高血压。作者手稿；PMC 2015年10月1日提供。
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心衰大鼠心脏交感神经传入去神经抑制心脏重塑和改善心血管功能障碍
细胞与综合生理学系美国内布拉斯加州大学医学中心，NE 68198-5850
通信地址：Irving H.Zucker，博士，内布拉斯加州大学医学中心细胞和综合生理学系，奥马哈，NE 68198-5850，USA，电话：1-402-559-7161，传真：1-40i-559-4438，ude.cmnu@rekcuzi - 补充资料
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摘要
增强的心脏交感传入反射（CSAR）导致慢性心力衰竭（CHF）时交感神经兴奋过度。交感神经兴奋增加与CHF患者的死亡率呈正相关。然而，慢性CSAR缺失对CHF患者心脏和自主神经功能的潜在有益影响尚未被探讨。在此，我们测定了慢性CSAR缺失对CHF患者心脏重塑和自主神经功能障碍的影响。为了选择性地删除瞬时受体电位香草醛1受体（TRPV1）表达的CSAR传入纤维，在大鼠心肌梗死（MI）手术期间，在心外膜应用辣椒素的超强效类似物树脂毒素（RTX，50μg/ml）。该程序在很大程度上消除了增强的CSAR，防止了过度的肾和心脏交感神经活动，并改善了CHF大鼠的压力反射敏感性。最重要的是，我们发现心外膜应用RTX在很大程度上防止了LVEDP升高、肺水肿和心肌肥大，部分减少了衰竭心脏的左心室尺寸，并增加了心脏收缩储备，以应对用异丙肾上腺素刺激β肾上腺素能受体的CHF大鼠。分子证据表明，RTX可减轻CHF大鼠心脏纤维化和细胞凋亡，减少纤维化标记物和TGFβ受体I的表达。压力-容积回路分析表明，RTX降低了CHF大鼠舒张末期压力-容积关系，表明心脏顺应性改善。总之，心脏交感传入缺失对CHF中有害的心脏重塑和自主神经功能障碍具有保护作用。这些数据为CHF的治疗提供了一种潜在的新模式和治疗潜力。
关键词：心脏传入神经、心脏交感神经活动、心力衰竭、重塑
简介
慢性心力衰竭（CHF）是一种严重且使人衰弱的疾病，其生存率很低，发病率不断上升。过度的交感兴奋是CHF的标志，是CHF状态发展和进展的关键因素。交感神经兴奋作用于多个器官，并导致长期影响，导致疾病进展。靶向治疗阻止CHF交感神经过度激活已成为一种公认的方式。CHF状态下发生交感兴奋的机制尚不完全清楚。该实验室以前的研究表明，增强的心脏交感传入反射（CSAR），一种起源于心脏的交感兴奋性反射，是CHF交感神经张力升高的关键因素1，2.
众所周知，心肌缺血导致产生和释放多种代谢物，包括缓激肽、前列腺素和质子，这些代谢物刺激交感传入神经末梢，导致动脉压（AP）、心率（HR）和交感神经活动增加1，三，4在CHF中，CSAR被敏化，心脏交感传入被张力激活1-三最近的证据表明，瞬时受体电位香草醛1（TRPV1）表达的心脏传入纤维对于感应和触发CSAR的激活是必要的，并且这些传入纤维通过全身注射树脂毒素（RTX）来脱敏，辣椒素的一种超强效类似物，能够诱导表达TRPV1的传入神经元和纤维的快速变性5-7，几乎可以完全消除成年大鼠CSAR的激活5考虑到消除增强的CSAR诱导的交感神经兴奋的策略可能有利于预防CHF的有害进展，我们在心肌梗死（MI）时进行了RTX的心外膜应用对大鼠进行手术，以1）研究选择性删除表达TRPV1的CSAR传入对自主神经功能障碍的潜在有益影响，2）确定CSAR对交感神经活动（尤其是心脏交感神经活性；CSNA）的控制是否在CHF的有害心脏重塑中起关键作用。此外，我们研究了CSAR传入脱敏对CHF大鼠心脏形态和血流动力学功能的影响。
方法
实验在体重约400至约500克的雄性Sprague-Dawley大鼠身上进行。实验时间线如所示图S1简言之，在心肌梗死后9-11周对接受RTX或载体治疗的大鼠进行终末实验。这些实验得到内布拉斯加州大学医学中心动物护理和使用委员会的批准，并在美国国立卫生研究院的指导下进行实验动物护理和使用指南。
CHF模型与心脏交感传入脱敏
如前所述，冠状动脉结扎导致心力衰竭8，9如前所述，在心肌梗死后2周和6周通过超声心动图（VEVO 770，Visual Sonics，Inc.）测量所有实验动物的心脏功能8-10为了降低心脏交感神经传入的敏感性，将树脂毒素（RTX，1 mg；Sigma-Aldrich）溶解在2 ml乙醇中，并与18 ml吐温在等渗盐水中混合。冠脉结扎前，用小刷子在整个左心室和右心室上涂两次RTX（50 ug/ml）。RTX的剂量是通过我们的初步实验确定的，在初步实验中，我们发现大鼠心脏表面表达TRPV1的心神经末梢几乎完全消融超过10周(图S2).
