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致癌物。作者手稿；PMC 2014年12月5日提供。
以最终编辑形式发布为：
致癌物。2014年6月5日；33(23): 3004–3013.
2013年7月8日在线发布。 数字对象标识：10.1038/onc.2013.256
预防性维修识别码：项目经理3912228
美国国立卫生研究院：NIHMS550127标准
PMID：23831571

JNK介导的自噬途径在抗癌化疗中触发c-IAP降解和坏死

魏阳河，1,2,# 王琼（音），1,三，# Balasubramanian Srinivasan语，4 詹宁斯·徐，1 梅贝尔·T·帕迪拉，1 紫丽，1 王霞（Xia Wang），三 刘玉石，1 新沟，2 沈汉明，5 成国兴，4,*和永林1,*
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摘要

通过诱导凋亡杀死癌细胞是化疗的主要机制之一。然而，许多癌细胞具有原发性或获得性凋亡抵抗，导致化疗耐药。在本研究中，我们使用一种新的查尔酮衍生物查尔酮-24（Chal-24），通过自噬介导的坏死（RIP1-和RIP3-依赖性坏死），确定了一种新型的抗癌机制。Chal-24通过诱导坏死细胞形态而有效地杀死不同的癌细胞，但未引起可检测到的caspase激活。用坏死抑制素-1或通过敲低RIP1和RIP3阻断坏死途径有效阻断了Chal-24的细胞毒性，表明Chal-24诱导的细胞死亡与坏死有关。Chal-24强烈激活JNK和ERK，并阻断其有效抑制Chal-24诱导的细胞毒性。此外，Chal-24强烈诱导自噬，自噬依赖于JNK介导的Bcl-2和Bcl-xL磷酸化以及Bcl-2或Bcl-xL与Beclin1的分离。重要的是，通过药物抑制剂或靶向重要自噬成分ATG7和Beclin1的siRNAs抑制自噬，可以有效减弱Chal-24诱导的细胞死亡。此外，我们发现自噬激活导致c-IAP1和c-IAP2降解，并形成Ripoptosome，导致细胞坏死。因此，这些结果建立了一种杀死癌细胞的新机制，该机制涉及自噬介导的坏死性凋亡，可用于克服化疗耐药性。

关键词：自噬、坏死性下垂、RIP1、RIP3、c-IAP、凋亡

介绍

化疗被用作治疗癌症患者的主要或辅助疗法。虽然化疗药物的抗癌活性涉及不同的细胞作用，如诱导细胞凋亡和抑制血管生成，但直接杀死癌细胞的主要机制是诱导细胞毒性1然而，由于避免程序性细胞死亡是癌症的标志之一，因此，无论是原发性还是后天性的化疗耐药性都是导致治疗失败的主要障碍2，三据信，化疗主要通过激活凋亡来杀死癌细胞，而凋亡抵抗实质上促成了化疗耐药性4然而，尽管抗癌研究致力于阐明机制和克服凋亡抵抗的广泛努力5，6，化疗的改善有限，这表明其他细胞死亡途径也可能被激活以诱导癌细胞的细胞毒性7，8.

最近的研究表明，坏死、RIP1和RIP3依赖性坏死9，可通过化疗在某些细胞类型中激活10–12研究发现，在某些情况下，当细胞凋亡途径被阻断时，细胞凋亡被激活。然而，即使凋亡途径是有效的，坏死也可能是主要的8，13因此，坏死可以作为化疗杀死癌细胞的备用或替代细胞死亡模式14许多刺激物诱导坏死性下垂，其中TNFα诱导的坏死性下坠被广泛研究。TNFα激活TNFR1信号，形成由RIP1、FADD和caspase-8组成的复合物II15如果caspase-8被激活，RIP1将被裂解，以确保下游caspase的激活和凋亡8，15，16在caspase-8激活或RIP1去平衡被抑制的条件下，RIP1招募RIP3形成一个称为坏死体的复合物，其中RIP3通过RIP1磷酸化被激活。活化的RIP3被释放并与假激酶MLKL结合，然后迁移到线粒体激活磷酸酶PAGM5，导致ROS生成和坏死细胞死亡17–19因此，通过SMAC模拟物抑制RIP1的E3泛素连接酶c-IAP1，或激活RIP1去泛素化酶CYLD，以及用z-VAD抑制胱天蛋白酶-8，触发TNFα暴露的细胞坏死20，21有趣的是，某些抗癌药物（如足叶乙甙）能够抑制c-IAP1的表达，从而诱导由RIP1、FADD、RIP3和caspase-8组成的复合物Rippotosome的形成，从而导致坏死下垂11因此，激活坏死下垂可用于抗癌治疗8.

