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英国药理学杂志。2013年10月；170(3): 661–670.
2013年9月17日在线发布。 doi（操作界面）：10.1111/bph.12315
预防性维修识别码：PMC3792003
PMID：23889563

内皮TRPV4通道介导脑动脉扩张：阿尔茨海默病相关脑血管病变的损伤和恢复

张璐清（Luqing Zhang）,* 帕纳伊奥塔·帕帕佐普洛斯，以及伊迪丝·哈默尔
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景和目的

瞬时受体电位香草醛4型（TRPV4）通道在脑内皮细胞中表达，但其在生理和病理条件下调节脑血管张力的作用仍不清楚。

实验方法

使用野生型（WT）小鼠和过度表达人类淀粉样前体蛋白突变形式（APP小鼠，淀粉样β增加模型）、TGF-β1组成活性形式（TGF小鼠，脑血管纤维化模型）或两者（APP/TGF小鼠）的小鼠。在大脑后动脉段测量选择性TRPV4通道开放剂GSK1016790A（GSK）或ACh的扩张。

关键成果

在WT小鼠中，GSK和ACh诱导的扩张在内皮剥脱后几乎消失。与WT相比，APP、TGF和APP/TGF小鼠的血管中的这些反应受损。使用选择性TRPV4通道阻滞剂HC-067047，或使用小电导（SK通道，apamin）和/或中间电导（IK通道，charybdotoxin，ChTx）Ca预培养WT血管2+-敏感K+通道阻滞剂可消除GSK诱导的舒张，并显著降低ACh诱导的舒张。这些处理对ACh诱导的APP、TGF或APP/TGF小鼠血管扩张没有或只有有限的影响，转基因小鼠的IK和SK通道功能得以保留。抗氧化剂超氧化物歧化酶或过氧化氢酶使GSK和ACh介导的扩张仅限于APP脑动脉。

结论和启示

我们得出结论，内皮TRPV4通道介导ACh诱导的脑动脉扩张，在脑血管病理模型中受损，并且对淀粉样β诱导的氧化应激敏感，尽管是可逆的。

关键词：大脑动脉、血管舒张、内皮、氧化应激、淀粉样β肽、TGF-β1

介绍

瞬时受体电位香草素4型（TRPV4）通道是TRP通道超家族的一个成员，是一种Ca2+-可渗透的非选择性阳离子通道。TRPV4通道广泛分布于外周和脑组织（尼利乌斯等.,2004; 卡雷诺等.,2009; 鸠山由纪夫等.,2009; 索尼罗等.,2012)表明它们参与了几个生理过程。这些通道被诸如渗透压变化、细胞肿胀、高温和机械应力（Vriens等.,2004; 奥尼尔和海勒，2005; 克拉克等.,2010; 菲洛萨等.,2013).

TRPV4通道在包括大脑动脉（Vriens）在内的多种血管的内皮细胞（EC）中表达等.,2005; 科勒等.,2006; 马雷利等.,2007; 威利特等.,2008). TRPV4通道调节内皮细胞钙（Ca2+)内流和内皮依赖性舒张（Marrelli等.,2007; 张和古特曼，2011)对流动、剪切应力以及最近证明的ACh（科勒等。，2006; 桑库萨雷等.,2012). 内皮TRPV4通道的激活引发Ca2+激活中间（IK；KCa3.1）和小（SK；KCa2.3）电导Ca的内流2+-敏感K+（K）钙)频道（Sonkusare等.,2012)导致血管平滑肌细胞超极化和血管扩张（Earley，2011).

