龄野生型和Mekk2公司−/−分别用抗CD3抗体（A）和抗CD3加抗CD28抗体（B）刺激小鼠48小时[三H] 在采集细胞用于测量[三H] 胸腺嘧啶掺入。（C至G）从4-8周龄野生型和Mekk2公司−/−用抗CD3抗体刺激小鼠24 h，用ELISA法测定细胞因子IL-2（C）、IFN-γ（D）、IL-4（E）、IL-5（F）和IL-10（G）的产生。如上所述测量胸腺T细胞中IL-10（H）的产生。
细胞因子表达的改变Mekk2公司−/−T细胞。
为了进一步检查Mekk2型−/−在刺激TCR/CD3复合物后，我们测量了参与T细胞增殖和/或T辅助细胞分化的主要T细胞细胞因子的产生，包括IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-10。如图所示。，我们始终发现Mekk2公司−/−与野生型T细胞相比，T细胞产生的IL-2和IFN-γ显著增多，但IL-4显著减少。Mekk2公司−/−T细胞和野生型T细胞产生相当量的IL-5和IL-10（图。). 这些数据表明，T细胞增殖增加可能是由于细胞因子产生增加。
MEKK2对AICD胸腺细胞的保护作用。
上述结果表明：Mekk2公司-缺乏的T细胞对TCR/CD3刺激反应过度。这表明MEKK2可能参与对TCR/CD3信号强度的负调节。由于之前已经证明TCR/CD3复合物的刺激会导致胸腺细胞的活化诱导细胞死亡（AICD）(21,22)，如果MEKK2对TCR信号进行负向调制，我们预计Mekk2公司−/−胸腺细胞可能比野生型胸腺细胞更容易受到抗CD3诱导的AICD的影响。为了调查这种可能性，Mekk2公司−/−和对照野生型小鼠注射抗CD3单克隆抗体，18小时后检测胸腺细胞凋亡。如图所示。，我们发现在Mekk2公司−/−胸腺超过野生型胸腺。我们还发现，抗CD3抗体诱导的胸腺中有更多的DNA片段Mekk2公司−/−与野生型小鼠相比（数据未显示），表明抗CD3单克隆抗体诱导的细胞凋亡更多Mekk2公司−/−胸腺。为了检测胸腺中AICD的增加是否是胸腺T细胞固有的，我们从Mekk2公司−/−小鼠和野生型小鼠，在体外用抗CD3单克隆抗体涂层板，然后用藻红蛋白抗CD4、细胞色素抗CD8和FITC-膜联蛋白V进行三色流式细胞术分析，如图所示。，观察到更多抗CD3抗体诱导的细胞死亡Mekk2公司−/−CD4/CD8双阳性胸腺细胞比野生型双阳性胸腺细胞。我们还测定了外周T细胞中抗CD3诱导的AICDMekk2公司−/−与野生型小鼠相比没有发现差异（数据未显示）。中的增强AICDMekk2公司−/−胸腺T细胞似乎对TCR信号级联具有特异性，因为我们发现紫外线照射诱导的细胞死亡和地塞米松诱导的细胞死亡率没有受到影响（图。). 此外，Fas诱导的胸腺细胞凋亡也没有受到影响Mekk2公司−/−T细胞（图。).
敏感性Mekk2公司-胸腺细胞缺乏导致细胞死亡的原因是细胞活化或应激。（A） 野生型小鼠（8周龄）和Mekk2公司−/−小鼠腹腔注射100μg对照IgG或抗CD3抗体。18小时后处死小鼠，用PI染色法分析胸腺细胞。显示了亚二倍体细胞的百分比。（B） 野生型或Mekk2公司−/−8周龄小鼠制备胸腺细胞；用抗CD3抗体刺激0、12和24小时；然后通过用藻红蛋白-抗-CD4、cychrome-抗-CD8和FITC膜联蛋白V进行三色流式细胞术染色来监测。所示百分比是在减去背景（膜联蛋白V+未经刺激培养的胸腺细胞）。（C至E）野生型和Mekk2公司−/−用紫外线（60 J/m）刺激从8周龄同窝婴儿中分离的胸腺细胞2)（C）、50 nM地塞米松（D）或0.5μg抗Fas/ml（E）在不同时间点，然后按照B组所述进行凋亡检测。
中断Mekk2公司未阻断TCR介导的JNK、ERK或p38激活。
其他地方已经证明MEKK2是JNK、ERK和p38 MAPK级联的活化MAPK激酶激酶(2,4,6,20). Schaefer及其同事报告称，MEKK2利用ERK途径在小鼠T细胞系中转导TCR信号(20). 然而，我们发现MEKK2参与了Jurkat T细胞对TCR刺激的JNK激活(23). 因此，这些激酶途径的激活可能在Mekk2公司−/−T细胞。为了研究这种可能性，我们刺激了从Mekk2公司−/−小鼠和野生型小鼠单独或与抗CD3单克隆抗体结合，然后测量JNK、ERK和p38的酶活性。令人惊讶的是，JNK MAPK的激活在Mekk2公司−/−T细胞，ERK和p38也没有激活。相反，我们一致观察到JNK激活在Mekk2公司-与野生型T细胞相比，胸腺T细胞缺乏（图。). 然而，ERK和p38的激活没有改变（图。). JNK激活在来自Mekk2公司−/−小鼠（数据未显示）。因此，在TCR刺激过程中，MEKK2可能负性调节JNK，而不是ERK和p38 MAPK。
