自然神经科学。作者手稿；PMC 2014年3月13日提供。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院557402
最小的中风：一条贯穿血管的阻塞会导致梗死和认知功能障碍
,1 ,1 ,1 ,2 ,1 ,3和1,4
蔡英文（Philbert S.Tsai）
1美国加州大学圣地亚哥分校物理系
帕特里克·D·莱登
3美国加利福尼亚州洛杉矶Cedars-Sinai医院神经科
大卫·克莱菲尔德
1美国加利福尼亚州拉霍亚加利福尼亚大学圣地亚哥分校物理系
4美国加利福尼亚州拉霍亚加利福尼亚大学圣地亚哥分校神经生物学系
1美国加州大学圣地亚哥分校物理系
2美国加州大学圣地亚哥分校药理系
3美国加利福尼亚州洛杉矶Cedars-Sinai医院神经科
4美国加州大学圣地亚哥分校神经生物学科
通信：加州大学圣地亚哥分校物理系David Kleinfeld，地址：9500 Gilman Drive，La Jolla，CA 92093-0374，办公电话：858-822-0342，传真：858-534-7697，ude.dscu.scisyhp@kd 现住址：南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学神经科学系（A.Y.S.），以色列特拉维夫特拉维夫大学神经科学部（P.B.）。
- 补充资料
补充数据。
GUID:31FC0588-3FE9-4BD2-904F-B0D6D38D0519
摘要
微梗塞存在于老年人和受伤的人脑中。它们的临床意义存在争议，推测的后遗症范围从认知障碍到血管性痴呆。为了解决微梗死的后果，我们使用受控的光学方法在大鼠皮层内形成单个穿透小动脉或小静脉的闭塞。单个微梗死，靶向覆盖全部或部分皮质柱，损害了基于大触须的行为任务的表现。此外，多个靶血管造成了组织损伤，并在皮层上融合，尽管介入的穿透血管已严重通畅。闭经后服用美金刚，一种谷氨酸受体拮抗剂，可减少阿尔茨海默病的认知衰退，改善组织损伤和知觉缺陷。总的来说，这些数据表明微梗死可能是认知功能下降的原因。在缺血性损伤治疗中取得有限成功的策略，包括抗兴奋性毒性的治疗，可能会成功对抗血管性痴呆的进展性。
关键词：兴奋性毒性、缺血、大弧菌、美金刚、NMDA受体、躯体反应、双光子显微镜、血管学
年龄或受伤导致的认知障碍有许多根本原因。来自老年患者的证据表明，认知能力下降的共同基础是大脑微血管的破坏1–3对痴呆患者的尸检研究除其他病理学外，还发现了大量的皮质微梗死4–7直径约为0.1至1 mm(). 这些微梗死常与多种血管病变并列，包括透明动脉硬化、血管腔完全或部分闭塞以及血管壁发炎4然而，体内试图确定这种微梗死是否与认知功能下降同时发生，或甚至是预测认知功能下降的研究，由于无法用传统的非侵入性成像解决这种小病变而受到阻碍2因此，目前尚不清楚微梗死在很大程度上是良性的还是促成因素。这意味着需要一个实验模型来直接检查大脑皮层小血管血栓形成的后果，并作为减轻血管疾病继发认知障碍治疗的试验台。
人和大鼠皮层微梗死的相似性（a）老年人大脑皮层微梗死的组织学研究。梗死区内充满反应性星形胶质细胞，胶质纤维酸性蛋白（GFAP，棕色）染色。组织用苏木精（蓝色）复染。改编自Sofronew和Vinters14.（b）大鼠皮层单个穿透小动脉闭塞7天后可见的微梗死。用α-NeuN评估神经活性，用α-GFAP染色评估星形胶质细胞增生症。改编自百叶窗等。8.
啮齿动物皮层血管构筑的拓扑结构8具有与人类相似的基本特征9这支持了啮齿类动物模型的实用性，以检查单个皮质小血管的血栓形成是否可能是微梗死的基础，以及如此小范围的中风是否会对认知产生负面影响。在这方面，我们将重点放在穿透血管、在皮质表面和实质之间穿梭血液的小动脉和小静脉上10过去的研究表明，穿透小动脉11和小静脉12形成微血管附近血液供应的瓶颈。这突出了穿透血管在血管疾病中的脆弱性8,11,12即使是单个皮质穿透小动脉的血流丧失，也会产生名义上的柱状微梗死，这种微梗死可以延伸到皮质的整个深度8,13(). 啮齿动物的小中风似乎在几何形状上与人类的微梗死相匹配14()以及，如下文所示，诱导局部炎症反应的能力，与啮齿动物和灵长类动物皮层微血管的大小一致15,16.
在这里，我们利用靶向微闭塞的啮齿动物模型来探讨微梗死的潜在认知影响。我们的首要目标是揭示进展性认知能力下降中微梗死的所谓“沉默”特征，以及其病因和对药物干预的反应。我们问：(我)血管拓扑结构、血流量和血管类型等特征如何影响皮质微梗死的程度？(ii（ii）)单个脑血管闭塞会导致认知障碍吗？(三)多个小血管闭塞的累积如何影响组织完整性？(iv（四）)哪些治疗药物可以消除微梗死的范围和潜在影响？
结果
我们使用体内双光子激光扫描显微镜17通过麻醉大鼠体感皮层的颅窗观察血管和神经元18每立方毫米的大鼠皮层平均包含6个穿透小动脉和16个穿透小静脉（n=9只大鼠）。穿透性血管起源于表面血管系统的分支，并沿放射状潜入薄壁组织(). 我们将所有血管分为三类：穿透性小动脉、穿透性小静脉和深部微血管，即，从软脑膜表面下方的穿透血管分支的血管段。每种类型的血管都与管腔直径和红细胞（RBC）速度的范围有关；这些参数用于计算通过容器的体积流量。贯穿件容器支持的通量值19主要从100 pL/s到10 nL/s，而深部微血管支持的数值主要在1到100 pL/s之间(). 深部微血管的数量进一步分析为血管亚型(补充图1a–d)，但为了清晰起见，这里汇集了。我们考虑每一类中单个血管闭塞导致的组织损伤。
皮层血管的拓扑和流动动力学（a）皮质血管系统的三维重建3从大鼠皮层采集的组织体积体内穿透小动脉（红色）深入皮质，供养深部微血管（白色），而穿透小静脉将血液回流至软脑膜表面（蓝色）。（b）从单个血管采集的红细胞速度和管腔直径的动态。灰色线条对应恒定的红细胞体积流量。
我们实施体内双光子显微镜使我们能够使用两种互补的技术在位于大脑表面上和下面的靶向单个血管中形成凝块20在循环光敏剂Rose Bengal的作用下，聚焦绿色激光的线性吸收使皮质表面附近的穿透性血管闭塞21血管腔内的闭塞在60到90秒内完成。深部微血管被放大超短激光脉冲的非线性吸收所阻断，以产生高聚焦照射，而不会影响靶血管上方或下方的组织22微血管管腔在120秒内完全闭塞。
单一穿透性血管闭塞的急性后果
神经元缺陷发生的时间窗是什么？为了回答这个问题，我们调查了单一穿透性血管血栓的急性后果。我们第一次使用体内神经元[Ca成像2+]用双光子显微镜17评估微梗死核心内功能性诱发神经元活动的丧失。为此，我们在初级体感皮层相对较大的后肢区域进行了成像，在该区域外周电刺激可以可靠地激活大量神经元。加利福尼亚州2+-加载敏感染料OGB1-AM23皮质内，第2/3层神经元对肢体刺激的反应被量化为血栓形成后时间的函数().