急性实验的一般外科准备
在心肌梗死后9-11周进行的急性终末实验中，用氨基甲酸乙酯（800 mg/kg ip）和α-氯醛糖（40 mg/kg ip）麻醉大鼠。记录肾交感神经活性（RSNA）和心脏交感神经活动（CSNA），以评估基础的肾交感和心交感神经张力。详细的手术描述可在在线数据补充.
实验结束时，用过量的戊巴比妥钠对大鼠实施安乐死。如前所述，大鼠被安乐死后1-2分钟，心脏或肾脏神经活动（Max）达到最大值8在大鼠安乐死后15-20分钟记录交感神经活动的背景噪音。使用Powerlab Chart系统的单位转换功能，在减去噪声级后，将基线神经活动确定为Max的百分比。
激活CSAR
心外膜应用辣椒素和缓激肽可有效刺激心脏交感传入5辣椒素和缓激肽之间的时间间隔约为15-20分钟，以使AP、HR和RSNA恢复并稳定在其控制水平。
动脉压力反射曲线的构建
如前所述，通过静脉注射硝酸甘油（25μg），然后注射苯肾上腺素（10μg）来测量心率和RSNA对AP减少和增加的反应，从而生成压力反射曲线2.
左心室性能测量
使用Millar PV循环系统（Millar Instruments，美国德克萨斯州休斯顿）评估左心室（LV）功能。详细的方法描述可在在线数据补充.
组织病理学
将心脏固定在10%磷酸缓冲福尔马林中，用石蜡包埋，并从心尖到心底切割成10μm的连续切片。用苦味酸红染色检测心肌纤维化。详细的方法描述可在在线数据补充.
在用于苦味酸红染色实验的同一心脏组织的石蜡切片上，也进行了裂解caspase 3（CC3）的免疫组织化学染色。详细的方法描述可在在线数据补充.
末端脱氧核苷酸转移酶dUTP介导的缺口标记染色
通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP介导的缺口标记（TUNEL）染色和分析，评估RTX对心肌细胞凋亡的影响。详细的方法描述可在在线数据补充.
Western Blot分析
通过蛋白质印迹技术评估了sham+vehicle、sham+RTX、CHF+vehicle和CHF+RTX大鼠心脏中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤连蛋白、转化生长因子-β受体1、裂解的胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶3和β1-肾上腺素能受体（β1-AR）的蛋白表达。详细的方法描述可在在线数据补充.
心脏神经末梢TRPV1受体的免疫荧光标记
为了确定RTX对心脏TRPV1表达神经末梢的剂量依赖性（0.5μg/ml、5μg/ml和50μg/ml）和时间进程（RTX后1周、4-6周和9-11周）影响，在从4只载体处理的大鼠和20只RTX处理的大鼠（每个剂量或时间点包括4只大鼠）获得的心肌中进行免疫荧光标记实验。详细的方法描述可在在线数据补充.
统计分析
所有值均表示为平均值±标准误差（SE）。各组之间的差异通过双向方差分析确定，然后是Tukey事后（post-hoc）测试。P<0.05被认为具有统计学意义。
结果
RTX导致表达TRPV1的心脏传入纤维丢失
我们用免疫荧光法检测了载体和RTX治疗大鼠心脏神经末梢中TRPV1蛋白的表达。在车用治疗的大鼠中，TRPV1免疫反应主要位于心外膜表面，并与PGP 9.5（神经末端标记物）共同表达(图S2A). 在RTX治疗的大鼠中，分别在心外膜应用RTX（50μg/ml）后1周、4-6周和9-11周测量时，心外膜中TRPV1免疫反应性缺失(图S2A)表明在这些时期表达TRPV1的心脏传入纤维有效缺失。在另一组平行实验中，我们进一步证实了不同剂量（0.5μg/ml、5μg/ml和50μg/ml）的sham+RTX大鼠心外膜应用辣椒素和缓激肽（10μg/ml在不同的时间点（RTX后1周、4-6周、9-11周和6个月）。这些数据表明，5μg/ml和50μg/ml RTX的心外膜应用在很大程度上消除了RTX后1周假大鼠急性心外膜施用辣椒素和缓激肽的心血管反应(图S2B). 然而，在初步实验中，我们观察到，40%接受5μg/ml剂量的RTX心外膜应用治疗的假大鼠，在RTX后10周，对急性心外膜施用辣椒素和缓激肽的心血管反应部分恢复，而所有接受50μg/ml RTX治疗的大鼠在此期间对辣椒素及缓激肽仍不敏感时间点。为了实现长期CSAR消融，我们在以下所有实验中选择使用50μg/ml RTX。我们的时间历程实验数据表明，这种剂量的RTX在心外膜应用后10周以上就消除了急性心外膜使用辣椒素和缓激肽引起的心血管反应，而在RTX后6个月，这些对辣椒素及缓激肽的心血管反应基本恢复(图S2C).
