肝纤维化的病理生物学：一个成功的转化故事

摘要

简介

过去三十年来，人们一直致力于揭示肝纤维化的细胞和分子基础，目前已在治疗慢性肝损伤的病态后果方面取得了立竿见影的成功。数千年来，慢性肝病患者已认识到纤维化或细胞外基质（ECM）或瘢痕的净积聚，但在大多数病史中，它被认为是难以治愈的。尽管如此，佩雷兹·塔马约¹根据可降解ECM分子的肝脏胶原酶活性特征，前瞻性预测了纤维化的可逆性。²接下来的是对这个问题的持续攻势，这让我们对最终导致肝疤痕的细胞、介质和细胞内信号有了一个更清晰的认识。这种明确性反过来又导致了基于合理机制的抗纤维化策略，目前正在临床试验中进行测试。本综述将重点介绍肝纤维化的既定和新兴细胞机制，这些机制为理解候选抗纤维化策略的基础奠定了有用的模板。我们还强调了临床试验中新出现的挑战，并强调了未来尚未解决的关键科学和临床问题。

肝纤维化和肝硬化是可逆的

1979年，Perez-Tamayo的预测得到了证实，等待着针对慢性肝病的特殊疗法的发展，而慢性肝病现在是治疗的主要手段，尤其是针对乙型肝炎（HBV）和丙型肝炎（HCV）。回顾过去，在有这样的治疗方法之前，期望纤维化逆转是不现实的，因为如果没有这些治疗方法，持续的损伤将引发持续的纤维化和修复。在某些情况下，纤维化是可逆的，肝硬化（定义为肝结构和血流的扭曲）可能会退化。在铁和铜超载、酒精性肝损伤、慢性乙型、丙型和丙型肝炎、血色素沉着症、继发性胆汁性肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和自身免疫性肝炎患者中观察到肝硬化的消退（见参考文献。³). 在这些疾病中，HBV治疗抑制病毒复制的患者尤其可能出现可逆性，⁴然而，HCV患者在持续病毒应答（SVR）后出现肝硬化逆转。⁵总的来说，高达70%的HBV或HCV肝硬化患者在后续活检中表现出可逆性，^4,5但是，由于使用直接作用的抗病毒治疗，SVR率超过90%，预计HCV的数据会更加广泛。此外，当丙型肝炎病毒逆转时，可以改善临床结果，降低门静脉压力，降低全因死亡率。⁶值得注意的是，约10%的HCV患者可能在SVR后出现持续性甚至进行性纤维化，这可能反映了其他并发的潜在肝脏疾病，尤其是非酒精性脂肪肝（NAFLD）。⁷

与病毒性肝病相比，NASH晚期纤维化和肝硬化的可逆性不太确定，因为尚未建立针对疾病的治疗方法。然而，对减肥手术后纤维化行为的研究清楚地表明了一些可逆性，^8,9尽管数据有限，需要进行更严格的前瞻性研究。

对于其他慢性肝病的疾病可逆性知之甚少，但一些小报告引用了自身免疫性肝病、胆道梗阻、血色素沉着症和其他疾病的改善（参见参考文献。10供审查）。这些报告的共同特点是废除了导致纤维化的潜在疾病。

ECM的细胞来源

肝星状细胞激活的发现——从静止的维生素a储存细胞转分化为增殖的肌成纤维细胞——为组织抗纤维化治疗方法提供了肥沃的基础。而在胆汁淤积性疾病中，纤维生成细胞可能来源于门静脉成纤维细胞^11,12绝大多数证据仍然支持活化的星状细胞是实质性肝病中ECM的关键来源，包括最近使用遗传模型进行的优雅的命运追踪分析。^11,13,14无论如何，这两种细胞类型的星状细胞和门脉成纤维细胞都可以产生肌成纤维细胞，其分子特征和潜在抗纤维化靶点的表达在肝损伤和纤维化中功能相似。