急性神经病理学与微梗死的生长（a）
体内用双光子成像技术研究钙负载的体感皮层肢体区域的神经元活动2+指示剂OGB1-AM和星形胶质细胞特异性染料SR101。（b）[加利福尼亚州2+]刺激后肢诱发的单个2/3层神经元的反应。（c）可见单个穿透小动脉的闭塞会逐渐降低局部神经元的反应性。下部面板显示了作为闭塞后时间函数绘制的反应神经元比例。折线图表示为平均值±标准误差（与基线相比，n=4；*p=0.015）。（d）阻断单个穿透性小静脉可以逐渐降低局部神经元的反应性。下图显示了随着时间的推移，反应神经元的比例。（与基线相比，n=5；*p=0.014）。（e）同一颅骨窗（前肢）内的远端控制区也装有OGB1-AM，在后肢皮层闭塞后（n=4），神经反应性没有丧失。（f）闭塞6小时后微梗死的组织学检查。组织缺氧，用α-缺氧探针鉴定™（每种血管类型中n=6），与微梗死核心内荧光素-dextran的内皮滞留重叠（黄色虚线）。（g）如碘化丙啶摄取所示，坏死细胞环勾画出微梗死边界（每种血管类型中有4种）。（h）炎症细胞的α-CD68染色（每种血管类型中有11种）。（i）皮层扩散性抑制波，以30μm/s的速度移动，观察对象为体内[加利福尼亚州2+]单个穿透性小动脉闭塞后的成像（红色虚线）（左图中的红色箭头）。加利福尼亚州2+30分钟后观察到波形。右侧面板中的插图（蓝色边框）显示了放大图像的时间进程。
发现对后肢刺激有反应的神经元数量在单个穿透小动脉闭塞后的前两小时内急剧减少(). 在阻断单个穿透性小静脉后观察到类似的效果(). 作为对照，Ca2+-敏感染料也被加载到代表前肢的区域，该区域距离后肢区域超过一毫米。前肢区域在三个小时内对刺激保持反应，这表明中风引起的功能丧失并不是由动物的一般代谢衰竭引起的(). 定期监测闭塞血管，以确保血栓在整个成像期间保持稳定。
与微梗死核心的神经功能丧失一致，穿透性小动脉或小静脉的闭塞在闭塞后6小时的急性期内会产生严重的缺氧状态，即。，氧化铅2<10 mm Hg，如α-缺氧探针报告™染色事后的，事后的组织学19(,左侧面板). 缺氧组织与微梗死核心的一列严重血管病变精确重叠(,右侧面板)深部微血管内皮细胞中循环荧光素-dextran的滞留突出了这一点24此外，微梗死核心的α-3-硝基酪氨酸标记增加，表明细胞和血管内的氧化蛋白损伤25α-水通道蛋白-4染色减少，大鼠α-免疫球蛋白G染色增加，表明星形胶质细胞的病理学和血脑屏障渗漏26分别为(补充图2). 梗死的边界并没有从病理学上幸免，因为它是用碘化丙啶阳性细胞勾画出来的27(); 这表明膜降解。我们进一步注意到微梗死核心内外与巨噬细胞标记物α-CD68的反应性(). CD68染色是临床微梗死的常见标志物28最后，沿中风边缘观察到小胶质细胞突起壁，可能是为了限制损伤(补充图3).
发现单个穿透性血管的闭塞，无论是小动脉还是小静脉，都会导致缺血性损伤的多种特征(,补充图2和3)提示细胞死亡向外扩散，半影逐渐消退。为了支持这一假设，细胞内[Ca增加的波2+]在穿透性小动脉闭塞的反应下，观察到从微梗死核心向外扩散数百微米，表明抑郁正在扩散29(). 这些事件的速度，即30至70μm/s，与过去的情况类似体内成像研究30.