自噬是一种降解和再循环长寿蛋白质和细胞器的分解代谢过程，可导致细胞存活或死亡22，23自噬是由一个称为自噬体的双层膜囊泡的形成启动的，自噬小泡与溶酶体融合形成自溶体，其中隔离的细胞成分被溶酶体酶消化22，23自噬过程在不同阶段受到自噬因子如ATG7、ATG5和Beclin-1的严格调控22，23抗凋亡Bcl-2家族蛋白，如Bcl-2和Bcl-xL结合Beclin-1抑制自噬，这些Bcl-2家庭蛋白从Beclin-1中分离促进自噬24自噬在细胞死亡控制中起着矛盾的作用，自噬对癌细胞对化疗反应的影响也很复杂：促死亡或抗死亡25–27虽然自噬细胞死亡的术语仍有争议28自噬可以促进细胞凋亡。治疗诱导的自噬是否调节坏死性下垂尚不清楚。

在这项研究中，我们报道了一种新的抗癌途径，该途径涉及由新型查尔酮衍生物查尔酮-24（Chal-24）触发的自噬介导的坏死(图S1). Chal-24（在参考文献中命名为11a29)被证明能有效抑制异种移植瘤的生长，而不会对动物产生毒性29因此可能是一种潜在的抗癌药物。我们发现Chal-24激活自噬，该自噬依赖于JNK介导的Bcl-2和Bcl-xL磷酸化，从而触发c-IAP1和c-IAP2降解和Riptosome形成，从而诱导癌细胞坏死。这种新型的癌细胞杀伤机制可以用来克服化疗耐药性。

结果

Chal-24诱导癌细胞非凋亡性死亡

Chal-24在裸鼠异种移植瘤模型中具有潜在的抗癌活性29为了研究Chal-24获得抗癌活性的机制，我们通过LDH释放试验证实了Chal-24对来自不同人类肿瘤的癌细胞具有细胞毒性。结果表明，Chal-24可诱导肺癌（A549和H1299）和膀胱癌（UM-UC-3）细胞株的细胞死亡(图1A和数据未显示）。与体内结果一致的是，Chal-24对小鼠几乎没有毒性，永生化人支气管细胞对Chal-24诱导的细胞毒性具有显著抵抗力(图S2). 虽然细胞凋亡是化疗诱导细胞毒性的主要机制之一，但我们进行了一系列评估细胞凋亡的实验。出乎意料的是，所有实验的结果都不支持凋亡是Chal-24诱导的主要细胞毒性途径。这些包括：未检测到caspase-8或caspase-3的激活，以及PARP1的裂解(图1B); 泛酶抑制剂z-VAD抑制凋亡对Chal-24诱导的细胞死亡的抑制作用最小，而几乎完全抑制TRAIL诱导的细胞毒性(图1C); 死亡细胞呈现坏死形态特征（细胞膜破裂和相对正常的核形态）(图1D). 这些结果强烈表明，Chal-24主要通过诱导非凋亡细胞死亡来杀死癌细胞。

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Chal-24诱导非凋亡细胞死亡

（A）用指示浓度的Chal-24处理细胞30 h。通过LDH释放试验测量细胞死亡。所示数据为平均值±SD。（B）在指定的时间点用Chal-24处理细胞（A549为8μM，UM-UC-3为4μM）。Western blot检测所示蛋白。GAPDH被检测为输入控制。用TRAIL（A549为200 ng/mL，UM-UC-3为60 ng/mL）处理8 h的细胞作为凋亡细胞死亡的对照。（C）用z-VAD（5μM）预处理A549 30 min，然后用Chal-24（8μM）或TRAIL（200 ng/mL）再处理30 h。通过LDH释放试验测量细胞死亡。所示数据为平均值±标准差。（D）A549用Chal-24（8μM）或TRAIL（200 ng/mL）处理24小时，并用吖啶橙和溴化乙锭染色。白色箭头表示坏死细胞。红色箭头表示凋亡细胞。