星状细胞活化按顺序逐步展开；这个范式为定义肝损伤后的纤维生成事件提供了一个有用的结构¹⁵（请参见图1). 特别是，“起始”阶段是指使静止的星状细胞对一系列生长因子作出反应的早期事件，它仍然是一个重要的焦点。快速诱导β-血小板衍生生长因子（PDGF）受体、形成收缩和纤维生成表型以及调节生长因子信号是该反应的主要特征。纤维化的消退可能伴随着活化星状细胞的衰老、失活或凋亡（见下文）。

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图1

正常和疾病肝脏中肝星状细胞（HSC）的功能、特征和表型。HSC可能以几种不同的表型存在，具有不同的分子和细胞功能和特征，每种表型都对肝脏稳态和疾病有显著贡献。静止的星状细胞对肝脏的正常代谢功能至关重要。肝损伤导致静止星状细胞转分化为其活化表型，导致代谢重编程，增加自噬以满足代谢需求，实质损伤扩大，并形成活化HSC/肌成纤维细胞的“经典”表型特征。通过这些变化，活化的星状细胞驱动对损伤的纤维化反应和肝硬化的发展。随着肝损伤的减轻，活化的星状细胞可以通过以下三种途径之一被清除：凋亡、衰老或恢复到失活表型。衰老的星状细胞更有可能被NK细胞介导的细胞死亡清除，而失活的星状上皮细胞则保持“启动状态”，以应对进一步的肝损伤。活化星状细胞数量的减少有助于大多数患者（但并非所有患者）的纤维化或肝硬化的消退和肝脏修复。星状细胞清除的这三条途径对纤维化消退的相对贡献尚不清楚。ECM、细胞外基质；肝星状细胞。NK，自然杀手。

研究和操作星状细胞的新工具和模型的发展体内加速了对其功能的阐明。这些启动子包括在星状细胞中选择性驱动转基因以实现细胞特异性基因缺失的启动子（如卵磷脂视黄醇酰基转移酶或LRAT），¹³选择性切除星状细胞的模型体内,¹⁶永生化星形细胞系¹⁷以及使用分离细胞阵列分析基因表达，以确定细胞特异性转录物和潜在治疗靶点。¹⁸

虽然肝纤维化的研究侧重于肝内细胞、途径和信号，但认识到肝外事件也会对纤维化产生重大影响，包括来自肠道、肌肉和脂肪的信号，以及全身血管变化，这一点至关重要。器官间的相声与NAFLD和NASH的发病机制特别相关。这些影响纤维化的肝外信号总结于图2.

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图2

影响肝纤维化的肝外因素。除了肝内损伤信号外，越来越多的人认识到肝外因素会导致肝纤维化。肠道生物失调和细菌过度生长导致“纤维生成微生物组”，尤其是在淤胆性肝病和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）中。胆汁酸的肠肝循环通过增加法尼糖-X受体（FXR）/TGR5信号传导介导抑菌作用并促进对肝纤维化的保护。脂肪组织分泌的促炎性信号（TNFα，IL-6）和脂肪因子介导促纤维化（如瘦素，抵抗素）或保护性（如脂联素）对肝脏的影响。胰岛素抵抗和代谢综合征是慢性肝病（如NASH、HCV）进展的危险因素。高胰岛素血症会促进脂肪变性，产生活性氧和脂质过氧化物。¹⁹血管异常也可能导致肝纤维化的发展。促进肝纤维化的相互作用用绿线表示，保护性相互作用用红线表示。

轮状细胞激活机制

细胞内反应

星状细胞激活期间复杂的细胞内事件网络包括影响转录、翻译、翻译后和表观遗传学等的调控。在这些众多事件中，细胞内炎性小体激活被越来越多地认为是炎症细胞信号的重要传递者，而炎症细胞信号与脂肪肝疾病尤其相关。²⁰另一个新兴的信号网络是核受体家族，包括法尼糖X受体（FXR），²¹过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR），²²维生素D受体（VDR），²³维甲酸受体，²²Rev-erbα²⁴和肝脏X受体（LXR）。²⁵其他有助于星状细胞激活的转录事件包括Wnt/β-catenin信号，²⁶加塔4²⁷刺猬信号。¹⁴