单个穿透性血管凝块后的微梗死
一个穿透性小动脉的闭塞会导致一个高度局限的、名义上呈柱状的组织梗死区域，持续7天8如图所示，神经元体细胞中的泛神经标记物α-NeuN未染色的区域(,&补充图4a)以及反应性星形胶质细胞的局部增殖(&补充图4a). 穿透性小静脉闭塞的慢性结果尚未报道，也不容易预测，因为在啮齿动物皮层，穿透性小血管的数量超过小动脉，并且在软脑膜表面高度侧支化12事实上，穿透性小静脉闭塞导致微梗死，与穿透性小动脉闭塞引起的微梗死非常相似，如α-NeuN染色缺失所示(&补充图4b)和反应性星形胶质细胞增生症(补充图4b). 两种微梗死类型均表现为Nissl小体密集堆积，提示神经胶质瘤亚急性病变(补充图4c，d). 穿透性小动脉和小静脉微梗死的直径分别为460±70μm（平均值±标准差）和500±120μm，深度分别为1.17±0.32 mm和1.30±0.25 mm（相对于软脑膜），从而产生统计上相同的220±140 nL和210±100 nL的微梗死体积。梗死体积与闭塞前红细胞通过血管的流量相关(); 流量较大的血管闭塞导致较大的微梗死。这些数据表明，在微梗死发生方面，穿透性小动脉和小静脉的闭塞大致相等。
大鼠皮层穿透性小动脉和小静脉闭塞引起的慢性微梗死（a至c）单支血管闭塞导致的微梗死。每栏显示血管闭塞方法的动画（顶部）、闭塞前后目标血管的平面双光子图像（中部），以及闭塞后7天通过α-NeuN免疫组织化学评估组织活力。（d）单个穿透血管的微梗死体积与闭塞前红细胞体积流量的散点图。微梗死体积与流量相关；小动脉的R=0.8（n=11；p=0.0039），小静脉的R=0.7（n=8；p=0.049）。数据遵循一个幂律（拟合线），体积为∞（通量）n个其中，对于小动脉和小静脉，n分别为0.33±0.05（平均斜率±s.d.）和0.12±0.02。横杆显示每个血管组中所有数据点的平均值±s.e.m。（e）单个深部微血管损伤体积与闭塞前红细胞流量的散点图。横杆显示平均值±标准差，不包括微梗死体积为零的数据点。
与穿透血管的病例相比，深部微血管闭塞后检测到的组织梗死很小(). 靶向微血管包括源穿透血管的直接分支或距离穿透血管两个或多个分支点的血管；荧光素-dextran的内皮滞留是组织学中靶向微血管的敏感指标22。我们再次使用垂死细胞对碘化丙啶的核摄取来检测坏死损伤的小区域27我们发现这些微血管的闭塞是源穿透血管的直接分支，即，皮下小动脉或小静脉，产生极小且短暂的组织损伤区域，最大梗死体积为0.8 nL(&补充图1e). 然而，微血管的闭塞是贯穿血管的两个或多个分支点，即毛细血管，导致无明显组织损伤(&补充图1f). 这些发现与循环连接的微血管网络相一致，下游血管分支的血流可以逆转以补偿血栓形成后的血流损失22由于与穿透性血管相比，深部微血管闭塞造成的损伤可以忽略不计，因此没有进一步研究此类损伤。
NMDAR拮抗剂对微梗死生长的抑制作用
我们推测梗死的急性扩张，特别是当它涉及兴奋毒性波时()可能需要治疗干预。因此，我们接下来测试了在梗死发生后服用神经保护剂是否可以减缓其生长。NMDA型谷氨酸受体拮抗剂（NMDAR）是一种潜在的治疗药物，可用于治疗与年龄相关的病理学，这些病理学被认为涉及兴奋性毒性，如血管性痴呆31和神经变性32我们研究了一种非竞争性谷氨酸受体拮抗剂MK-801和一种中度亲和力非竞争性的谷氨酸受体阻断剂美金刚对单个穿透性血管闭塞引起的微梗死体积的影响(). 这两种拮抗剂均通过腹腔注射，被发现在减少因穿透性小动脉闭塞引起的微梗死体积方面非常有效()或小静脉(). 值得注意的是，在闭塞开始后30至45分钟内给药美金刚。
服用NMDAR拮抗剂减少孤立性微梗死体积（a至c）两种NMDAR拮抗剂，MK-801和美金刚（Mem），降低了微梗死体积。通过α-NeuN免疫组织化学评估，在软脑膜表面以下800μm深度的梗死组织的代表性图像。（d）每个治疗组中单个穿透性小动脉闭塞导致的孤立性微梗死体积。条形图表示为平均值±标准差（对照组n=11、8和7，MK-801和美金刚分别；对照组**p=0.006，MK-8001，对照组**p=0.003）。各组间目标血管的闭包前红细胞体积流量无统计学差异（p=0.44）。（e）每个治疗组中单个穿透性小静脉闭塞导致的孤立梗死体积。（对照组n=8、7和16，MK-801和美金刚分别；对照组***p<0.0001，MK-8001，对照组**p=0.002，美金刚）。两组间目标血管的咬合前红细胞流量无统计学差异（p=0.51）。（f）在使用和不使用NMDAR拮抗剂的所有闭塞数据中，闭塞后5至7天微梗死半径的累积概率。红色和蓝色曲线分别对应于穿透小动脉和小静脉。注意到用拮抗剂治疗后，微梗死的大小显著减小。静音曲线是第2/3层微血管中红细胞速度的急剧下降，是与闭塞距离的函数，改编自西村等。11; 数据显示为平均值（红色）±标准误差（灰色）。
所有未使用和使用NMDAR拮抗剂的闭塞的汇总统计数据表明，梗死半径的中位数从230μm减少到50μm()，这表明存在相对较大的可挽救半影。值得注意的是，梗死的最大半径约为310μm，接近于闭塞处的距离，在闭塞处，皮质2/3层微血管内的红细胞恢复正常流动(). 此外，使用NMDAR拮抗剂治疗后的最小损伤半径约为25μm，对应于单个局部闭塞后血流完全停止的半径，即，缺血核心().