以慢性脑灌注不足和舒张功能受损为特征的脑血管功能障碍是阿尔茨海默病（AD；Iadecola，2004). 研究表明，淀粉样蛋白β（Aβ）肽以及毒性和炎症因子如活性氧（ROS）的水平增加；Iadecola等。，1999; 公园等.,2004; 用钳子钳起等.,2005)和TGF-β1在AD小鼠模型或患者脑循环中的表达等.,1997;2000; 语法和椭圆，2001). 相应地，过度表达人类淀粉样前体蛋白突变形式（APP小鼠）（TGF-β1的组成活性形式）的小鼠（TGF小鼠；Wyss-Coray等.,2000)或aβ和TGF-β1联合病理学（APP/TGF小鼠；Wyss-Coray等.,1997; 昂加利等.,2010). 皮质SOD应用后，APP和自由基清除剂超氧化物歧化酶1（SOD1）的共同表达可以修复这些缺陷（Iadecola等.,1999)，和依据在体外（动力钳等.,2005)或体内（尼古拉卡基斯等.,2008)用抗氧化剂治疗APP小鼠脑血管或小鼠。相反，在AD脑血管病变的TGF和APP/TGF模型中，包括炎症和促纤维化过程，脑血管缺损对抗氧化治疗无反应（Tong等.,2005; 昂加利等.,2010; 尼古拉卡基斯等.,2011). 然而，关于TRPV4通道在脑血管中的作用，以及它们的功能是否在复制AD中发现的脑循环病理中改变，目前的信息有限。

在本研究中，我们证明TRPV4通道（i）是脑动脉扩张功能的关键介质；（ii）在APP、TGF和APP/TGF小鼠的脑血管病理模型中发生改变；和（iii）对ROS敏感。

材料和方法

材料

GSK1016790A[（N-（（1S）-1-{[4-（（2S）-2-{[（2,4-二氯苯基）磺酰基]氨基}3-羟基丙基）-1-哌嗪基]羰基}-3-甲基丁基）-1-苯并噻吩-2-甲酰胺]（GSK）、SOD、过氧化氢酶、苯肾上腺素（PE）、ACh和硝普钠（SNP）均来自Sigma-Aldrich（加拿大安大略省奥克维尔）。NS309（6,7-二色-1H（H）-吲哚-2,3-二酮3-肟）和HC-067047（2-甲基-1-[3-（4-吗啉基）丙基]-5-苯基-N-[3-（三氟-甲基）苯基]-1H吡咯-3-甲酰胺；HC）来自Tocris Bioscience（美国密苏里州埃利斯维尔）。Charybodotoxin（ChTx）和apamin来自Abcam（英国剑桥Abcam有限公司）。

动物

C57BL/6J背景下的杂合转基因小鼠及其野生型（WT）同窝仔（3-6个月大，体重~30克）在室内繁殖，每组雄性和雌性数量大致相等。所有实验均经蒙特利尔神经病学研究所（加拿大蒙特利尔麦吉尔大学）动物伦理委员会批准，并符合加拿大动物护理委员会的地方和国家法规。所有涉及动物的研究均按照ARRIVE动物实验报告指南进行报告（基尔肯尼等.,2010; 麦格拉思等.,2010). 小鼠被关在一个12小时的光暗周期内，在一个温度（23°C）和湿度（50%）可控的房间里，有食物和自来水随意.

APP小鼠过度表达携带PDGFβ链启动子（APP小鼠，J20系；Mucke等.,2000). APP小鼠表现出Aβ诱导的脑血管氧化应激和早期（2-4个月）内皮介导的舒张功能受损（Tong等.,2005). TGF小鼠在胶质纤维酸性蛋白启动子（TGF小鼠，T64系）的控制下过度表达组成活性形式的TGF-β1，并显示AD的脑血管纤维化病理学（Wyss-Coray等.,2000; 用钳子钳起等.,2005)脑血管舒张功能早期受损（童等.,2005). 双转基因APP/TGF小鼠同时过度表达这两个转基因（Wyss-Coray等.,2001; 昂加利等.,2010)其特征是aβ-和TGF-β1联合诱导的脑血管病理学，并伴有早期延迟缺陷（Ongali等.,2010). 转基因表达通过触地PCR（Wyss-Coray等.,1997; 用钳子钳起等.,2005).