JNK和ERK的激活是Chal-24诱导的细胞死亡所必需的

为了探讨Chal-24诱导癌细胞死亡的机制，我们检测了参与细胞生存和死亡调节的MAP激酶的激活。Chal-24有效激活JNK、ERK和p38，早在30分钟就检测到(图2A). 采用药物抑制剂研究每个MAPK在Chal-24诱导的细胞死亡中的作用。而每种抑制剂都能有效抑制其各自的激酶(图2B)，抑制JNK和ERK，但不抑制p38有效抑制Chal-24诱导的细胞死亡(图2C). 这些结果表明，Chal-24诱导的细胞毒性涉及JNK和ERK。

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Chal-24诱导的细胞死亡需要JNK和ERK激活

（A）用Chal-24（8μM）处理A549细胞指定时间。Western blot检测所示蛋白。GAPDH被检测为输入对照。（B）用指示的抑制剂预处理A549 30 min，然后用Chal-24（8μM）处理30 min。用Western blot检测指示蛋白。GAPDH被检测为输入控制。（C）用指示的抑制剂SP600125（10μM）、U0126（10μM）、SB203580（5μM）预处理A549细胞30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理30 h。通过LDH释放试验检测细胞毒性。所示数据为平均值±标准偏差。*p<0.01。

Chal-24诱导癌细胞自噬

由于MAPK（如JNK）参与自噬诱导，并且自噬调节细胞死亡，因此我们研究了Chal-24诱导的细胞毒性是否与自噬有关。Chal-24处理后，在A549和UM-UC3细胞中很容易检测到LC3-I转化为LC3-II，这是自噬的标志(图3A和3B). p62在自噬过程中在自噬体中降解，在Chal-24处理的细胞中逐渐降低(图3A和3B). 为了证实LC3和p62的变化是由自噬诱导引起的，对LC3和p62进行了周转试验以检测自噬通量。溶酶体抑制剂氯喹（CQ）用于抑制溶酶体蛋白降解，以确定Chal-24诱导的LC3-II增加是由于LC3-II产生增强还是由于LC3-II清除减少。在这两种细胞系中，虽然Chal-24或氯喹单独诱导LC3-II适度增加，但与Chal-24和CQ共同处理进一步提高了LC3-II水平(图3C和3D). 一致地，CQ有效地减弱了Chal-24诱导的p62降低(图3C和3D). 这些数据有力地证实了Chal-24在癌细胞中诱导自噬。此外，通过转染GFP-LC3质粒，我们检测了Chal-24是否在A549细胞中诱导LC3点形成，这是自噬的另一个特征。结果表明，Chal-24显著增加了细胞内LC3点和LC3点数量增加的细胞数量(图3E和3F). 总之，这些实验提供了强有力的证据，表明Chal-24可以诱导人类癌细胞的自噬。

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Chal-24诱导癌细胞自噬

（A–B）用Chal-24处理细胞（A549为8μM，UM-UC-3为4μM）指定时间。Western blot检测所示蛋白。β-actin被检测为输入对照。（C–D）用氯喹（CQ，20μM）预处理细胞30 min，然后用Chal-24（8μM用于A549，4μM用于UM-UC-3）再处理2 h（对于LC3）或8 h（对于p62）。Western blot检测所示蛋白。GAPDH被检测为输入对照。(E类)稳定转染GFP-LC3的A549用Chal-24（8μM）处理2h或保持未处理状态。照片是在荧光显微镜下拍摄的。(F类)用GFP点（左）和每个阳性细胞的点数量化细胞数。所示数据为平均值±标准偏差。*p<0.01。

Chal-24诱导的细胞死亡需要自噬

接下来，我们用不同的自噬抑制剂研究了自噬在Chal-24诱导的细胞毒性中的作用：沃特曼宁（WTM）、3-甲基腺嘌呤（3MA）和CQ。这些抑制剂在自噬途径的不同步骤阻断自噬。虽然仅检测到抑制剂引起的细胞毒性很小，但观察到显著抑制Chal-24诱导的细胞死亡(图4A). 这些抑制剂被证实可以阻止Chal-24诱导的自噬，这表现为Chal-24导致的LC3-II积累减少，WTM和3MA降解p62(图4B). 正如预期的那样，CQ对溶酶体降解的抑制增加了LC3-II和p62的表达(图4B). 这些观察结果得到了ATG7或Beclin1表达下调的进一步支持，Western blot证实了这一点，有效抑制了Chal-24诱导的细胞毒性(图4C、4D). 克隆生长试验检测到，WTM、CQ和3MA或抗ATG7或Beclin1的siRNAs对自噬的抑制可保护细胞免受Chal-24诱导的死亡，并确保长期细胞存活(图4E，第3章)排除了Chal-24延迟细胞死亡或以其他方式改变LDH释放动力学的可能性。综上所述，这些结果表明，Chal-24诱导的癌细胞死亡需要自噬。