自噬是一种维持能量稳态的高度调节的细胞内途径，通过水解视黄酯生成脂肪酸，提供关键能量底物，从而驱动肝星状细胞活化。²⁸这一发现部分解释了为什么星状细胞在激活时会失去类视黄醇，因为脂肪酸是细胞激活所必需的。这种自噬反应也是其他组织中间充质细胞纤维化的典型表现，与未折叠蛋白反应的激活和内质网应激有关。²⁹尽管自噬刺激视黄醇酯水解，但视黄醇代谢对星状细胞活化的总体贡献仍不确定，因为通过基因敲除储存蛋白LRAT而缺乏视黄醇滴的小鼠具有保持活化的能力，反对储存视黄醇类物质以使其活化的必要性。³⁰视黄醇的另一个贡献可能是通过视黄醇转化为视黄醛，然后是视黄酸，这可能与胶原蛋白表达和转化生长因子β（TGFβ）通过乙醇脱氢酶3激活有关。³¹然后，维甲酸使自然杀伤（NK）细胞敏感，杀死星状细胞，从而起到抗纤维化作用。³²相反，星状细胞释放的视黄醇抑制NK细胞，从而减少星状细胞杀伤并增强其对纤维化的贡献。³¹

自噬可能是更大的代谢重编程反应的一部分，这在癌症中已被广泛研究，但在纤维生成细胞中尚未被研究。有助于重新编程的信号包括刺猬，³³LXR公司²⁵以及最近的Rev-erbα，以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ），可能对保存星状细胞的成脂表型特别重要。²⁴游离细胞内胆固醇被认为是另一种细胞内代谢信号，可使细胞对活化敏感，可能与脂肪肝纤维化特别相关。³⁴此外，胆固醇和视黄醇代谢由一种脂质相关蛋白Rab18联系在一起，Rab18是一种视黄醇酸反应基因。³⁵

毫不奇怪，激活期间星状细胞的增殖增强与细胞周期机制有关。在细胞周期成分中，细胞周期蛋白E1被认为是由miR-195表观遗传调控的星状细胞增殖的驱动因素。³⁶

表观遗传调控是控制星状细胞活化的一种特别重要的方式，因为调控事件必须在有害刺激后迅速发生，无论是通过激活或抑制基因转录，还是通过转录后控制³⁷（请参见图3). 在表观遗传信号中，microRNA是星状细胞活化和纤维化的重要调控层。⁴⁰相关miRNAs包括miRNA-21，⁴¹miRNA-133a，⁴²miRNA-122，⁴³miRNA-214，⁴⁴miRNA-221/222⁴⁵和miRNA-29b⁴⁶在其他中。对肝星状细胞（HSC）染色质重塑的研究阐明了维生素D受体信号传导和SMAD3（一种TGFβ信号传导效应器）之间的相互作用，这表明对星状细胞中的基因调控有了越来越详细的了解，可能会发现新的治疗靶点。²³其中，心肌相关转录因子A（MRTF-A）已被鉴定为星状细胞的表观遗传修饰物，⁴⁷以及包括肺在内的其他组织的纤维化⁴⁸和心脏。⁴⁹值得注意的是，在啮齿类动物肝损伤中，表观遗传编程可遗传给后代，如果他们有肝损伤，可能会影响后代发生纤维化的倾向。⁵⁰