脑血管反应性研究

大脑后动脉（PCA；平均管腔内直径，80–90μm）是从WT和因颈椎脱位而安乐死的转基因小鼠中分离出来的，并收集在冷氧条件下（95%氧合）2和5%CO2)克雷布斯溶液（4°C，pH 7.4±0.1）含有以下物质（单位：mM）：118 NaCl，4.5 KCl，2.5 CaCl2，1硫酸镁，1千赫2人事军官4，25氯化钠3和11葡萄糖。如前所述，使用在线视频显微镜（Living Systems Instrumentation，Burlington，VT，USA）测量安装在灌注室系统中的加压PCA段（长约2 mm）的反应性（Tong等.,2005). 在一端用玻璃微移液管（直径～40μm）对血管进行插管，另一端用另一玻璃微移管密封，并用含氧克雷布斯溶液填充（37±1°C，pH 7.4±0.1）。使用压力伺服微型泵（生活系统）将腔内压力维持在60 mmHg。血管过度灌注（6 mL·min−1)使用Krebs溶液，并使其稳定并获得基音（30-45分钟）。使用闭路视频系统和视频卡尺（Image Instrumentation，Trenton，NJ，USA）进行管腔内直径的在线测量。

TRPV4通道和ACh反应的药理学特征

所有化合物均在灌流溶液中外用。GSK引起的扩张（10−11–10−5M、 选择性TRPV4通道激动剂EC50Thorneloe小鼠TRPV4通道的值～18 nM等.,2008)，ACh（10−11–10−4M） 或NS309（10−10–10−5M、 选择性IK/SK通道激动剂EC50约10 nM，斯特罗贝克等.,2004)用PE（2×10−7M） ●●●●。在一些血管中，用选择性TRPV4通道拮抗剂HC（10−9–10−6M、 或10−6M（M）,集成电路50小鼠TRPV4通道的值为～20 nM；埃费拉茨等.,2010)强效和选择性SK通道阻滞剂apamin（10−8M、 集成电路50值<8 nM；格伦奈特等.,2010)、IK通道阻滞剂ChTx（5×10−8M、 集成电路50值<28 nM；格伦奈特等.,2010)或SK和IK通道阻断剂两者的组合。在动脉段与自由基清除酶SOD、120 U mL预孵育（30–60分钟）之前和之后，测试了对GSK或ACh反应的血管缺陷的可逆性−1或过氧化氢酶（1000 U mL−1). 在某些动脉中，GSK的舒张反应（10−11–10−5M） 和ACh（10−11–10−4M） 通过将气泡穿过内腔（20–30 s）去除EC前后进行测试。在这些血管中，用NO供体SNP（10−11–10−4M） ●●●●。

脑血管反应的计算和统计分析

根据GSK和ACh的剂量依赖性和最大（EAmax）反应（以基础或药物诱导张力引起的血管直径变化百分比表示）和/或效力（pD2EC值或-log50)表示为平均值±SEM。适当时，通过使用双拮抗剂（竞争性和非竞争性；Van den Brink，1977). 统计差异由单向确定方差分析后跟一个临时的Dunnett或Newman–Keuls多重比较测试，或学生指示时t吨-测试两组比较。所有统计和分析均使用软件Prism 4（Graph Pad，San Diego，CA，USA）进行。A类P（P）<0.05被认为是显著的。

结果

TRPV4通道通过钙诱导脑动脉扩张2+-激活的K+通道

为了确定TRPV4通道是否参与大脑动脉的舒张功能，将选择性TRPV4激动剂GSK注射到WT小鼠的PCA段。如图所示​图1A，1A、 GSK有效且剂量依赖性地扩张（EAmax:59.2±6.0%）预收缩PCA片段，其效力（pD2：8.12±0.16）与小鼠TRPV4通道（Thorneloe）的亲和力完全兼容等.,2008). 此外，通过使用选择性TRPV4通道阻滞剂HC（10−6M；图​图1A）。1A） ●●●●。钙2+-激活的SK和IK通道被认为是钙的重要靶点2+通过TRPV4通道（Sonkusare）流入等.,2012). 因此，我们使用SK阻滞剂apamin（10−8M） 探讨TRPV4介导的血管舒张机制，发现其几乎消除（-80.7%，P（P）<0.001）GSK诱导WT小鼠PCA节段的扩张（图​（图1B），1B） ，证实SK通道激活在TRPV4通道介导的延迟反应中的作用。