在RTX治疗后9-11周，对假手术组和CHF大鼠进行功能实验比较。如所示与假阳性载体大鼠相比，CHF+载体大鼠心外膜应用辣椒素或缓激肽后MAP、HR和肾交感神经活性（RSNA）反应增强。然而，RTX心外膜预处理几乎完全消除了假手术和CHF大鼠心外膜辣椒素引起的心血管和交感神经激活。RTX还显著减弱了假手术和CHF大鼠缓激肽诱导的CSAR激活。
A-C、原始追踪（A）和平均数据显示了sham+载体、sham+RTX、CHF+载体和CHF+RTX大鼠心外膜应用辣椒素或缓激肽（10μg/ml）后的心血管（B）和交感（C）反应（n=8-12/每组）。A中的比例尺表示30秒。sham+vehicle、sham+RTX、CHF+vehicle和CHF+RTX大鼠的D和E、基础心脏（n=6-8/每组）和肾交感神经活动（n=8-12/每组）以及尿NE分泌（E，n=6/每组）。数值为平均值±SE*P（P）<0.05 vs.sham+载体；†，P（P）与CHF+车辆相比<0.05。
RTX对假手术和CHF大鼠体重、器官重量和血流动力学的影响
各组大鼠的形态学和血液动力学测量总结如下CHF+载体大鼠的心脏重量和肺重量/体重比显著高于假载体大鼠，表明CHF状态下的心脏肥大和肺充血。然而，心外膜RTX预处理后，与CHF+载体大鼠相比，CHF大鼠的心脏重量和肺重量/体重比均显著降低，表明RTX对心肌肥厚和肺充血有保护作用。重要的是，CHF+载体和CHF+RTX大鼠之间的梗死面积没有显著差异(
和
图S3)排除了梗死面积的变化导致CHF+载体和CHF+RTX大鼠心脏重量或肺重量差异的可能性。
表1
溶媒或RTX治疗后假手术和CHF大鼠的血流动力学和形态学数据
| 参数 | Sham+车辆
（n=21） | 假丝+RTX
（n=20） | 瑞士法郎+车辆
（n=23） | 瑞士法郎+RTX
（n=25） |
|---|
| 体重，g | 429 ± 7 | 430 ± 7 | 452 ±8 | 440 ± 8 |
| 心脏重量，mg | 1438±28 | 1430 ± 30 | 2239± 61* | 1650± 49*† |
| HW/BW（毫克/克） | 3.4± 0.1 | 3.3 ± 0.1 | 5.0 ± 0.1* | 3.8 ± 0.1*† |
| WLW/BW，mg/g | 4.4± 0.1 | 4.5 ± 0.1 | 8.7 ± 0.3* | 5.1 ± 0.2*† |
| SAP，毫米汞柱 | 127.9 ± 2.2 | 128.8 ± 2.8 | 115.3± 2.0* | 120.8 ± 2.3* |
| MAP（毫米汞柱） | 103.5 ± 2.4 | 105.0 ± 3.1 | 96.7 ± 2.0* | 101.3 ± 2.1 |
| DAP（毫米汞柱） | 91.6 ± 2.5 | 92.8 ± 3.2 | 87.3±2.2 | 90.8 ± 2.2 |
| LVEDP毫米汞柱 | 5.0± 0.4 | 4.8±0.4 | 21.3± 1.0* | 8.3± 0.7*† |
| 人力资源，bpm | 357.3 ± 6.1 | 362.0 ±6.8 | 368.9 ± 5.1 | 348.3±5.5f |
| dp/dt（dp/dt）最大值 | 9108±324 | 8601±224 | 5137± 180* | 5446±173* |
| dp/dt（dp/dt）最小值 | -8458±235 | -8088±196 | -3452±113* | -4643±149*† |
| 梗死面积，% | 0 | 0 | 42.5± 1.4* | 39.1 ± 1.2* |
血流动力学和超声心动图测量表明CHF+载体和CHF+RTX大鼠之间存在其他一些重要差异。与假阳性载体大鼠相比，CHF+载体大鼠表现出LVEDP升高、射血分数和缩短分数的时间依赖性下降(
和