抗CD3抗体刺激对JNK-MAPK的高激活作用Mekk2公司−/−T细胞。由8周龄野生型（1、3和5道）和Mekk2公司−/−在检测JNK、ERK和p38激活之前，用对照抗体（第1和第2道）、抗CD3（第3和第4道）或抗CD3加抗CD28抗体（第5和第6道）刺激窝友30分钟。相对JNK、ERK和p38活性在归一化到蛋白质水平后以条形图表示。
讨论
我们生成了Mekk2公司-同源重组缺陷小鼠。这些小鼠发育正常，具有生育能力，与缺乏生育能力的小鼠形成对比Mekk3公司，与Mekk2公司在胚胎第11天左右死亡(31). 正常的T细胞和B细胞发育可以在Mekk2公司-缺陷小鼠。然而，我们发现来自Mekk2公司-缺陷小鼠对抗CD3单克隆抗体的反应表现为增殖增强，并产生更多的细胞因子IL-2和IFN-γ。此外，我们发现在没有MEKK2的情况下，抗TCR诱导的胸腺T细胞凋亡增强。此外，在没有MEKK2的情况下，TCR介导的JNK激活似乎升高而不是被阻断。因此，这些研究表明，MEKK2可能部分通过MEKK2-JNK途径参与调节TCR信号强度。
我们之前在Jurkat T细胞中发现，TCR信号传导需要MEKK2(23). Schaefer等人使用小鼠T细胞系报告了类似的结论(20). 在本研究中，我们发现Mekk2公司-T细胞缺乏。对于这些明显矛盾的结果，一种可能的解释是，MEKK2可能参与TCR信号的正调控和负调控。由于TCR信号受到严格控制，可以想象，在TCR刺激和MEKK2信号转导之后，TCR信号级联需要下调。我们没有观察到TCR信号完全阻塞的原因Mekk2公司-T细胞缺陷可能是由于其他Mekk2公司-相关激酶，如MEKK3，可以部分补偿MEKK2的损失。然而，这种补偿可能仅补偿MEKK2的积极作用，而不是其在TCR信号传导中的消极作用，从而导致T细胞反应增强。然而，由于之前的工作是在具有瞬时转染和显性阴性MEKK2结构过度表达的细胞系中进行的，这可能会干扰利用其他MAPK激酶激酶的途径，而本工作是在小鼠的正常T细胞中进行的，MEKK2的主要功能可能是在T细胞激活期间平衡TCR信号。
最近研究表明，两者的复合突变Jnk1型和Jnk2号机组导致T细胞增殖增强，IL-2和IFN-γ产生增加(8). 然而，这种表型似乎与我们的Mekk2公司-T细胞缺乏，很明显Mekk2公司−/−T细胞表型不是由缺陷的JNK通路引起的，因为我们发现在TCR刺激后JNK激活并没有被阻断。事实上，我们观察到JNK激活在Mekk2公司−/−T细胞。目前尚不清楚JNK缺乏和JNK活性增加是如何在T细胞中导致这些看似相似的表型的。一种可能性是Mekk2公司-T细胞缺乏，Mekk2公司可能不仅针对JNK级联，而且观察到的表型是JNK途径和另一个未识别的途径改变的结果。在这方面，我们最近发现MEKK3，一个与MEKK2密切相关的同源物，在NF-κB活化中起着关键作用(32).
增加和延长JNK激活被认为可以激活细胞死亡途径，而阻断JNK的激活可以保护细胞免受激活诱导和应激诱导的细胞死亡(三,9,17,27,29). 因此，增加的JNK激活Mekk2公司-胸腺细胞缺陷可能部分解释了为什么Mekk2公司-缺乏胸腺细胞更容易受到抗CD3诱导的细胞死亡的影响。MEKK2信号通路参与细胞凋亡似乎依赖于特定的死亡诱导刺激，如Mekk2公司未显著改变抗Fas抗体、紫外线照射和地塞米松治疗诱导的细胞死亡。这些结果还表明，MEKK2信号传导在TCR库的阴性选择中具有潜在作用，因为TCR介导的细胞凋亡已被证明在这一过程中至关重要。未来将MEKK2基因敲除小鼠与不同的TCR转基因小鼠杂交的实验将使我们能够进一步研究MEK02信号在T细胞胸腺选择中的作用。
MEKK2如何参与调制TCR信号尚不清楚。这种负调控模式可能并不局限于淋巴细胞，因为MEKK2在各种组织中表达。在这方面，我们最近发现，从MEKK2缺陷小鼠分离的肥大细胞也表现出增强的增殖反应（未公布的数据）。对这些细胞以及从MEKK2基因敲除小鼠中建立的其他MEKK2-缺陷细胞的未来分析可能为MEKK_2信号转导的分子机制提供关键线索。