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Chal-24依赖自噬诱导细胞死亡

（A）用3MA（10 mM）、CQ（20μM）或Wortmannin（WTM，1μM）预处理A549细胞30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理30 h。通过LDH释放试验检测细胞毒性。所示数据为平均值±标准差。*p<0.01。（B）用不同的抑制剂（CQ，20μM；WTM，1μM；3MA，10 mM）预处理A549细胞30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理2 h。用Western blot检测指示蛋白。β-actin被检测为输入对照。（C、D）用指示的siRNAs（10nM）转染细胞30 h，然后用Chal-24（8μM）再处理30 h。通过LDH释放试验检测细胞毒性。所示数据为平均值±标准偏差。*p<0.01。插入物，通过Western blot确认每个蛋白的敲除。β-actin被检测为输入对照。（E） ●●●●。用指示的siRNAs（10 nM）转染A549细胞30 h，然后用Chal-24（3μM）处理3天，然后在每3天刷新一次的新鲜培养基中培养。培养8天后，用甲醇固定细胞并用亚甲基蓝染色。显示了整口井的代表性图像。

JNK通过Bcl-2和Bcl-xL的磷酸化以及Bcl-2/Beclin-1和BclxL/Beclin-1复合物的减少介导自噬

然后，我们使用针对JNK、ERK和p38的特异性抑制剂研究了参与Chal-24诱导的自噬的信号通路。与WTM类似，JNK抑制剂显著降低了Chal-24诱导的LC3-II水平，而ERK和p38抑制剂几乎没有影响(图5A). JNK抑制剂还抑制了Chal-24诱导的自噬通量(图5B). 此外，JNK抑制有效地抑制了Chal-24诱导的GFP-LC3点形成（数据未显示）。据报道，JNK磷酸化了前存活的Bcl-2家族蛋白，导致这些蛋白与Beclin-1的复合物被破坏，以促进饥饿期间的自噬30因此，我们检测了Chal-24是否诱导了JNK介导的前生存Bcl-2家族蛋白的磷酸化。事实上，我们检测到Bcl-2和Bcl-xL的迁移率发生了明显的变化，早在接触Chal-24后2小时就开始了，随着时间的推移逐渐增加(图5C、5D). Bcl-2和Bcl-xL的转移很可能是由于磷酸化，因为它通过lambda蛋白磷酸酶处理完全消除了(图5E). JNK抑制剂抑制了Bcl-2和Bcl-xL的带移，表明JNK参与了Bcl-2和Bcl-xL的磷酸化(图5E). 此外，通过联合免疫沉淀法检测了Chal-24诱导的JNK活化对Bcl-2/Beclin-1或Bcl-xl/Beclin-1复合物的影响。结果表明，Beclin-1在未经处理的细胞中与Bcl-xL和Bcl-2组成性结合。然而，Chal-24治疗导致Bcl-2/Beclin-1或Bcl-xL/Beclin-1复合物减少(图5F). 有趣的是，当JNK被阻断时，Bcl-2/Beclin-1或Beclin-1/Bcl-xL相互作用的减少减弱，这与抑制Bcl-xL和Bcl-2的磷酸化有关(图5F). 这些结果表明，Chal-24诱导的JNK通过磷酸化Bcl-xL和Bcl-2激活自噬，从而破坏Bcl-2/Beclin-1或Bcl-xL/Beclin-1复合物。

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Chal-24诱导的自噬涉及JNK介导的Bcl-2和Bcl-xL磷酸化

（A、B）用指示的抑制剂SP600125（10μM）、U0126（10μM）、SB203580（5μM），WTM（1μM）或CQ（20μM）预处理A549 30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理2 h。用Western blot检测指示的蛋白。β-actin或GAPDH被检测为输入对照。（C、D）用Chal-24处理细胞（A549为8μM，UM-UC-3为4μM）指定时间。Western blot检测所示蛋白。β-actin或GAPDH被检测为输入对照。（E）A549细胞用SP600125（10μM）预处理30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理2 h。对于Lambda蛋白磷酸酶（Lambda PP）处理，细胞提取物与Lambda聚丙烯（400 u/μl）在30℃孵育1 h。Western blot检测所示蛋白。β-肌动蛋白或GAPDH作为输入对照。（F）A549用SP600125（10μM）预处理30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理2 h。在与Beclin-1抗体共免疫沉淀后，用Western blot检测指示蛋白。