S1（第一阶段）)表明心室功能下降。然而，CHF+RTX大鼠在CHF+载体大鼠中观察到的LVEDP增加在很大程度上被阻止，这与CHF+RTX大鼠的肺充血也减少的发现一致。与假大鼠相比，RTX治疗显著降低了心肌梗死诱导的CHF大鼠的心脏舒张功能，表现为左室收缩和舒张直径和容积增加(表S1). 有趣的是，尽管RTX降低了LVEDP和心脏舒张功能，但CHF+RTX和CHF+载体大鼠在MI后2周和6周的射血分数或缩短分数没有显著差异(表S1). Dp/dt测量(
和
)进一步显示CHF+载体和CHF+RTX大鼠之间的差异。与假手术+载药大鼠相比，CHF+载药鼠的dp/dt降低最大值和dp/dt最小值，提示CHF大鼠心脏收缩和舒张功能障碍()然而，钝化的dp/dt最小值在CHF+RTX大鼠中，CHF+载体大鼠的舒张功能显著增强，这可能表明CHF+RT大鼠的舒张期功能得到改善。尽管dp/dt没有显著差异最大值在CHF+RTX和CHF+载体大鼠之间休息时，dp/dt最大值与CHF+载体大鼠相比，CHF+RTX大鼠对异丙肾上腺素（ISO）刺激的反应显著增强(). 在分子水平上，CHF+RTX大鼠心肌β1-AR蛋白表达的下降在CHF+载体大鼠心肌中得到部分逆转(). sham+vehicle和sham+RTX大鼠的心脏形态学、超声心动图或血流动力学参数无显著差异。
显示基本dp/dt的代表性轨迹（A）和平均数据（B）最大值和舒张压dp/dt最小值以及ISO对β-肾上腺素能受体刺激的剂量依赖性反应（0.01、0.1和1.0μg/kg，0.2 ml）。数值为平均值±标准偏差。n=6/每组*P（P）<0.05 vs.sham+载体；†，P（P）与CHF+车辆相比<0.05。
A、 代表性的sirus红染色（顶部）和平均数据（右下方）表明RTX可降低心肌梗死（MI）诱导的心肌纤维化；左下角，Masson三色染色显示CHF+Vehicle和CHF+RTX大鼠的梗死面积相似。黑色箭头指向天狼星红阳性染色。B-D，western blotting数据显示sham+Vehicle、sham+RTX、CHF+Vehicle和CHF+RTX大鼠左心室（远端）和隔膜中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤维连接蛋白、转化生长因子（TGF）β1和β1-肾上腺素能受体（β1-AR）的蛋白表达。数据表示为平均值±SE。n=6/每组。*，P（P）<0.05 vs.sham+载体，†，P（P）与CHF+车辆相比<0.05。
RTX对假手术和CHF大鼠心肌纤维化的影响
考虑到RTX介导的CHF大鼠LVEDP降低可能与心脏顺应性的改善有关，我们进一步使用苦味酸红染色和两种纤维化标记物（α平滑肌肌动蛋白和纤维连接蛋白）及其上游激活物转化生长因子（TGF）的蛋白表达来评估心脏纤维化用载体或RTX治疗的假手术大鼠和CHF大鼠的未受损LV和室间隔（IVS）壁中的β受体I。这些数据表明，与假大鼠相比，CHF+载体治疗大鼠的苦味酸红染色增加(). CHF+载体大鼠α平滑肌肌动蛋白、纤维连接蛋白和TGFβ受体I增加(). 慢性心力衰竭大鼠RTX治疗降低了非梗死LV和IVS壁所有这些标记物的表达(). RTX对假大鼠左室和下腔静脉壁无损伤的纤维化标记物和TGFβ受体I的苦味酸红染色或蛋白表达均无明显改变().
RTX对假手术和CHF大鼠基础交感神经张力和动脉压力反射功能的影响
CHF+载体大鼠的基线RSNA和CSNA显著高于假阳性载体大鼠，表明CHF的肾脏和心脏交感神经张力增加。RTX降低CHF大鼠基础RSNA和CSNA(，图S4和图S5). 此外，与溶媒治疗大鼠相比，CHF+RTX大鼠的尿NE排泄量显著减少(). 此外，RTX显著提高了平均斜率和增益最大值降低HR和RSNA对动脉压力反射控制的最小HR和RSA(
和
表S2). 与CHF大鼠相比，对平均斜率、增益没有显著影响最大值假大鼠动脉压力反射控制的最小RSNA或HR(
和
表S2).