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HC和apamin拮抗GSK诱导的WT小鼠PCA段脑血管扩张。用TRPV4通道阻滞剂HC（10−6M） （A）或被SK阻滞剂apamin有效降低（10−8M） （B）**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，与未经处理的WT血管相比方差分析然后是纽曼-基尔斯临时的对比试验。误差条代表SEM。n个=每组3-4人。

已知ACh可调节不同物种脑动脉的内皮依赖性舒张（Rosenblum，1992; 马克特等.,1997)和TRPV4通道最近被证明有助于ACh诱导的肠系膜动脉扩张（Sonkusare等.,2012). 因此，我们研究了TRPV4通道是否参与ACh诱导的WT小鼠脑动脉扩张。ACh可引起浓度依赖性舒张（EAmax:35.8±2%；pD2: 7.86 ± 0.1; 图​图2A）2A） 通过增加浓度（10−9–10−6M） 选择性TRPV4通道阻断剂HC的剂量-反应曲线向右偏移和ACh疗效下降（图​（图2A）。2A） ●●●●。HC表现为混合竞争性/非竞争性拮抗剂，显著降低ACh最大扩张（EAmax）和效价（pD2价值；图​图2B）。2B） ●●●●。HC估计pA2值为7.82和pD210时的值6.83−7M与报道的亲和力（pIC50=7.7）在TRPV4受体（Everaerts等。，2010). 这些发现表明TRPV4通道有助于ACh诱导的脑血管扩张。

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TRPV4通道阻滞剂HC对ACh诱导的WT脑动脉扩张的影响。（A） 选择性TRPV4通道阻滞剂HC的剂量依赖性（10−9–10−6M） 与未经治疗的WT血管段相比，拮抗ACh诱导的扩张。（B） HC表现为混合竞争性非竞争性拮抗剂，显著降低ACh效价（EAmax，上面板）和ACh亲和力（pD2值，下面板）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，与未经处理的WT血管相比方差分析然后是Dunnett临时的多重比较试验。n个=每组3-6人。

与GSK的观察结果类似，通过使用IK和SK通道阻滞剂预处理动脉，可以有效抑制ACh介导的WT小鼠PCA片段的脑扩张（图​（图3A）。3A） ●●●●。SK阻滞剂apamin（10−8M） 和IK阻滞剂ChTx（5×10−8M） 显著降低ACh最大扩张（−57.9%，P（P）<0.001和-52.7%，P（P）分别<0.001），效力无变化（图​（图3B）。3B） ●●●●。ACh诱导的最大松弛度仅稍有降低（−62.8%，P（P）<0.001）通过结合apamin和ChTx（图​（图3A，3A、 B），指出这些Ca的可能重叠作用2+-敏感K+ACh诱导的脑血管扩张或所选拮抗剂缺乏选择性。未来使用IK阻滞剂而非ChTx阻滞剂的研究，该阻滞剂也能阻止大电导率钙2+-敏感K+具有高亲和力的通道（BK）和电压门控（Kv1.3）通道（Grunnet等.,2010)将有助于阐明IK通道在ACh响应中的确切贡献。

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IK和SK通道阻滞剂对ACh诱导的WT脑动脉扩张的影响。（A） SK（apamin）或IK（ChTx）通道的阻断剂单独或联合抑制ACh最大扩张，而ACh剂量-反应曲线没有任何变化。（B） Apamin和ChTx降低ACh效力（EAmax，上图），但不降低ACh亲和力（pD2值，下部面板）**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，与未经处理的WT血管相比方差分析然后是Dunnett临时的多重比较试验。误差条代表SEM。n个=对照组为10，每个药物组为3。