Chal-24通过自噬和ERK诱导IAP降解

因为IAP家族蛋白是参与非凋亡细胞死亡的重要细胞生存因子12，我们进一步研究了Chal-24对IAP表达的影响。Chal-24治疗导致A549和UM-UC-3细胞中c-IAP1和c-IAP2的表达水平降低，这是在Chal-24暴露后16小时检测到的(图6A，图S4). 相反，Chal-24诱导XIAP表达几乎没有变化(图6A，图S4). 因为ERK和JNK参与CHal-24诱导的细胞毒性(图2C)，我们研究了这些MAPK在Chal-24诱导的c-IAP1和c-IAP2抑制中的作用。由于JNK抑制剂的结果不一致，可能是由于其非特异性作用，我们决定使用RNA干扰来阻断JNK或ERK。通过靶向ERK1和ERK2阻断ERK，或者通过靶向JNK1和JNK2阻断JNK，有效地减弱了c-IAP1和c-IAP2的减少(图6B)，表明这些途径参与了Chal-24诱导的c-IAP蛋白的抑制。有趣的是，自噬抑制剂3MA、WTM和CQ也抑制了c-IAP1和c-IAP2的减少(图6C). 为了进一步确定自噬在Chal-24诱导的c-IAP1和c-IAP2减少中的作用，我们进行了ATG7和Beclin-1的敲除，这抑制了Chal-24导致的c-IAP2-和c-IAP1-减少(图6D). Western blot证实ATG7和Beclin-1的敲除(图4C、4D). 这些结果表明，自噬参与了Chal-24诱导的c-IAP1和c-IAP2抑制。因为ERK不太可能参与自噬激活(图5A)，我们研究了ERK在c-IAP降解中的作用。Chal-24未诱导c-IAP1的泛素化或琥珀酰化(图S5). 然而，使用对c-IAP1分子范围分辨率更高的8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，在4到12小时内检测到c-IAP1的清晰带移，该带移被ERK抑制剂U0126显著抑制，并被lambda-phosphatase完全清除，这表明Chal-24导致了c-IAP2的ERK依赖性磷酸化(图6E). 这些结果表明ERK介导了c-IAP1磷酸化的信号通路，这可能触发c-IAP的自溶体降解。虽然需要更多的努力来明确阐明定义的机制，但我们的数据表明JNK介导的自噬和ERK协同介导Chal-24诱导的c-IAP抑制。

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Chal-24依赖自噬和ERK诱导c-IAP降解

（A）用Chal-24（8μM）处理A549细胞指定时间。通过蛋白质印迹检测所指示的蛋白质。β-actin或GAPDH被检测为输入对照。（B）将ERK1和ERK2 siRNA或JNK1和JNK2 siRNAs（各10 nM）联合转染A549细胞24 h，然后用Chal-24（8μM）再处理30 h。通过Western blot检测所示蛋白。GAPDH被检测为输入控制。（C）用3MA（10 mM）、CQ（20μM）或沃特曼（WTM，1μM）预处理A549细胞30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理30 h。用Western blot检测所示蛋白。GAPDH被检测为输入控制。（D）用指示的siRNAs（10nM）转染A549 24小时，然后用Chal-24（8μM）再处理30小时。检测GAPDH作为输入对照。（E）用U0126（10μM）预处理A549细胞30分钟，然后用Chal-24（8μM）处理指定时间。Lambda磷酸酶处理如5E所述。Western blot检测所示蛋白。GAPDH被检测为输入控制。（F）A549用Chal-24（8μM）处理指定时间。在与RIP1抗体共同免疫沉淀后，通过蛋白质印迹检测所指示的蛋白质（G）用CQ（20μM）预处理A549 30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理30 h。在与RIP-1抗体共免疫沉淀后，用Western blot检测指示蛋白。检测GADPH作为联合免疫沉淀特异性的对照。

Chal-24依赖自噬诱导Ripoptosome形成

据报道，IAP的丢失会触发Rippotosome的形成，从而导致细胞凋亡或坏死10，11然后，我们通过与抗RIP1抗体共同免疫预处理来研究Chal-24是否诱导Ripoptosome的形成。事实上，Chal-24在24小时治疗后诱导了内下垂体的形成(图6F). 为了研究自噬在Ripoptosome形成中的作用，在Chal-24治疗期间应用CQ阻断自噬。结果表明，抑制自噬可有效抑制FADD和caspase-8与RIP1的关联(图6G)，证实了Chal-24诱导的Ripoptosome形成需要诱导自噬。