原始追踪（A）和平均数据（B）显示了sham+载体、sham+RTX、CHF+载体和CHF+RTX大鼠的压力反射曲线和增益。数据表示为平均值±SE。n=8-10个/每组*P（P）<0.05 vs.sham+载体、sham+RTX和CHF+RTX。
体内溶媒或RTX治疗假手术和CHF大鼠的PV环分析
使用左心室PV循环分析(
和
表S3)与假阳性对照组大鼠相比，CHF+载体大鼠的基础负荷非依赖性收缩功能（通过PRSW关系斜率和ESPVR测量）显著降低。收缩和舒张功能的负荷敏感测量，如最大和最小压力变化率（dP/dt最大值和dP/dt最小值)CHF+载体的射血分数也显著低于假阳性载体大鼠(表S3). 此外，与假阳性载体大鼠相比，CHF+载体大鼠的Tau和LVEDP较高，表明左室主动和被动舒张功能受损。此外，与假手术+赋形剂大鼠相比，CHF+赋形剂大鼠表现出显著的左心室增大，表现为收缩末期和舒张末期容积增加(表S3). 这些数据与超声心动图测量获得的数据一致(表S2). 与假阳性对照组大鼠相比，CHF+载体大鼠的EDPVR也显著升高，表明CHF的心室僵硬度增加(
和
表S3). 与CHF+载体大鼠相比，RTX改善了结构和功能异常，表现为LV室缩小，dP/dt增加最小值EDPVR显示，Tau和LVEDP降低，刚度降低(
和
表S3). 有趣的是，RTX治疗对基础收缩功能（如dP/dt）没有显著影响最大值CHF大鼠PRSW和ESPVR。此外，RTX对假大鼠的收缩和舒张参数没有影响。
用Millar P-V电导导管系统从sham+载体、sham+RTX、CHF+载体和CHF+RTX大鼠获得的稳态P-V回路的A-D原始10秒记录。E和F，显示RTX对假手术和CHF大鼠的收缩（ESPVR，E）和舒张（EDPVR，F）功能的影响的平均数据，这些功能与全身血管阻力无关。数据表示为平均值±SE。n=7-8/每组。*，P（P）<0.05 vs.sham+载体，†，P（P）与CHF+车辆相比<0.05。
RTX对假手术和CHF大鼠心肌细胞凋亡的影响
心脏重塑包括肥大、纤维化和凋亡。基于RTX对CHF大鼠心肌肥厚和心肌纤维化的有益作用，我们进一步研究了RTX对假手术和CHF大白鼠心肌细胞凋亡的影响。进行了TUNEL染色，典型的显微照片如图所示和图S6我们发现，与假阳性载体大鼠相比，CHF+载体大鼠左心室梗死、左心室近梗死区、左心室远端和IVS区的TUNEL阳性细胞显著增加(). 然而，与CHF+载体大鼠相比，CHF+RTX大鼠左室梗死、左室近梗死、左心室远端和IVS区的TUNEL阳性细胞显著减少(). sham+vehicle和sham+RTX大鼠心脏中TUNEL阳性细胞的数量没有显著差异。此外，免疫组织化学染色的数据表明，与假阳性对照组大鼠相比，CHF+载体大鼠心肌的LV近端、LV远端和IVS区的caspase 3阳性心肌细胞裂解增加，这主要是由于冠状动脉结扎后心外膜应用RTX所阻止的(图S7A). 此外，与假阳性对照组大鼠相比，CHF+载体大鼠心肌LV远端和IVS区裂解caspase 3的蛋白表达显著增加，而RTX治疗阻止了CHF大鼠心肌裂解caspase3蛋白表达的增加(图S7B和S7C).