TRPV4介导的GSK和ACh扩张依赖于内皮细胞

据报道，TRPV4通道不仅存在于内皮细胞中，也存在于血管平滑肌细胞中，TRPV 4激动剂可能通过激活BK（KCa1.1）通道（Earley等.,2005). 因此，我们评估了TRPV4介导的脑动脉扩张是内皮依赖性的还是在平滑肌细胞水平介导的。GSK和ACh诱导的WT小鼠PCA片段的扩张（分别为43.6±1.4%和55.8±2.8%）在内皮剥脱后消失（<1%，P（P）<0.001），而与对照血管相比，裸露节段对平滑肌松弛剂和NO供体SNP的扩张保持不变（EAmax分别为34.0±2.6%和38.0±1.5%）。这些结果表明，TRPV4通道介导的扩张是内皮依赖性的。

APP、TGF和APP/TGF小鼠脑动脉中TRPV4受损，但SK/IK通道功能未受损

先前的研究表明，ACh诱导的脑血管扩张在APP、TGF和APP/TGF小鼠（Iadecola等.,1999; 丹羽等.,2002; 用钳子钳起等.,2005; 尼古拉卡基斯等.,2008;2011; 昂加利等.,2010)，但没有尝试调查潜在的受体改变。因此，我们从这些不同的脑血管功能障碍动物模型的PCA片段中检测了TRPV4-SK/IK信号级联的完整性，这些动物模型在建立缺陷的年龄段（Tong等。，2005; 昂加利等.,2010). 正如预期的那样，APP、TGF和APP/TGF小鼠脑血管减少了ACh介导的扩张（图​（图4）4)受体亲和力（pD）无变化2值，表​表1）。1). 此外，与WT小鼠相反，在三种转基因小鼠模型中，ACh诱导的PCA片段松弛并没有通过使用选择性TRPV4通道阻滞剂HC（10−6M） （图​（图4A–C，4A–C，表​表1）。1). 类似地，与WT血管相比，用阿帕明（10−8M） 和ChTx（5×10−8M） 对ACh诱导的转基因小鼠脑动脉扩张没有显著影响（图​（图4D–F），4D–F），尽管APP小鼠对ACh的剂量-反应曲线发生了微小但显著的右移（图​（图4D，4D、 表​表2）。2). 然而，IK/SK通道开放剂NS309在WT、APP和TGF小鼠中诱导的扩张相似（图​（图5），5)表明TRPV4而非IK/SK通道在转基因小鼠中功能失调。

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HC和联合apamin+ChTx降低了WT脑动脉的ACh扩张，但不降低APP、TGF和APP/TGF小鼠的血管ACh扩张。与WT血管相比，ACh诱导的APP（A）、TGF（B）和APP/TGF（C）小鼠脑血管扩张明显受损。HC治疗（10−6M） 显著降低WT血管的ACh扩张，但对APP（A）、TGF（B）或APP/TGF（C）动脉段没有或仅有轻微影响。与HC类似，apamin（10−8M） 和ChTx（5×10−8M） 仅影响WT小鼠的血管，但不影响转基因APP、TGF或APP/TGF小鼠（D–F）的血管。ACh pD仅轻微但显著下降2在APP小鼠（D）中观察到该值*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001和⋆⋆P（P）< 0.01, ⋆⋆⋆P（P）<0.001，与未经处理的WT血管相比方差分析然后是纽曼-基尔斯临时的对比试验。误差条代表SEM。n个=每组3-6人。

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在转基因小鼠中保留了对IK/SK通道激活剂NS309的扩张反应。IK/SK通道激活剂NS309在WT、APP和TGF小鼠PCA段的浓度-反应曲线具有可比性。NS309[pD的亲和力2各组脑血管通道的EC50值或−log（EC50）也具有可比性，分别为7.58±0.25、7.99±0.31和7.18±0.29。误差条代表SEM。n个=每组5人。