穿透性血管闭塞后的认知障碍
我们找到了问题的症结所在，并询问是否仅因一条穿透血管闭塞而导致的微梗死会导致认知功能障碍。为了解决这个问题，我们使用了一种涉及大触须（啮齿动物用来感知前方物体的长毛）的躯体感觉的范式。每个大触须的运动都由受体感知，其输出主要传递到初级触须感觉皮层（vS1）中直径约400μm的单个皮层柱33,34该任务基于局部感官输入，导致认知决策和运动计划，即交叉或不交叉，与纯粹的感官测量相对。
老鼠的mystacial pad被修剪成一条大触须，训练它们穿过一个分隔两个高架平台的缝隙，以获得水的奖励35该范式在红外光下操作，以消除作为潜在混淆物的视力。对于相对较小的间隙，如果目标平台可以与鼻子或爪子接触，则老鼠穿过开口(). 对于中等间隙距离，大鼠栖息在平台边缘，伸出大触须来感知目标平台的存在，然后再决定是否穿越(). 使用大触须，而不是用鼻子触碰，可以让老鼠在缝隙中探测到一到两厘米的额外距离。最后，随着间隙的进一步扩大，大鼠无法用伸出的大触须接触到目标平台，也不会试图穿过间隙，以免从开口处掉落(). 这种范式将单个大触须的使用隔离开来，以跨越中间间隙距离，从而提供了易于控制的条件，以测试基于相应皮层柱功能的感知。
电颤初级感觉皮层单一穿透性血管闭塞后的认知缺陷（a至c）缝隙交叉任务中大鼠行为总结。在短距离内，动物用鼻子检测到目标平台的存在（面板a）。在中间距离，动物伸出其大触须来探测平台（中间面板b）。在很远的距离上，平台是无法到达的，动物也无法穿过（面板c）。图片显示了在一次试验中试图接触目标平台的触须位置。（d）实验测试ON-目标中风的影响。（e）
后hoc组织学显示在单个穿透性小静脉闭塞后定位于C2柱的微瘢痕。（f）正常情况下（黑色曲线）、微梗死后（红色曲线）和C2大触须切除后（蓝色曲线），每个间隙距离的成功交叉概率为0.95置信区间。（g）ON-目标队列的跨缺口赤字总结。条形图表示为平均值±s.e.m.（n=10；****p<0.0001，与正常条件相比，以及##p=0.008，与微梗死后相比）。（h至k）与正常条件相比，用于测试关闭目标冲程（n=3；*p=0.016）效果的控制实验，以及#与微梗死后相比，p=0.016）。
一旦每只动物都接受了充分的训练，我们就建立了一条心理测量曲线，用以计算动物通过缝隙的概率，该概率是缝隙宽度的函数(;黑色曲线). 该曲线确定了动物跨越间隙的0.5度距离，并作为同一动物后续比较的基线距离。
这些动物被分为两组。在第一组中（n=10；4小动脉和6小静脉）()确定为ON-靶向闭塞，通过内在光学成像结合触须刺激选择靶向闭塞血管36，以确定接受C1或C2大触须主要输入的皮层柱的位置。然后我们封堵了穿透性血管，小动脉或小静脉，该血管最好位于该柱中心(&补充图5)预计会形成覆盖大部分皮层浅层和中层的微梗死(). 然后在咬合后的第四到第七天对动物进行跨缝测试(;红色曲线). 在每种情况下，当间隙足够短，动物可以用鼻子接触目标平台时，动物仍然可以执行任务(;红色圆圈). 然而，由于间隙较大，老鼠无法再检测到目标平台，尽管视频显示目标平台与老鼠的大触须接触(;红色正方形). 根据一条新的心理测量曲线，对单一穿透性血管阻塞导致的行为缺陷进行了量化，该曲线表明，在0.5度的交叉中，通航间隙减小了约1cm(;囊性纤维变性黑色和红色曲线). 队列中也发现了类似的结果(;红条). 最后，作为阳性对照，在ON-目标队列中去除单个C1或C2大弧菌导致，即，~0.1 cm，队列中0.5个交叉口的通航间隙减小(;囊性纤维变性红色和蓝色条). 这揭示了一种微小但重要的功能补偿，与触诊相一致，触诊导致邻近卵泡、触须残端和相应的皮层柱的激活37.
在第二组动物（n=3）中，对穿过血管进行封堵，这些血管为vS1皮质中相关皮质柱远处的皮质区域提供血液()确定为非目标闭塞。这些阴性对照动物没有表现出由血管闭塞引起的间隙交叉缺陷(;囊性纤维变性黑色和红色曲线，红色圆圈). 作为对这些动物的阳性对照，去除单个大触须使心理测量曲线偏移了1厘米以上，正如预期的那样，因为动物无法再接触目标平台(;囊性纤维变性红色和蓝色曲线，蓝色圆圈). 在受试者队列中也发现了类似的结果().
在行为评估的最后一天对动物实施安乐死，以便组织学确定穿透性血管闭塞导致的梗死的位置和大小。这些数据表明，仅阻断一条穿透血管就足以消融ON-靶组vS1皮质内的整个皮质柱(&补充图5)对于OFF-目标组，在vS1皮层外有一个类似大小的区域(&补充表1).总计这些数据表明，由单个穿透血管闭塞引起的战略性微梗死将导致认知功能障碍。
美金刚降低了认知缺陷
经NMDA受体拮抗剂治疗后，穿透性血管闭塞继发的微梗死体积显著减少(). 因此，我们测试了这些治疗药物是否能够在减少闭塞继发的认知缺陷方面提供额外的有益作用(). 我们利用间隙交叉任务和ON-目标遮挡()此外，在闭塞30至45分钟后给药美金刚(). 然后在咬合后的四到七天内对这些动物进行评估。这些动物经过美金刚治疗后，基本上能够穿过闭塞前可通航的缝隙(). 去除剩余的触须作为阳性对照，恢复了所示示例中的全部赤字()，以及整个队列中的总体情况（n=7）(&补充表1).
NMDAR拮抗剂美金刚治疗单穿透性血管闭塞后认知功能障碍的减少（a）测试ON靶点中风后使用美金刚治疗的效果的实验。（b）
后hoc免疫组织化学显示，在阻断单个穿透性小静脉并进行治疗后，一个小的微梗死影响了部分C2柱。（c）正常情况下（黑色曲线）、微梗死加美金刚（红色曲线）和C2大弧菌切除（蓝色曲线）下，每个间隙距离的成功交叉概率为0.95置信区间。请注意，该动物只是轻微受损。（d）已治疗的、针对性队列的gap-cross缺陷总结。与正常条件相比，条形图显示为平均值±s.e.m（n=7；***p<0.0001，以及###p=0.0006，与微梗死后相比；将微梗死加美金刚与正常情况进行比较，计算出无显著性的p=0.1。（e）所有ON靶点闭塞病例、美金刚治疗的ON靶点闭塞病例和OFF靶点对照病例的汇总图。请注意，美金刚治疗后，行为缺陷的大小大大减少，这与皮质柱梗死的比例减少一致。（f）对所有组的跨间隙缺陷的总结表明，添加美金刚胺可显著降低ON-靶向闭塞的认知缺陷（OFF-靶向、ON-靶加美金刚和ON-靶分别为n=3,7,10；*p=0.037，**p=0.009）。
受穿透性血管闭塞影响的皮质柱的比例取决于微梗死的位置和几何形状。所有ON-目标数据组包括大致位于列中央的微梗死；服用美金刚的患者往往更小，由此产生的微梗死通常只覆盖靶柱的一小部分(&补充表1). 感知缺陷与梗死柱测量分数的关系图表明，当仅约0.12柱受到影响时，功能中点丧失(). 这让人联想到在单个皮质柱水平保留皮质功能的“质量作用原理”，在该原理中，穿过间隙的对侧平台的感知是保留的柱体体积的单调函数38因此，阻断后使用美金刚可以大幅度减少知觉缺陷()与微梗死的同时缩小相一致(&补充表1).