代表性扫描图像（A）和平均数据（B-D）显示，来自sham+vehicle、sham+RTX、CHF+vehicle和CHF+RTX大鼠的左室梗死、左室近梗死、左心室远端和IVS区域的TUNEL阳性染色。数据表示为平均值±SE。n=5-6/每组。*，P（P）<0.05 vs.sham+载体，†，P（P）与CHF+车辆相比<0.05。
讨论
当前研究的结果清楚地表明，在心梗形成之前，心外膜应用RTX可消除增强的CSAR，防止过度的肾和心脏交感兴奋，并增加CHF大鼠的钝性压力反射。重要的是，我们发现在心外膜应用RTX可以阻止CHF状态的许多病理指标。这些包括LVEDP升高、肺水肿、心肌肥大、心室扩张和收缩储备，以响应ISO对β肾上腺素能受体的刺激。RTX还能改善CHF大鼠的心肌纤维化和细胞凋亡。据我们所知，这些是第一批表明选择性心脏交感传入性聋可能对改善CHF状态下的心脏和自主功能具有临床益处的数据。
心脏交感神经活动增强是CHF患者的主要特征11，12在动物模型和人类中，长期刺激β-肾上腺素能神经激素轴已被证明有助于CHF的进展和死亡率13，14对反映心脏交感神经活动的CHF患者心脏NE溢出的测量表明，它比交感神经对其他器官的活动增加得更早、更大15-17本研究中基于直接CSNA记录的数据也支持CHF大鼠的基础心脏交感神经张力明显高于假大鼠的概念。然而，CHF患者心脏交感神经流出增加的机制尚不完全清楚。一种可能的解释是CHF患者心脏交感传出流（也称为“心-心反射”）的CSAR控制增加。众所周知，心肌缺血会释放大量代谢产物，包括缓激肽、ATP、前列腺素和质子，刺激心脏交感传入神经末梢，引起MAP、HR和交感神经活动的兴奋性反应1，三，4.本实验室以前的研究1，2结果表明，急性心外膜应用利多卡因（阻断心脏交感传入）可降低麻醉CHF犬和大鼠的基线MAP、HR和RSNA，但在假动物中没有降低，表明CSAR具有张力性激活作用，并有助于CHF肾交感神经活性升高。我们进一步报道CSAR被敏化的位点位于两个传入末梢18以及中枢神经系统19CSAR的强直性激活是否也有助于心脏交感神经活性的升高尚不清楚。在本研究中，我们提供了直接证据，证明通过心外膜应用RTX选择性心脏交感传入神经去传入可以防止CHF大鼠局部过度的心脏交感神经激活。通过RTX阻断心脏交感神经激活的CSAR控制后，我们还观察到CHF大鼠心肌结构和功能的多项改善。这些发现突出了CSAR对CHF患者心脏交感神经张力增强和心脏重塑的重要作用。
我们检测了接受RTX治疗的CHF大鼠心脏重塑和功能的多项指标。我们的数据显示心室尺寸减小，LVEDP降低，心肌肥厚减轻，心肌纤维化和凋亡减弱。基于这些保护作用，我们认为RTX介导的CHF大鼠心脏舒张功能的改善至关重要。与CHF+溶媒大鼠相比，经RTX治疗的CHF大鼠LVEDP和肺充血没有表现出预期的增加。我们的P-V环路数据证实了RTX对衰竭心脏的心脏舒张功能的直接有益影响，与全身血管阻力无关。此外，我们的分子数据表明，RTX通过减少经典TGF-β受体纤维化信号通路的激活，减轻了CHF大鼠LV和IVS非梗死区域的心肌纤维化。综上所述，这些数据表明，CHF+RTX大鼠观察到的LVEDP降低至少部分是由于RTX介导的心脏顺应性改善。由于外周静脉床由交感神经高度支配，RTX诱导的CSAR衰减降低了CHF中过度的全身交感兴奋，另一种可能是静脉收缩减少，从而减少心脏充盈，这将有助于降低RTX治疗CHF大鼠的LVEDP。
关于RTX对CHF患者心脏收缩功能的影响，重要的是要强调RTX对dp/dt的有利影响最大值在基础（非刺激）状态下不明显，而是对ISO刺激β肾上腺素能受体的反应，表明RTX治疗后心肌收缩储备显著增加。这一发现与RTX部分阻止CHF大鼠心肌β1-AR下调的观察结果一致。RTX部分恢复CHF中β1-AR表达的潜在机制尚待确定。一种合理的推测是，通过消除CSAR对心脏交感神经流出的影响，从而减少过度心肌NE释放，β1-AR发生上调14然而，这一假设尚待证实。
RTX治疗在其他方面影响重塑过程。在CHF+RTX大鼠中，与CHF+溶媒大鼠相比，即使射血分数和梗死面积相似，左室收缩末期和舒张末期直径和容积减小，也反映出左室容积较小。众所周知，在CHF进展过程中，缺血区的持续缺血和炎症损害肉芽组织、细胞外基质形成（ECM）和缺血心肌细胞的存活，导致衰竭心肌的延伸和扩张20目前的研究提供了强有力的证据，证明在心肌梗死发生时应用心外膜RTX可以减少这种恶性循环并延缓CHF状态的进展。在怀特等人之前的研究中。21明确显示，左室收缩末期容积而非射血分数是心肌梗死恢复患者存活的主要决定因素。因此，RTX介导的心脏容积减少可能有助于提高心肌梗死患者的存活率。