Chal-24在不同细胞系中诱导坏死

虽然Chal-24诱导的细胞毒性主要是非凋亡性的，Rippotosome介导坏死，但我们随后检查了Chal-24是否通过坏死作用杀死癌细胞。坏死细胞死亡标记物亲环素A的释放31在Chal-24处理细胞的培养基中很容易检测到(图7A). RIP1抑制剂坏死抑素-1可有效阻断Chal-24诱导的细胞毒性(图7B). 此外，通过RNAi抑制坏死途径中的两个关键蛋白RIP1和RIP3，可有效缓解Chal-24诱导的A549和UM-UC-3细胞的细胞毒性(图7C). 再加上发现与坏死有关的Ripotosome形成需要自噬，这些结果强烈表明Chal-24通过自噬介导的坏死诱导细胞毒性。

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Chal-24诱导癌细胞凋亡

（A）用Chal-24（8μM）处理A549细胞指定时间。Western blot检测培养基中的指示蛋白。培养基中主要蛋白成分BSA的Commassie蓝染色用作输入对照。（B）用坏死素-1（20μM）预处理A549细胞30 min，然后用Chal-24（8μM）再处理30 h。通过LDH释放试验检测细胞毒性。所示数据为平均值±标准偏差。*p<0.01。（C）用指示的siRNAs（10 nM）转染A549和UM-UC-3细胞30 h，然后用Chal-24处理30 h（A549为8μM，UM-UC-3为4μM）。通过LDH释放试验检测细胞毒性。所示数据为平均值±标准偏差。*p<0.01。Western blot证实每个蛋白的敲除。β-actin被检测为输入对照。（D）Chal-24诱导的细胞死亡模型。

讨论

这项研究提供了证据，证明自噬介导的坏死凋亡途径可以在癌细胞中激活(图7D)：Chal-24诱导非凋亡细胞死亡，通过抑制关键坏死途径成分RIP1和RIP3而阻断；Chal-24通过JNK介导的Bcl-2和Bcl-xL磷酸化以及Bcl-2/Beclin-1或Bcl-xL/Beclin1复合物的解离强烈诱导自噬；抑制自噬可有效抑制Chal-24诱导的Rippotose形成和坏死细胞死亡。这种涉及自噬介导的坏死性凋亡的新型癌细胞杀伤机制可能是克服癌症化疗耐药性的靶点。

自噬细胞死亡是主要细胞死亡途径之一的概念受到了挑战，因为独立的自噬性细胞死亡可能很少存在9，32，33在大多数情况下，自噬相关死亡伴随着凋亡或坏死。由于自噬在细胞死亡调节中的复杂作用，已经谨慎评估了自噬在癌症治疗中的调节作用。虽然自噬通常被认为可以保护癌细胞免受化疗，但抑制自噬已被测试用于敏化抗癌治疗22然而，在某些情况下，自噬可能会加剧细胞死亡。利用自噬介导的细胞死亡可能是改善化疗的新途径33，34事实上，研究表明，蟾蜍灵通过激活JNK在人类结肠癌细胞中诱导自噬介导的非凋亡性死亡35小分子奥巴曲松和地塞米松联合诱导糖皮质激素耐药急性淋巴细胞白血病细胞自噬介导的坏死26在本研究中，Chal-24在癌细胞中独立诱导自噬介导的坏死。据我们所知，这是第一份报告显示，一种天然衍生化合物能够单独激活自噬介导的坏死，从而有效杀死癌细胞。