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图3

肝星状细胞的表观遗传机制和转录后基因调控表观遗传学是指与DNA序列变化无关的可遗传性状，涉及染色质相关蛋白和组蛋白翻译后修饰调节转录的机制。³⁸微RNA通过促进mRNA降解和翻译抑制来调节转录后调节。在肝纤维化和活化的星状细胞中发现的异常DNA甲基化模式包括，例如磷酸酶与张力同源（PTEN），从而导致基因抑制。PTEN负调控ERK和AKT信号通路的激活，控制细胞循环、增殖、局部粘附和细胞迁移。³⁹PTEN在活化的星状细胞中的抑制从而促进纤维生成。类似地，RASAL1、IkB、PPAR-γ和PTCH1的超甲基化和MeCP2的基因抑制导致ERK信号通路的抑制，或GLI1和SMAD3的抑制丧失，从而促进肝星状细胞（HSC）存活（IkB）、HSC激活和纤维化。已在活化的HSC中发现具有促纤维化作用的组蛋白修饰，包括MRTF-A和TGFβ依赖性染色质重塑，导致维生素D受体结合改变和SMAD3介导的成纤维基因转录改变。显示了促进抗纤维化和促纤维化作用的microRNA的示例。

揭示星状细胞激活的节段调控因子的研究发现了一种G蛋白交换因子GIV/Girdin，它位于调节纤维化的几种细胞内途径的汇合点，包括PI3K-Akt-FoxO1、TGFβ-SMAD和cAMP-PKA-蛋白激酶a（环磷酸腺苷（cAMP）-蛋白激酶a-磷酸化cAMP反应元件结合蛋白。⁵¹尽管靶向该分子可能没有足够的特异性，作为一种广泛表达的纤维化治疗，但研究结果提供了一个例子，即识别GIV/Girdin等信号整合子可以提供一个有吸引力的靶点来抑制星状细胞活化。

永续路径

通过“启动”刺激启动的星状细胞可以对大量细胞因子和生长因子作出反应。这些信号通过增强增殖、收缩性、纤维生成、基质降解和促炎信号共同产生瘢痕。虽然早期的模型表明，无论疾病如何，激活途径都是相同的，但现在很明显，存在疾病特异性的纤维化途径，而且，并非所有细胞因子途径都必须并行激活。⁵⁸这与NAFLD特别相关，NAFLD有许多聚合的致病途径。⁵⁹同样重要的是，由不同类型炎症细胞家族及其亚群驱动的免疫和炎症途径越来越微妙，每种炎症细胞都可能促进或抑制纤维化（参见参考文献^3,60–62供审查）。这些途径和细胞类型总结于图4.

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图4

促进或抑制肝星状细胞活化的炎症和免疫细胞相互作用。显示了肝细胞促进（绿线）或抑制（红线）静止星状细胞激活为激活的纤维化肝星状细胞。其中包括这些响应的常见中介体的示例。Hh，刺猬配体；NK，自然杀手。

纤维化退行的途径

肝硬化在什么时候变得不可逆尚不确定，但随着疤痕增厚、脱细胞增多和化学交联，不可逆的可能性更大。一个更精细的分类表明肝硬化实际上由几个亚期组成。⁶³这种更精细的分类可能最终有助于确定可逆性在哪些方面是可能的。无论如何，即使在肝硬化患者中，也成功地证明了纤维化的消退，这表明肝脏具有使瘢痕消退的先天性途径，因此可能存在使用新疗法模拟这些内源性途径的线索。

根据以上总结的纤维化临床经验，现在重点放在回归途径上，包括细胞因子和免疫微环境的变化、ECM组成和星状细胞的行为。细胞因子微环境的调节和炎症细胞成分的改变正在成为这种反应的关键因素。有趣的是，血管内皮生长因子（通常被认为是促纤维化、促血管生成的信号）也可能是纤维化消退所必需的。⁶⁴