RTX可显著改善CHF大鼠左心室梗死区和非梗死区的心肌细胞凋亡。众所周知，细胞死亡是心脏重塑的重要决定因素，因为它会导致收缩组织的丧失、心肌细胞的代偿性肥大和修复性纤维化22因此，RTX介导的心脏凋亡减少可能在CHF大鼠的多重RTX介介导的心肌保护作用中发挥重要作用。心脏细胞凋亡减少的机制尚不清楚。考虑到1）过度β-AR刺激已被报道诱导心肌细胞凋亡体内和在体外23，242）RTX可防止CHF患者心脏交感神经张力的过度升高，推测RTX可能通过CSNA-β-肾上腺素能神经内分泌轴减少心脏细胞凋亡。需要进一步研究，以探讨RTX诱导的CHF心肌细胞凋亡保护的分子机制。
CSAR是一种交感兴奋性反射，有助于交感神经张力的提高。后者可对抗CHF状态下的压力反射功能。在之前的一项研究中2我们报道，在CHF麻醉大鼠中，急性心外膜应用利多卡因降低了基线RSNA，改善了RSNA的压力反射控制受损，表明强直性心脏交感传入在减弱CHF压力反射中起着重要作用。在最近的一项研究中25，我们进一步报道，心外膜应用辣椒素对心脏交感传入的急性刺激显著降低了麻醉大鼠孤束压敏核（NTS）神经元的基础放电，表明NTS在处理CSAR和压力反射之间的相互作用中起着重要作用。然而，由于这些先前研究中实验的急性性质，尚不清楚CSAR和压力反射之间的相互作用是否存在于更慢性的病理条件下，如CHF。在本研究中，我们进一步发现，心肌梗死发生时心外膜应用RTX可以防止心肌梗死后9-11周HR和RSNA的压力反射控制减弱，这表明CHF中CSAR和压力反射之间存在慢性相互作用。此外，利多卡因的作用1，2RTX对压力反射功能的改善似乎与CHF状态有关，因为在假手术大鼠心外膜应用利多卡因后，我们没有发现RSNA和压力反射参数发生任何变化1，2或RTX表明，在正常状态下，在交感神经活动的调节或与压力反射的相互作用中，几乎没有强直性心脏交感传入输入。
在目前的研究中，RTX被选择性地输送到心外膜，以消融表达TRPV1的心脏传入纤维。Zahner等人之前的研究。5显示经RTX全身治疗后交感血管舒缩张力完整。Szolcsanyi等人的另一项研究。26据报道，全身注射RTX后，电刺激外周迷走神经引起的心动过缓和血压下降未受到损害，表明RTX预处理后心脏副交感神经张力保持不变。此外，巴伯等人（Barber et al。27据报道，在犬模型中，心外膜应用苯酚（一种非选择性神经毒素）可阻断交感传入而非迷走神经传入，表明迷走神经主要位于左心室深层，受心外膜用药影响较小。这一发现对目前使用RTX心外膜应用的情况很重要，因为它使RTX心外应用在靶向心脏交感传入神经方面更具特异性，即使迷走神经传入神经的一小部分也表达TRPV1受体。因此，RTX似乎选择性地靶向心脏交感传入，而不损害心脏交感和副交感传出神经和迷走神经。使用这种选择性心脏传入脱敏策略，我们证明了RTX诱导的CSAR抑制对CHF大鼠心脏和自主功能的多种有益作用。与目前研究的系统性删除小鼠TRPV1受体的基因敲除技术相比，已有相互矛盾的发现28-31关于TRPV1整体缺失对心脏功能的有益或有害影响。选择性表达TRPV1的心脏传入消融术与全身药理拮抗或TRPV1受体基因缺失策略之间存在一些主要差异。当前研究与上述研究之间的最大区别在于，RTX不仅删除心脏传入神经中的TRPV1受体，而且还损伤表达TRPV1的神经末梢，而不仅仅是阻断TRPV1感受器。考虑到TRPV1表达的心脏交感传入末梢也表达许多其他感觉受体，如速激肽和嘌呤能受体，RTX也会在TRPV1表示的心脏传入神经末梢受损后损害这些感觉受体。这解释了为什么心外膜RTX应用阻断了心外膜辣椒素和缓激肽诱导的心血管反应，而使用心外膜ido-RTX阻断TRPV1受体只能消除心外膜辣椒素诱导的反应，而对缓激肽诱发的心血管反应没有任何影响5此外，应该指出，基因敲除动物从出生时就有系统性TRPV1缺失，这就提出了发育和代偿性变化的问题。类似的问题可能在其他TRPV1整体缺失模型中起作用，例如用大剂量辣椒素治疗的新生大鼠模型32有明确证据表明，成年大鼠在出生时接受辣椒素治疗，其基础冠脉流量和心肌细胞大小均减少32当心脏暴露于缺血或压力过载时，这种效应可能导致心脏损伤增加。最后，使用基因敲除或系统药理学技术的TRPV1全局缺失将影响中枢和外周神经系统，并导致TRPV1激活的保护和有害作用的丧失。因此，我们认为，与那些使用药物拮抗或TRPV1受体基因缺失的研究相比，选择性消融表达TRPV1的感觉传入可能会或可能不会在MI大鼠中实现相同的心血管效应。