表1

HC的影响（10−6M） 脑血管对ACh的反应（10−4M） WT、APP、TGF和APP/TGF小鼠的PCA片段

治疗重量(n个= 6)应用程序(n个= 3)TGF公司(n个= 3)APP/TGF公司(n个= 3)
EA最大值控制35.8 ± 1.925.2 ± 2.923.4 ± 3.118.3 ± 2.0
HC公司16.2 ± 0.7一19.9 ± 2.019.3 ± 4.216.6 ± 2.4
第页2控制7.86 ± 0.107.95±0.218.06 ± 0.238.16 ± 0.16
HC公司6.34 ± 0.22一7.36 ± 0.218.02 ± 0.328.18 ± 0.23

数据为数字的平均值±SEM(n个)括号中所示的小鼠，表示为最大激动剂反应（EAmax，诱导张力的扩张百分比）或效力[pD2值或−log（EC50)]. HC仅在WT小鼠中具有显著作用。

一P（P）学生在HC治疗前与各自的对照组相比<0.001t吨-测试。

表2

阿帕明联合用药的效果（10−8M） 和ChTx（5×10−8M） 脑血管对ACh的反应（10−4M） WT、APP、TGF和APP/TGF小鼠的PCA片段

治疗重量(n个= 3)应用程序(n个= 3)TGF公司(n个= 3)APP/TGF公司(n个= 3)
EA最大值控制45.7 ± 2.524.3 ± 2.723.4 ± 2.918.0 ± 3.1
阿帕明+ChTx15.9 ± 2.0b条18.3 ± 3.920.4 ± 5.313.4 ± 2.0
第页2控制7.67 ± 0.148.28 ± 0.248.04±0.258.02 ± 0.28
阿帕明+ChTx7.23 ± 0.287.05 ± 0.35一7.93 ± 0.367.98 ± 0.27

数据为数字的平均值±SEM(n个)括号中所示的小鼠，表示为最大激动剂反应（EAmax，诱导张力的扩张百分比）或效力[pD2值或−log（EC50)]. Apamin和ChTx显著降低了WT小鼠中ACh介导的反应，并对APP小鼠中ACh的效力产生了微小但显著的影响。

一P（P）<0.05和b条P（P）<0.001，与治疗前各自的对照组相比，由Studentt吨-测试。

抗氧化剂对APP小鼠脑动脉TRPV4-SK/IK通道功能的修复作用，但对TGF和APP/TGF小鼠无明显作用

内皮依赖性舒张功能受损是APP、TGF和APP/TGF小鼠脑血管功能障碍的早期标志。特别是，这种缺陷被归因于Aβ诱导的APP小鼠（Iadecola）的血管氧化应激等.,1999; 用钳子钳起等.,2005; 公园等.,2008)而在TGF和APP/TGF中，与血管纤维化相关的信号改变与舒张能力降低有关（Tong等.,2005; 昂加利等.,2010; 尼古拉卡基斯等.,2011). 与这些观察结果一致，我们发现在体外用SOD或过氧化氢酶对APP小鼠的PCA片段进行抗氧化处理，使GSK和ACh诱导的扩张完全恢复到WT水平（图​（图6A–C）。6A–C）。相比之下，TGF或APP/TGF血管与SOD的过度融合没有任何益处，并且血管在GSK或ACh的作用下仍表现出扩张受损（图​（图7）。7). 这些发现表明，TRPV4通道对Aβ诱导的氧化应激敏感，而脑血管纤维化需要通过与氧化应激无关的机制解除其调控。

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SOD或过氧化氢酶对ACh和GSK诱导的APP小鼠PCA脑血管扩张的影响。与WT血管相比，ACh-（A）和GSK-（B和C）诱导的APP血管的脑血管扩张减少。SOD或过氧化氢酶治疗使这些反应完全恢复到与WT动脉相当的水平。SOD（A和B）或过氧化氢酶（C）对WT小鼠的血管无影响*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）与未经治疗的WT血管相比，<0.001；⋆P（P）< 0.05, ⋆⋆P（P）< 0.01, ⋆⋆⋆P（P）<0.001，与SOD或过氧化氢酶处理的APP血管相比方差分析然后进行Newman–Keuls对比测试。误差条代表SEM。n个=每组3人。