随着时间的推移，HCV相关性肝硬化和实验性肝硬化的逆转从小结节演变为大结节性肝硬化。此外，持续一年以上的陈旧性纤维化基质的特征是细胞缺乏和ECM交联增加。³胶原交联增强了胶原的抗降解性，是纤维化不可逆性的关键决定因素。弹性蛋白是另一种非胶原基质成分，也可能有助于抗纤维化逆转。弹性蛋白在成熟肝硬化中积累，并依赖巨噬细胞衍生的基质金属蛋白酶12（MMP12）降解。⁶⁵最近将血清弹性蛋白纳入纤维化评估算法的临床研究在诊断肝硬化方面更准确；例如，Elasto-Fibro-Test优于Fibroscan或Fibrotest单独测试。⁶⁶

活化HSC数量的减少对纤维化的可逆性至关重要。三种主要途径有助于消除纤维形成的活化HSC：（1）凋亡³（2） 衰老⁶⁷（3）恢复到失活表型^68,69（请参见图1). 在啮齿类动物实验性纤维化模型（胆道结扎和四氯化碳（CCl₄)). 细胞衰老是一种基因控制的程序，一旦细胞超过有限的增殖能力，就阻止细胞分裂；HSC经历衰老，然后在实验性肝纤维化中积累。⁶⁷衰老的HSC也被NK细胞作为清除目标体内从而进一步促进纤维化的解决。在鼠纤维化模型中，也有确凿证据表明活化的星状细胞“失活”或逆转为更失活的状态。^68,69然而，这些恢复的细胞仍然处于“启动状态”，在再次暴露于纤维原性刺激时，其重新激活的能力增强。在纤维化消退过程中（即凋亡、衰老和/或逆转），这三种减轻活化星状细胞负担的模式中，哪一种最重要尚不确定体内但目前的证据表明，逆转而非衰老或凋亡可能占主导地位。

对纤维化环境的其他细胞贡献

鉴于星状细胞和肌成纤维细胞在细胞外基质生成中的关键作用，大多数注意力都集中在它们的反应上，但肝损伤会引起复杂的多细胞反应，涉及其他常驻细胞，包括肝细胞、巨噬细胞、窦内皮细胞和不同家族的浸润免疫细胞，包括B细胞，NK和NKT细胞以及髓源性抑制细胞等^3,61,70（请参见图4).

巨噬细胞是解决肝纤维化的关键细胞决定因素，其异质性反映了可能具有广泛不同功能的不同亚群，其中一些具有促纤维化作用，另一些具有抗纤维化作用。⁶²最近的研究强调了特定的纤溶亚群（“赖氨酸-6C⁺ 洛'细胞）的巨噬细胞在纤维化退行过程中膨胀。⁷¹除了通过产生基质金属蛋白酶直接促进纤维化的消退外，巨噬细胞还可以介导抗炎作用，例如，通过分化为局部产生抑制性细胞因子的调节性巨噬细胞。⁷²

窦状内皮细胞被认为是关键的细胞开关，可以驱动肝再生或纤维化。^73,74CXCR7的诱导促进了这些细胞的促再生活性，而纤维化前信号则由成纤维细胞生长因子-1（FGF1）和CXCR4驱动，后者是对星状细胞的旁分泌刺激。⁷³正如早期研究所强调的那样，这些发现加强了窦内皮细胞和星状细胞的相互依赖性。^75,76他们还强调了趋化因子的活性范围不断扩大，与产生趋化因子的细胞一样，趋化因子在促进或减轻肝纤维化方面具有广泛不同的活性。⁶⁰

在肝损伤模型和人类疾病中，一种被称为“导管反应”的病理特征（包括祖细胞、活化星状细胞和ECM）与肝纤维化进展日益相关。^77,78导管反应因素之间的时间和功能关系尚不明确，导管反应是否决定肝损伤的结果是再生性、纤维化还是两者兼而有之，目前尚不清楚。最近的一项研究进一步表明，星状细胞可以获得祖细胞特性，这使得一些导管反应包含来自星状细胞的祖细胞的前景更加明朗。⁷⁹这类研究解开了导管反应的要素和起源，可能会为我们理解肝脏稳态和损伤反应提供见解。