MAPK是参与细胞死亡调控的重要细胞信号激酶36尽管p38和ERK被证明直接参与自噬37，38，阻断这两种MAPK对Chal-24诱导的自噬几乎没有影响。因此，尽管Chal-24激活所有三个MAPK，但只有JNK参与自噬诱导，表明每个MAPK参与自吞噬可能是细胞类型和/或刺激依赖性的。我们进一步证明，JNK通过Bcl-2和Bcl-xL的磷酸化激活自噬，Bcl-2/Beclin-1和BclxL/Beclin-1复合物被破坏，这与JNK在饥饿诱导自噬中的报道机制一致30Chal-24共享JNK/Bcl-2-Bcl-xL级联和饥饿诱导自噬表明这是一种常见的自噬调节途径。事实上，我们最近的报告清楚地表明，JNK介导的Bcl-xL调控是TRAIL诱导细胞保护性自噬所必需的39因此，以该途径为靶点可用于调节自噬介导的细胞存活或死亡。此外，我们发现Chal-24不抑制mTORC1活性，这表明mTORCl通路不参与Chal-24诱导的自噬(图S6). 值得注意的是，在最近的一份报告中，Chal-24被证明通过激活ERK或JNK来减少活的A549细胞数量40这与我们的发现不一致。差异的原因目前尚不清楚，但可能是由于使用了不同浓度的Chal-24。事实上，Warmka及其同事在报告中使用了0.3μM的Chal-2440，主要抑制细胞增殖，但仅诱导细胞死亡(图S7)而在较高浓度（4–32μM）下，它主要诱导细胞毒性(图1). 因此，ERK和JNK在Chal-24的不同细胞机制中可能具有不同的作用。然而，尽管Chal-24在不同浓度下的功能不同，但我们的研究结果明确表明，Chal-24通过一种新的自噬介导的坏死途径杀死癌细胞，该途径涉及ERK和JNK。

我们进一步确定，自噬在Chal-24的细胞毒性中介导坏死。虽然这种自噬作用的详细机制需要进一步研究，但它可能涉及c-IAP的破坏。众所周知，c-IAP通过介导RIP1泛素化抑制TNFR1信号传导过程中的坏死41，42最近的研究还发现，c-IAP的降解触发了抗癌药物或TRL3激活诱导的Rippotosome形成和坏死10–12因此，c-IAP在不同刺激诱导坏死性下垂中处于关键位置。与这些报告一致，我们清楚地表明，自噬与ERK一起强烈降低了c-IAP的表达，这与坏死诱导有关。尽管自噬如何下调c-IAP的表达值得进一步研究，但我们的结果清楚地表明，一条涉及自噬介导的下调c-IAPs的途径被激活，从而产生Chal-24诱导的细胞毒性。

虽然我们的结果清楚地表明，JNK和ERK都是自动标记介导的c-IAP降解所必需的，但其机制尚不完全清楚。虽然JNK通过从Bcl2和Bcl-xL的抑制中释放Beclin-1来促进自噬激活，但ERK在c-IAP降解中的作用目前尚不清楚。我们发现，Chal-24在ERK激活后的晚时间点导致c-IAP1的ERK依赖性磷酸化。因此，ERK不太可能是直接的c-IAP1激酶。相反，ERK可能介导一种目前尚未确定的c-IAP1磷酸化途径，该途径是将c-IAP靶向自噬体进行自噬降解所必需的。需要进一步研究来回答这个重要问题。

与细胞凋亡相反，坏死导致细胞成分的释放，这些成分可能刺激炎症反应。尽管人们担心坏死下垂是否会导致过度和系统性炎症，这可能对患者产生不利影响，但肿瘤部位适度的局部炎症可能是有益的，因为它可能引发抗癌免疫43事实上，Chal-24治疗有效抑制了肿瘤生长，而对异种移植瘤治疗模型中的小鼠几乎没有不良影响29这表明诱导肿瘤坏死下垂对患者来说可能是安全的，这需要在未来进行仔细评估。

综上所述，我们的研究结果建立了一种杀死癌细胞的新机制，该机制涉及自噬介导的坏死(图7D)，可用于克服化疗耐药性。需要进一步研究，以确定以该途径为靶点进行抗癌化疗的有效性和可能的副作用。