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SOD对ACh-和GSK-诱导的TGF和APP/TGF小鼠脑动脉扩张的影响。与WT小鼠相比，TGF和APP/TGF小鼠ACh-（A）和GSK-（B）诱导的舒张功能受损。SOD治疗并没有缓解这些缺陷*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，与未经处理的WT血管相比，使用方差分析然后是Dunnett临时的测试。误差条代表SEM。n个=每组3人。

讨论

我们的研究结果表明：（i）TRPV4通道是小鼠脑动脉内皮依赖性舒张的重要介质，包括毒蕈碱ACh受体（mAChR）激活诱导的内皮依赖性扩张；（ii）这些通道在再现AD脑血管病理学不同方面的转基因小鼠模型中发生改变；和（iii）它们对aβ诱导的血管氧化损伤敏感，尽管是可逆的。相反，在TGF和APP/TGF小鼠中观察到的涉及血管纤维化的病理中，TRPV4通道功能障碍不能通过抗氧化治疗得到纠正。

据报道，TRPV4通道存在于大脑内皮细胞中，调节钙内流和内皮依赖性超极化因子（EDHF）介导的舒张（Marrelli等.,2007). 在这里，我们表明TRPV4通道介导了部分内皮依赖性ACh诱导的小鼠脑动脉扩张，并且这种反应是由IK和/或SK通道激活引起的。在WT脑动脉中，我们对内皮剥脱血管的结果证实TRPV4通道位于内皮。此外，TRPV4通道开放剂GSK直接激活WT动脉中的TRPV4通路，导致脑血管扩张，HC（一种有效且选择性的TRPV4-通道阻断剂（Everaerts等.,2010; 夏希杜拉等.,2012)或者通过SK阻滞剂apamin。其他研究结果表明，HC、apamin、ChTx或apamin和ChTx的联合作用对ACh诱导的WT血管脑血管舒张功能造成了类似程度的损害（−50–60%），进一步证明了mAChRs和TRPV4-IK/SK通道信号级联之间的相互作用。总之，这些发现与内皮依赖性mAChR通过TRPV4介导的IK和/或SK通道刺激促进血管舒张作用一致，可能通过EDHF途径（Marrelli等.,2007)最近在肠系膜动脉（Sonkusare等.,2012). 在TRPV4中–/–小鼠，ACh诱导的肠系膜动脉节段扩张减弱但未消除（张等。，2009)，建议添加Ca2+EC的进入途径。WT血管中的发现表明，TRPV4通道拮抗剂HC完全消除了GSK介导的舒张反应，但仅部分降低了ACh诱导的舒张反应（～55%），这表明约一半的mAChR介导的扩张通过其他途径发生，例如NO信号传导（Zhang等.,2009; 豪伊特等.,2012)可能还有H2O（运行）2取决于氧分压（杜隆等。，2007). 同样，在小鼠肠系膜动脉中，mAChR介导的扩张同时含有NO和EDHF（76%）成分（Sonkusare等.,2012). 有趣的是，在大鼠颈动脉中，Ca2+据报道，通过TRPV4通道激活进入可触发NO和EDHF介导的血管舒张（科勒等.,2006).