孤立性微梗死的合并
在人类中，大梗死往往与小梗死共存验尸后脑组织4这些可能是从一小部分最初孤立的微梗死中生长出来的吗？为了测试这种可能性，我们封堵了几组分离良好的小动脉和小静脉，在皮层区域形成了多种微梗死(). 我们观察到，当闭塞间隔平均为1.6 mm或更小时，产生的微梗死可能会合并；这相当于闭塞之间的间隙中有四到五条贯穿血管(). 此外，仅5.4±1.1%（平均±s.d.）的穿透血管在皮质区域内闭塞，导致介入组织完全梗死（n=7）().
多个、单个穿透性血管微梗死合并为扩展性梗死的可能性（a）彼此相距较远的单个穿透性血管闭塞形成孤立的微血管。顶部面板显示了血管系统的宽视野视图，如体内双光子显微镜。闭塞血管的位置用蓝色圆圈标记，圆圈的面积接近预测的微梗死面积，并用字母表示目标血管类型（a=一个穿透小动脉，V=一个贯穿小静脉）。中间面板显示了闭塞后7天的实际微梗死边界，通过α-NeuN染色进行评估。底部面板显示预测的微梗死区域与实际的微梗死面积重叠。（b）邻近的多个穿透性血管闭塞合并成较大的梗死。（c）纵向成像显示介入性穿透血管内逐渐失去血流。在闭塞前采集的平面图像上，非流动血管段（红色）标记为时间的函数。（d和e）MK-801或美金刚胺可阻止微梗死的聚集。（f）各组间目标血管的咬合前红细胞流量无统计学差异。条形图表示为平均值±标准差（对照组n=7、3和6，分别为MK-801和Memantine；p=0.97）。（g）各组之间的最终微梗死体积在统计学上存在差异（与对照组相比，**p=0.0054和*p=0.023）.（h）对照组和药物治疗组的合并概率是与最近闭塞血管距离的函数。数据采用逻辑回归拟合，置信区间为0.95。（i）单支和多支血管闭塞产生的微梗死大小层次，以及NMDAR阻断剂的药理作用总结。
通过对动物的纵向成像研究，揭示了梗塞合并的基础。在两天的时间里，这些凝块扩散到微梗死的初始核心以外，以减少邻近穿透血管的灌注(&补充图6). 凝集涉及内皮细胞壁的严重缺血性损伤，并最终在皮下微血管中形成血栓(补充图S7). 因此，皮质似乎极易受到穿透血管稀疏闭塞的影响。
NMDA受体拮抗剂可以减少孤立性微梗死的体积()提示同样的治疗策略可以减轻微梗死的合并。为了测试这一点，我们形成了几组分离良好的单血管闭塞，如上所述(). 阻断前给药的MK-801或阻断后给药的美金刚（Memantine）按照孤立梗死的描述进行腹腔注射。我们观察到这两种拮抗剂都显著减少了梗死组织的总体积(). 当闭塞物彼此相距0.7 mm以内时，微梗死的合并与隔离现在变得普遍()相比之下，在没有拮抗剂的情况下，1.6毫米的距离要大得多(). 因此，通过药物干预，融合的最小面积密度增加了五倍。MK-801治疗大鼠皮层表面的纵向成像显示，靶血管附近的表面血管正常流动(补充图8). 此外，最初被光血栓闭塞的一部分血管在一天后被发现重新插管，但为时已晚，无法防止微血管核心的不可逆损伤。总计这些数据表明，治疗性给药不仅对单个微梗死的大小有深远影响，而且对多个微梗死的合并也有深远影响().
讨论
人类皮质微梗死的病因和认知后果尚不清楚。为了深入了解这个问题，我们建立了微梗死病理模型()通过选择性阻断单个皮质穿透小动脉和小静脉，为啮齿动物皮质中高度局限的组织区域提供血液(&). 我们发现，微梗死并不是无害的，因为人们通常认为其体积较小。相反，只有一条贯穿血管的闭塞会导致行为任务中的认知功能障碍(). 这意味着每一个皮质穿透血管对正常的认知功能都至关重要。此外，我们还发现多发性微梗死的累积会导致组织损伤的增加()这是一种可能由小血管疾病引起的皮质损伤的新机制。至关重要的是，单一和合并微梗死所造成的损害可以通过阻断后应用美金刚胺来改善，美金刚是美国联邦药物管理局批准的阿尔茨海默病和血管性痴呆的治疗方法39,40(&). 随着组织损伤的减少，我们观察到认知功能有了很大的改善().
单次穿透性小静脉闭塞可导致微梗死的发现出乎意料(&)与穿透性小动脉相比，其含量接近三比一12与小动脉一样，穿透性小静脉之间的侧支循环有限12每个小静脉都是多个相邻穿透性小动脉的引流汇41，暗示灌注“域”。在人类皮层中，穿透小动脉的数量超过小静脉，这一比例被逆转，表明小静脉的灌注区域更大，可能容易发生缺血42与动脉闭塞相反，静脉血栓形成可能涉及缺血以外的其他机制，如颅内压升高和红细胞渗出43静脉病理学在痴呆中的作用尚不清楚，作为血管识别的标志物验尸后神经病理学并不常用。静脉胶原蛋白病导致管腔变窄，是深部白质脑血流不良的一个推测来源，在血管性痴呆中也有描述44未来区分皮质内动脉和静脉病理学的努力将很有价值，因为静脉胶原蛋白病很容易被误认为是更常见的透明化动脉粥样硬化。
我们改进了gap-cross任务，使之包括使用单个大触须来感知目标平台()作为确定单个微梗死对皮层功能影响的手段。我们发现，单个穿透小动脉的闭塞足以破坏触须柱，并消除皮层输入的处理。这是一个关键的发现，因为这种小梗死的行为学意义之前还不清楚。这与小范围中风后躯体感觉图的丢失是一致的45的确，大脑具有显著的可塑性，随着时间的推移，在这项任务中皮层功能的局部丧失很可能会通过重新绘制周围的活组织来恢复46,47然而，一个潜在的临床重要性问题是多发性微梗死的逐渐累积是否成为长期认知功能障碍的来源。单个皮层血管闭塞后，不同皮层区域之间神经元电活动的流动发生了深刻变化，这支持了这种可能性48.