抗纤维蛋白治疗

越来越多的证据表明，纤维化是一个动态和可逆的过程，对纤维化进展的潜在来源和介质的澄清，以及非侵入性评估纤维化的进展，激发了人们开发有效抗纤维化药物的热情，尽管尚未获得批准。⁸⁰事实上，可能已经有许多现有药物具有良好的安全性，其作用机制也将是抗纤维化，尽管它们已经开发用于其他适应症。例如，最近批准用于治疗肺纤维化的药物值得考虑用于治疗包括肝脏在内的其他器官的纤维化，尽管治疗持续时间、患者耐受不良事件的意愿以及跨器官临床试验的终点可能会有很大不同。

利用高通量方法结合“大数据”分析，可以越来越多地发现再利用药物的靶点。⁸¹关键挑战包括慢性肝病长达数十年的自然病史，需要长期药物干预来预防或逆转肝硬化，以及缺乏标准化、公认的非侵入性纤维化评估终点。

随着HBV和HCV抗病毒药物的惊人成功，目前开发抗纤维化药物的努力几乎完全集中在NASH相关的纤维化上。从未满足需求的角度来看，这是一个合理的策略，但不应忽视其他肝病，特别是酒精性肝病和自身免疫性肝病以及儿童肝病和硬化性胆管炎对公共健康的重大影响，因为这些疾病没有药物治疗。

在开发抗纤维化药物时有几个攻击点，这些攻击点将在以下章节中详细描述，并在中进行总结图5.

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图5

抗纤维化治疗可能导致纤维化消退的机制。（1） 控制或治愈潜在疾病的疾病特异性治疗仍是最有效的抗纤维化方法。（2） 靶向受体-配体相互作用与既有或实验药物减少肝星状细胞活化将减缓纤维化的发展，目前正在开发多种潜在的策略。（3） 抑制最有效的促纤维化途径，例如阻止潜在TGFβ的激活或阻断CTGF的活性，是更有前景的抗纤维化策略之一。（4） 通过药物或NK细胞活性增强活化肝星状细胞的凋亡，通过纤溶性巨噬细胞增加细胞外基质的降解，或防止其与LOXL2拮抗剂交联，可以促进纤维化的解决。FXR，法尼类X受体；过氧化物酶体增殖物激活受体；熊去氧胆酸；SVR，持续病毒学应答；CB1，大麻素受体1型；血管紧张素II受体阻滞剂；内皮素-1；转化生长因子β；结缔组织生长因子；单克隆抗体；NF-κB，活化B细胞的核因子-κ-轻链增强因子；NK，自然杀手；金属蛋白酶组织抑制剂TIMP；LOXL2，赖氨酸氧化酶2。

开发新型肝纤维化药物的监管挑战

抗纤维蛋白试验的患者选择

定义未来抗纤维化治疗候选药物的选择标准是一个越来越复杂的问题，因为如上文所述，目前正在计划的大多数试验都是针对NASH的。因此，选择哪些患者参加临床试验（即进入标准）将部分取决于候选药物的预期作用机制。例如，在晚期肝硬化形成之前，抗炎药可能在疾病的中间阶段更有益处，而促进基质降解的药物可能在更晚期的疾病中特别有用。患者分层也将基于进展率和风险、疾病分期和/或纤维化内容。

同样，药物的耐受性和易用性也会影响临床试验患者的选择。肠外治疗对进展为肝硬化或失代偿风险增加的患者最具吸引力。相反，口服药物对需要长期治疗以防止病情恶化的患者尤其有吸引力。

不良事件也会影响新疗法的选择和吸引力。如果药物产生新的症状，则很难确保无症状患者的依从性。因此，治疗脂肪肝将类似于治疗其他慢性病，包括高血压和心脏病，长期治疗有望减轻失代偿的进展和风险，但不会损害生活质量。

未来展望

致谢

脚注

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