我们研究的一个重要发现是TRPV4和SK/IK通道阻滞剂对GSK和ACh诱导的WT小鼠舒张功能的唯一损害。事实上，这些阻滞剂对APP、TGF或APP/TGF小鼠脑血管没有影响或影响很小，这表明脑血管功能或结构改变的小鼠的血管中已经存在TRPV4-SK/IK通道信号级联故障。APP和TGF小鼠使用选择性激活剂NS309后，IK/SK通道的功能得以保留，这进一步表明TRPV4通道功能失调。在各种AD小鼠模型中，内皮介导的舒张功能受损是aβ诱导脑血管功能障碍的一个关键标志，并被归因于aβ诱导的氧化应激（Iadecola等.,1999; 公园等.,2004;2008; 用钳子钳起等.,2005). 有趣的是，用SOD或过氧化氢酶对隔离动脉进行抗氧化处理，这两种酶分别清除O2–和过氧化氢，使GSK和ACh诱导的APP脑动脉扩张完全正常化，正如之前报道的不同APP小鼠（Iadecola等.,1999; 用钳子钳起等.,2005). 与我们的研究结果一致，在糖尿病大鼠中，O2–可以抑制脑动脉中BK、ATP敏感的K+和内向整流的K+通道，局部应用SOD和过氧化氢酶可以恢复这些损伤（Erdös等.,2004).

相反，在脑血管床结构发生改变的TGF和APP/TGF转基因小鼠中，抗氧化治疗不能挽救TRPV4通道介导的舒张功能降低，正如之前报道的ACh诱导的舒张功能（Tong等.,2005; 昂加利等.,2010; 帕帕佐普洛斯等.,2010; 尼古拉卡基斯等。，2011). 这些发现表明抗氧化剂通过清除非生理水平的O2–和H2O（运行）2对由Aβ诱导的血管氧化应激引起的TRPV4通道功能障碍发挥有益作用，但对涉及脑血管纤维化的病理学不起作用（Wyss-Coray等.,2000; 用钳子钳起等.,2005; 昂加利等.,2010). 先前对TGF小鼠的研究将抗氧化耐受性脑血管损伤归因于血管活性蛋白及其下游信号级联的水平或活性的改变（Tong等.,2005; Tong和Hamel，2007)，可以挽救体内通过具有抗炎特性的药物（尼古拉卡基斯等.,2011). 相反，APP/TGF船舶拒绝在体外抗氧化剂（Ongali等.,2010)和体内抗炎治疗（帕帕佐普洛斯等.,2013)针对其复杂的Aβ和纤维化脑血管病变。

总的来说，我们对脑血管的研究结果增加了TRPV4通道在外周血管中的作用。特别是，除了参与剪切应力、环氧碳三烯酸和植物衍生黄酮诱导的扩张（科勒等.,2006; 厄利，2011; 妈妈等.,2012)内皮TRPV4通道似乎是ACh诱导的两个外周血管扩张的重要介质（Sonkusare等.,2012)和脑动脉（本研究）通过普通IK和/或SK通道级联。重要的是，我们报告称，aβ诱导的血管氧化应激严重损害了脑血管TRPV4通道的功能，尽管是可逆的，而涉及脑血管纤维化的病理对抗氧化治疗不敏感。这些发现在试图挽救患有aβ和TGF-β1联合病理学（Wyss-Coray等.,2000; 语法和椭圆，2001; 用钳子钳起等.,2005; 尼古拉卡基斯和哈默尔，2011). 我们认为TRPV4通道可能是AD患者脑血管功能恢复的一个有希望的靶点。

致谢

这项工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR，MOP-12601，E.H.）的资助。作者非常感谢汤新康博士对实验的培训和帮助。

术语表

AD公司阿尔茨海默病
应用程序淀粉样前体蛋白
更改Tx河豚毒素
EDHF公司内皮依赖性超极化因子
葛兰素史克GSK1016790A型
HC公司HC-067047型
IK（IK）中间电导Ca2+-敏感K+（K）钙)通道
K（K）钙钙2+-敏感K+
单克隆抗体受体毒蕈碱ACh受体
PCA公司大脑后动脉
体育课苯肾上腺素
ROS公司活性氧物种
SNP公司硝普钠
草地超氧化物歧化酶
SK公司小电导率Ca2+-敏感K+（K）钙)通道
TRPV4型瞬时受体电位香草醛4型

利益冲突

提交人声明没有利益冲突。

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文章来自英国药理学杂志由以下人员提供英国药理学学会