穿透性小动脉或小静脉闭塞后缺乏血流，附近组织死亡()意味着邻近的穿透动脉之间侧支循环不良11和穿透性小静脉12尽管如此，一个意想不到的发现是单个微小囊肿合并为大囊肿(). 这种类似自催化的过程可以通过封堵一个区域内仅占总穿透血管5.4%的血管，并有专利介入血管来诱导。血脑屏障的破坏不太可能对合并效应起到很大作用，因为微出血49和血清外渗45引起的神经元损伤小得令人惊讶。相反，可能涉及微血管内的延迟血栓形成，因为在最初闭塞大约12至24小时后，邻近的穿透血管会重新聚集到缺血区()
作为加速脑损伤的一种机制，人类可能发生的微梗死合并仍有待解决。特别是，我们研究了亚急性期的微梗死，在损伤边界内星形胶质细胞增生和巨噬细胞浸润明显，组织空化不完全。在后期，预计微梗死将成为充满液体的囊肿，在慢性期最终塌陷成为线性疤痕或“皱褶”3虽然这项工作中使用的光学诱导梗死始于皮层表面，但人类会发生完全包含在灰质中的微梗死2使用放大的超短激光脉冲阻断穿透血管深部的血流，啮齿类动物可能会形成这种皮下微梗死50高场磁共振成像可以揭示微梗死的生长及其与认知功能下降的相关性。此外，根据这些变化的后遗症，可以使用不同的MRI序列来估计微梗死的年龄2.
人类穿透性血管的血管构筑和灌注区域与啮齿动物的血管结构和灌注区域极为相似，由此推测穿透性血管是导致人类微梗死的血管病变部位9这突出了对准确再现血管性痴呆的微血管功能障碍、组织病理学和行为后果的动物模型的需求。这些模型将作为药物干预的试验台，例如预防性缓释抗兴奋毒性策略，以及微梗死无创成像对比剂的开发和基于微梗死生长的新药治疗的纵向评估。最后，重新评估过去治疗缺血性中风（一种突发疾病）的神经保护疗法，作为缓解痴呆（一种缓慢进展的疾病）的手段，可能是合适的。
方法（在线）
动物制剂
本研究使用了220只雄性大鼠（Charles River），体重从250克到400克不等，以自然光-暗循环的方式饲养在标准笼子中。80只Sprague-Dawley大鼠参与了生理和解剖测量，140只Long-Evans大鼠用于行为实验，其中20只完成了训练，以获得有用的数据。加州大学圣地亚哥分校动物护理和使用委员会已经批准对我们的大鼠进行护理和实验操作。
除非另有说明，否则所有试剂均从西格玛公司获得。手术在异氟醚（Baxter Healthcare）麻醉下进行，30%氧气和70%氧化亚氮中4%的平均肺泡浓度（MAC）用于诱导，1%至2%MAC用于维持。使用反馈调节热垫（50-7053-F；哈佛大学）将体温维持在37°C。使用脉搏血氧仪（8600V；Nonin）连续监测心率和血氧饱和度。每2小时腹腔注射5%（w/v）葡萄糖和1mL生理盐水，以进行补液。术后镇痛采用丁丙诺啡（0.02 mg/kg）腹腔注射。
用于急性研究(&)，对股动脉进行插管，以连续测量血压（BP1，World Precision Instruments）并抽血进行血气分析（RapidLab 248；Bayer），对股静脉进行类似的插管以输送试剂，即、荧光素提取物、孟加拉玫瑰和麻醉剂。在成像之前，停止使用异氟醚，通过静脉团注50 mg/kg生理盐水将麻醉转换为α-氯醛糖，然后使用注射泵维持40 mg/kg/h的稳定流量。用于生存研究(,,,&)，在手术和成像期间，只给动物注射异氟醚。在这些病例中，股动脉和股静脉被插管到更远端，以最大限度地减少腿部血流的中断。由于股动脉导管可能影响运动(&)，仅在股骨远端静脉插管以输送试剂。
如前所述，硬脑膜切除后的颅骨窗在体感皮层上形成20后肢/前肢感觉皮层成像时，颅骨窗位于±3mm内侧外侧和-0.5mm前后位，vS1位于+5.5mm内侧和-3mm前后位。
药物制备和给药
NMDAR拮抗剂MK-801（Tocris）和Memantine（Tocri）溶解在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在室温下保存。在血管闭塞开始前30分钟给予浓度为1 mg/kg的MK-801，在闭塞开始后30分钟给予剂量为20 mg/kg的美金刚。两种药物均经腹腔注射。给药后，将动物放在温度为32°C的笼子中4小时，以避免可能的体温过低。给药并未显著改变测量的生理变量(补充表2).
体感皮层映射
通过血液除氧的内在光学成像绘制感觉皮层51开颅术和硬膜切除术后，暴露的皮层暂时用琼脂糖和盖玻片覆盖20为了识别肢体表征，用0.5至1 mA、10 ms脉冲宽度、3 Hz、3 s脉冲序列对肢体进行电刺激。为了识别桶状柱，在轻度异氟醚麻醉下用压电驱动器对单个触须进行机械刺激。用显微镜采集3×3mm区域的图像52配备12位CMOS摄像头（编号1M60，Dalsa）；数据以每秒2帧的速度分为256×256像素帧进行分析。皮质表面血管系统的初始图像利用475 nm中心波长发光二极管（LED）的照明，形成了将功能变化与窗口内特定位置联系起来的参考。然后用630 nm中心波长LED照射皮层表面，获得功能图像。
体内双光子显微镜
血管结构、血流和细胞内[Ca的测量2+]使用定制双光子激光扫描显微镜的瞬态53具有任意扫描模式54,55进一步支撑附加梁的线性21和非线性22聚焦激光对单个小血管的血栓形成56。扫描和数据采集的控制通过MPScope 2.0软件系统实现57.通过静脉注射0.3 mL 2 MDa荧光素-dextran（FD2000S；Sigma）标记血清，该荧光素-dextran在生理盐水中的浓度为5%（w/v）。血流测量和分析程序已在前面描述过20.