材料和方法

试剂和抗体

抗Bcl-2（sc-7328）、Beclin1（sc-48341）、GAPDH（sc-32233）和RIP3（sc-47368）的抗体来自圣克鲁斯生物技术公司。抗磷酸JNK（44-682G）、抗磷酸ERK（AHO0061）来自Invitrogen。抗caspase-8（551242）、caspase-3（559565）、c-IAP-1（AF8181）、c-IA P-2（552782）、FADD（556402）、JNK1（554286）、p62（610832）和RIP1（610458）来自BD Biosciences。抗聚ADP核糖聚合酶（PARP，ALX-210-302）来自Enzo。抗β-肌动蛋白（A1978）和抗-LC3B（L7543）购自Sigma-Aldrich。Bcl-xL（#2762）、磷酸化p38（#9211）和XIAP（#2042）的抗体来自细胞信号。ATG7抗体（PA5-17216）来自Thermo Scientific（伊利诺伊州巴林顿）。亲环素A（H00005478-P01）来自Abnova。JNK抑制剂SP600125（129-56-6）、p38抑制剂SB203580（152121-47-6）和Wortmannin（19545-26-7）均来自Calbiochem。氯喹（CQ，50-63-5）来自Sigma-Aldrich。3-甲基腺嘌呤（3MA，sc-205596）和Necrotain-1（4311-88-0）来自圣克鲁斯生物技术公司。泛酶抑制剂z-VAD（ALX-260-039）来自Enzo。ERK抑制剂U0126（#9903）来自细胞信号。所选基因（ATG7 siRNA，M020112和RIP1 siRNA，M-00445-02-005）和非靶向siRNA（Silencer®阴性对照#1 siRNA）的短干扰RNA来自Dharmacom。靶向RIP3（sc-61483）、Beclin1（sc-29797）、ERK1（sc-29307）、ERK2（sc-35335）、JNK1（sc-29380）和JNK2（sc-39101）的siRNA来自圣克鲁斯生物技术公司。

细胞培养

A549和UM-UC-3细胞从美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）获得，并在添加10%胎牛血清、1 mmol/L L-谷氨酰胺、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640中生长。

細胞毒性分析

使用细胞毒性检测试剂盒（威斯康星州麦迪逊市Promega）进行基于乳酸脱氢酶（LDH）释放的细胞毒性试验。细胞以70%至80%的融合率接种在48个培养皿中。培养过夜后，如每个图例所示对细胞进行处理。如前所述确定LDH释放44对于长期存活试验，用Chal-24（3μM）处理细胞3天。培养基每3天更新一次，细胞培养8天，然后用甲醇固定并用亚甲基蓝染色。

Western Blot和免疫沉淀

通过将细胞悬浮在M2缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl[pH7.6]、0.5%NP40、250 mmol/LNaCl、3 mmol/LEDTA、3 mmol/L EGTA、2 mmol/LDTT、0.5 mmol/L-苯甲基磺酰基氟化物、20 mmol/Lβ-甘油磷酸、1 mmol/L/原钒酸钠和1μg/mL亮氨酸蛋白酶）中制备细胞裂解物。用12%或15%的SDS-PAGE溶解每个细胞裂解液中等量的蛋白质，并用Western blot进行分析。根据制造商的说明（EMD Millipore，Billerica，MA），通过增强化学发光对蛋白质进行可视化。每个实验至少重复三次，并显示了具有代表性的结果。为了进行免疫沉淀，细胞在60-mm培养皿中培养，按照图示处理，并在M2缓冲液中溶解。如前所述进行免疫沉淀。简言之，在室温下将20μl蛋白A琼脂糖珠（50%）与1μg Beclin 1抗体在PBS中偶联2 h。然后，添加1 mg细胞裂解物，并在4°C下旋转过夜，与珠培养。将珠粒用M2缓冲液洗涤7次。使用电泳样品缓冲液洗脱免疫沉淀剂。将样品煮沸5分钟，然后装入12%SDS-PAGE凝胶。Western blot检测BCL-XL、BCL-2、Beclin-1 RIP1、FADD和caspase-839.

RNAi敲除ATG7和Beclin1

ATG7、Beclin1和非靶向siRNA（Silencer®阴性对照#1 siRNA）的短干扰RNA来自Thermo Scientific（伊利诺伊州巴林顿）。在转染前一天，将A549和UM-UC-3细胞接种在12孔板和48孔板中，50%融合。干扰蛋白™转染试剂（Polyplus-transfertion，New York，NY）用于将siRNA转染细胞45在转染Chal-24后24小时（A549为8μM，Um-UC-3为4μM）加入培养物中30小时，测定LDH释放以检测Chal-24诱导的细胞毒性，并通过Western blot确认敲除。

荧光显微镜

用GFP-LC3稳定转染的A549细胞在玻璃盖玻片上生长，用Chal-24（8μM）处理2小时，然后在荧光显微镜下检查。所示图像代表了三个独立的实验。计算每个阳性细胞的脓肿细胞百分比和点状细胞平均数46.

统计

所有数据均以平均值±标准差表示。通过单向方差分析检验统计显著性。在所有分析中，p＜0.05被认为具有统计学意义。

补充材料

1

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致谢

本研究部分得到了NIEHS/NIH（R01ES017328）、NCI/NIH（R03CA156301）和重庆市卫生局（2012-2-001）的资助。

脚注

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

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