限制
在本研究中，RTX的心外膜应用是在心肌梗死时进行的，而不是在心肌梗死后几天或几周。因此，RTX对心脏和自主功能的有益作用表明，它对心肌梗死后大鼠有害心脏重塑的进展具有早期保护作用。然而，心肌梗死后几天或几周在心外膜应用RTX是否对心肌梗死后大鼠的心功能障碍有类似的有益影响尚不清楚。我们推测，与心肌梗死后中期或晚期相比，心肌梗死期间或心肌梗死后早期在心外膜应用RTX对心脏功能障碍的保护作用更大。例如，目前的研究发现，心肌梗死期间心外膜应用RTX可在很大程度上预防心肌梗死后大鼠的心脏纤维化，但在心肌梗死后中期或晚期心外膜使用RTX则不太可能产生同样的有益效果，因为在此期间心脏纤维化已得到很好的发展。Judd和Wexler之前的研究33据报道，心肌羟脯氨酸（一种主要存在于胶原蛋白中的氨基酸）含量在心肌梗死后第7天增加，在心肌梗死约2周后进一步增加。这可能表明RTX介导的心肌纤维化保护作用的潜在理想治疗窗口。一旦心肌胶原积累得到很好的建立，RTX对当前研究中观察到的心脏纤维化的潜在保护作用可能会降低。显然，需要进一步研究来解决这个问题。
本研究的另一个潜在局限性与RTX诱导的心脏传入消融后的潜在神经再支配有关。Karai等人之前的研究。34据报道，皮下或鞘内注射RTX（6μg/ml，30μl）可减轻大鼠的热伤害和炎症性痛觉过敏。有趣的是，皮下注射RTX对炎性痛觉过敏的有益作用仅持续约20天，而鞘内注射RTX的作用持续时间更长（至少1年）。在当前的研究中，当在心脏表面应用较高浓度（50μg/ml）的RTX时，我们发现这种治疗至少在9-11周内消除了CSAR。然而，我们确实观察到在心外膜应用RTX 6个月后CSAR敏感性恢复，这表明如果在临床环境中进行这种干预，可能需要重复。另一方面，根据Karai等人的研究。34胸椎节段鞘内注射RTX消融TRPV1表达的心脏交感传入神经元可能是MI患者长期消融CSAR的替代方法。显然，需要进一步研究来解决这个问题。此外，我们承认本研究的一个局限性是所有的终末实验都是在麻醉下进行的。一些血流动力学数据，如基础血压和心率，应通过有意识的遥测记录进一步确认。最后，我们承认一个局限性，即当前的研究没有回答冠状动脉结扎期间心外膜应用RTX是否可以减少梗死面积的问题，因为我们排除了CHF+载体组和CHF+RTX组中MI较小的动物，以排除手术变异性对心功能的可能贡献。应该进行更多的研究来解决这一重要问题。
总之，本研究提供了第一个证据，证明心肌梗死期间通过心外膜应用RTX选择性心脏交感传入神经切断可以预防心肌梗死后9-11周大鼠的心脏和自主神经功能障碍。这些发现证明了心肌梗死后心室重构中CSAR靶向缺失的重要性和治疗潜力。图S8总结了CSAR在调节交感神经流出中的潜在作用，以及在交感神经兴奋性疾病状态下如何阻断这种反射。
视角
RTX是辣椒素的一种超强效类似物，能够诱导表达TRPV1的传入神经元和纤维的快速变性5-7，因其镇痛性能而被广泛探索35-37。目前的研究报告了一种新的RTX应用于心肌梗死后患者心脏重塑过程的潜在干预。我们认为，有可能通过心包穿刺将RTX输送到心脏表面，从而选择性地消融CHF患者的心脏交感神经传入。因此，我们目前的研究发现，RTX诱导的CSAR去传入可以预防CHF大鼠的心脏重塑并减少心血管功能障碍，具有很高的翻译潜能。该实验室正在进行的研究正在进一步研究RTX心外膜应用对较大动物模型心脏功能障碍的潜在有益影响。
致谢
作者感谢约翰尼·哈克利女士、帕姆·库里女士、凯伊·塔尔比策女士和理查德·罗宾逊先生提供的专业技术援助。我们还感谢David Wert博士和UNMC组织科学设施在组织病理学、TUNEL和裂解caspase 3染色实验方面的帮助。
资金来源
这项工作得到了美国心脏协会（11GRNT7530022）的支持，并部分得到了国家心脏、肺和血液研究所（PO1 HL62222）的资助。作者在披露本研究的资金或行业补偿方面没有利益冲突。
工具书类
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