钙显像
膜渗透剂[Ca2+]如前所述，将指示剂俄勒冈州绿Bapta-AM（OGB1-AM；Invitrogen）注入皮层23.星形胶质细胞被选择性地用磺基罗丹明101（SR101）标记58.使用0.8-NA、40倍放大倍数的浸水物镜进行成像。激发波长为800nm，OGB1荧光的收集带为350~570nm，SR101荧光的收集区为570~680nm。图像大小为400 x 256像素，时间序列由以10 Hz采集的300帧组成。对后肢或前肢施加一个0.5至1 mA、10 ms的脉冲，以在每个序列的第100帧诱导神经元放电。数据集在闭塞前和闭塞后的不同时间收集一次。每个数据集由地表以下200至400μm的五个不同深度（间隔50μm）组成，每个深度收集五个系列。在整个Ca期间，平均动脉血压、血气和血液pH值保持在正常生理水平2+影像学和急性血流实验。
个别血管的靶向闭塞
循环光敏剂孟加拉玫瑰（Rose Bengal）用绿色激光（晶体激光）局部激活皮质表面的穿透性血管21使用放大的800 nm脉冲激光（Libra，Coherent）封堵深部微血管22两种遮挡技术的技术和实验细节已在前面描述过56.
免疫组织学
用4%（w/v）多聚甲醛灌注固定动物。将大脑在4°C下后固定过夜，然后用30%（w/v）蔗糖平衡。在大多数情况下，在固定后，整个同侧皮层被移除，并夹在两块相隔2.5 mm的玻璃片之间。然后用滑动切片机切取厚度为50μm的大脑切片，使其与皮质表面相切。初级抗体(补充表3)在含有10%（v/v）山羊血清（Vector Labs）、2%（v/v）Triton X-100和0.2%（w/v）叠氮化钠的缓冲液中稀释。然后在室温下缓慢旋转，在抗体溶液中孵育游离切片过夜，在轨道摇床上用50mL PBS洗涤30分钟，与二级抗体孵育(补充表3)2小时后，再次清洗，装在载玻片上晾干过夜。然后用Fluoromount-G（Southern Biotechnology Associates Inc.）和1号玻璃盖玻片（Corning）密封所有载玻片。
用于盐酸吡莫硝唑（低氧探头™; 缺氧组织的Hypoxyprobe.com）免疫染色19，在灌注固定前1小时，通过股动脉导管注射吡莫硝唑，浓度为60 mg/kg，体积为100μL生理盐水。为了标记坏死组织，在灌注固定前2小时腹腔内注射碘化丙啶，浓度为1 mg/kg，体积为1 mL盐水27.
大弧菌依赖性行为测试
缝隙交叉装置由两个聚氯乙烯平台组成，其形状为等腰梯形，后宽20厘米，前宽10厘米，长25厘米，短边相对，高出桌子50厘米。三个非对边用透明塑料封闭，并用塑料屋顶覆盖，以防止老鼠探索平台的其他边缘。在两个平台的远端钻取小井，作为奖励端口。每个井的流量由一个螺线管控制，螺线管每喷一次，从加压水瓶中释放120μL加0.02%（w/v）糖精增甜的水。步进电机控制器（编号UCC3055；Norberg）安装在每个平台的底座上，以允许机械改变间隙距离。
大鼠质心追踪
平台位于平坦的黑屏前30厘米处，由两个LED（M850 nm；ThorLabs）发出的漫反射光照亮。带有平台侧视图的红外CCD摄像机（非C3077-79；滨松）以每秒60帧的速度采集数据。当老鼠在水奖励平台之间来回穿梭时，通过计算图像强度的质心来评估其位置。当大鼠的质心穿过缝隙并移动到目标平台边缘2.5 cm以外时，记录了一次交叉事件。然后重新定位大鼠穿过的平台，以确定新的间隙距离；当老鼠在平台上时，平台从未重新定位。偶尔，老鼠会在舞台完全重新定位之前回到最初的平台。这些交叉口在后处理期间被标记和省略。所有计算和控制均使用MATLAB™-基于处理摄像机输出、控制平台电机和触发螺线管的程序59.
大振动追踪
当动物栖息在缝隙中触碰目标平台时，从头顶上拍摄到了大触须。我们使用了一台高速摄像机（Basler A602f），该摄像机配备了一个f=50毫米的镜头（奥林巴斯f/1.2 Auto-S），位于平台上方80厘米处。摄像机固定在一个单独的步进电机上，该电机与右侧平台的边缘同步移动。每秒采集250次帧。另外两个LED（M850 nm；ThorLabs）从下方为间隙区域提供漫射照明。LED灯照亮了一个直径15厘米、长10厘米的圆柱形管的扁平白色内部，在右侧平台边缘下方设置了一个孔。
培训程序
大鼠在首次跑步前24小时被剥夺饮水。作为第一步，他们被训练在昏暗的可见光下在平台之间奔跑，并用一座桥来填补空隙。每一次成功的交叉都会触发目标平台上的螺线管以释放水奖励。第一天在仪器上交叉50次或50次以上的老鼠被留作进一步训练的候选者，其余的则被淘汰。
然后训练成功的动物在由3到6厘米的小间隙隔开的平台之间奔跑。一旦它们舒适地穿越，计算机控制设置为在每次成功穿越后以0.1厘米的间隔增加间隙宽度。一旦他们达到了120秒内无法跨越的距离，空间就会缩小几厘米，这个过程就会重复。使用这种“楼梯”方法，训练大鼠穿过越来越大的缝隙。
一旦大鼠熟练掌握了阶梯法，它们就会在同样的模式下，在大鼠看不见的红外光下奔跑。最初，他们被发现只有在用前爪可以够到另一个平台的情况下才能跨越一个缝隙。随着时间的推移，他们获得了跨越更远距离的信心，他们将上躯干伸展到缺口上方，用鼻子接触目标平台。最后，他们学会了使用大触须来感觉目标平台的边缘，当它越过他们的鼻子时，通常是在14到18厘米的间隙距离，这取决于老鼠的大小。关键的是，培训包括随机放置的“空白”试验35间隙距离增加到一个大于大鼠用大触须探测的值。如果老鼠在这些试验中试图跳过缝隙，它就会掉到桌子上的垫子上。这一不利的经验保证了它在未来的试验中如果不积极探索目标平台，就不会跳转。在一次空白试验中摔倒对所有受过训练的大鼠来说都是必要的，因为它加强了在穿越前触诊的必要性。总计大约30%的初始大鼠达到了这种训练水平。
将大型触须的数量减少到一个
我们发现，在最初的训练之前，只修剪成一根大触须的动物未能学会使用大触须完成任务。因此，我们让动物用一整套大触须学习这项任务，然后按顺序修剪。第一次修剪去除了最终微梗死区同侧的所有大触须，第二次修剪去除对侧A、E行的大触须、第三次修剪去除B、D行的大弧须，第四次修剪去除除C1、C2外的所有剩余大触须。在最后的修剪中，我们使用高速大触须追踪数据来确定动物在间隙交叉时更依赖于最后两个中的哪一个，并修剪另一个。每次修剪后，运行大鼠，直到其性能恢复到修剪前的值；这通常需要额外一到三天的培训。总计大约15%的初始大鼠达到了这种训练水平。
心理测试计划
训练后，通过对动物能力的概率评估，对这些动物进行跨缝测试。对照软件为每次试验随机选择五个预设间隙宽度中的一个，这确保了动物无法预测下一个间隙宽度。最高宽度被设置为动物无法与大触须交叉的宽度，因为它够不到1厘米，其他四个宽度依次低1厘米。实验发现每只动物的最佳间距范围。每次跑步包括80到120次试验，每间隔距离至少挑战动物15次。每个间隙距离的成功交叉数返回了每个宽度的交叉概率(). 操纵引起的赤字被计算为0.5度交叉处曲线之间的差值。
闭经后数据收集
给动物喝水随意血管闭塞手术前一晚和手术后一天。闭塞形成两天后开始(补充图5)，这些动物再进行四至七次训练，以确定咬合后的基线。
大弧菌修剪控制
一旦建立了稳定的咬合后基线，将剩下的单个大触须修剪至其底部。然后对这些动物进行奔跑，以建立无大弧菌基线，作为对照。
在研究期间，所有大鼠的体重保持在原始体重的约90%。他们每天运行一次，只从设备中获得水。
数据分析
统计
对于中的复合数据,&我们使用了重复测量ANOVA和Tukey事后的，事后的分析。对于中的复合数据,&我们使用了Kruskal Wallis测试和Dunn测试临时的分析。
Infarct音量
为了量化微梗死体积，我们使用α-NeuN染色组织切片。使用立体镜（MVX10；Olympus）以高分辨率采集微梗死的序列图像。微梗死边界被描绘为正常组织与无核梗死区之间的边界，正常组织有密集的神经元核(补充图4a、b). 微梗死核心区的非特异性α-NeuN染色很可能是由于未消化的组织物质所致，根据形态学很容易与神经元细胞核区分开来。在相邻组织切片中测量组织损伤面积和总梗死体积Vt吨，使用以下公式计算：Vt吨=（A1+一个2+…+An个)h、 其中An个是n中的损坏面积第个切片，h为相邻切片之间的距离。由于深部微血管血栓形成导致极小的损伤，损伤通常仅限于单层(和补充图1e、f). 在这些病例中，用共聚焦显微镜测量碘化丙啶阳性组织的体积，步长为1μm（Olympus FV1000）。
根据α-VGLUT2染色法，桶形柱的体积估计为第4层柱的面积(,&补充图5h)，乘以该水平的大脑皮层厚度，即。，2.2毫米60.分别测量每只动物的柱面积。对于柱完全梗死的动物，通过平均两到三个保持完好的相邻桶柱的面积来估计面积。分数伤害()通过将柱内梗死组织的体积除以柱的总体积来计算。在第4层导出的柱掩模应用于所有截面，以通过皮层深度描绘柱边界。深穿透血管被识别为切向切片上的孔，用作连续切片对齐的基准标记。
钙成像分析
使用监督机器学习算法从平面图像堆栈中提取细胞体钙指示荧光54我们排除了在第二成像通道中SR101阳性染色的细胞和含有荧光素抽提物的血管段。[加利福尼亚州]2+]单个神经元的瞬变信号表示动作电位的放电，在1到2s的时间内表现出有效的瞬时增加，随后呈指数衰减(). 我们通过匹配滤波和理想指数衰减（e）来识别瞬态的开始−（t−tn个)/τθ（t−tn个)，其中θ（t）是Heaviside函数，tn个是假定的事件时间，τ=300 ms。得分为[Ca显著增加2+]在基线信号上，数据和滤波器之间的相关性要求至少高于零2σ，σ定义为从同一数据集中的非刺激期随机收集的1000个跟踪段的总体。
致谢
我们感谢Allan Schweitzer构建了行为机器，感谢Sandra E.Black、Martin Deschánes、Matthew E.Diamond、Ford F.Ebner、Eric E.Smith和Raymond Swanson进行了讨论，感谢Celine Mateo对手稿早期版本的评论。这项工作得到了美国心脏协会（AYS十月后奖学金）和美国国立卫生研究院（MH085499、EB003832和OD006831至DK）的支持，它们进一步支持了用于组织学组织成像的UCSD神经科学共享显微镜核心（NS047101）。
缩写
| NMDAR公司 | N个-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受体 |
| 加拿大皇家银行 | 红细胞 |
| 标准偏差。 | 标准偏差 |
| s.e.m.公司。 | 平均值标准误差 |
| vS1皮层 | 初级触须感觉皮层 |
脚注
作者贡献
A.Y.S.、B.F.、P.D.L和D.K.设计了研究；A.Y.S和G.S.进行了实验；A.Y.S、P.B和P.T.分析了数据；A.Y.S.、B.F.和D.K.写了手稿。工具书类
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