初级Ca²⁺通过内皮TRPV4通道的信号调节血管功能

摘要

内皮细胞排列在所有血管中，调节平滑肌收缩状态（张力）。细胞内游离钙（[Ca²⁺]_我)内皮细胞内通过肌醇三磷酸受体（IP₃Rs）在内质网膜中。尽管Ca²⁺-内流通路的特征不完全，非选择性阳离子通道的瞬时受体电位（TRP）家族成员参与了这一功能。特别是，基因敲除研究的结果表明，香草醛（TRPV）家族成员TRPV4参与内皮依赖性血管扩张，以响应血流和乙酰胆碱（ACh）(1–5).

内皮细胞[Ca增加²⁺]_我激活EC通路，终止于可溶性因子的释放或启动使邻近血管平滑肌细胞膜超极化的过程，从而促进扩张。这些Ca²⁺-依赖性血管舒张作用可分为三大类：（i）一氧化氮（NO），一种组织渗透性气体，是由内皮型一氧化氮合酶（eNOS）催化精氨酸氧化为瓜氨酸的副产物(6)；（ii）通过磷脂酶A产生的前列腺素₂依赖于环氧合酶（COX）的激活(7)；和（iii）内皮衍生超极化因子（EDHF），其特点是严格依赖EC中间导电（IK；K）的活性_钙3.1）和小电导率（SK；K_钙2.3），钙²⁺-敏感钾（K⁺)通道(8). 尽管有许多因素被认为是EDHF，但越来越多的证据表明，EC-IK和/或SK通道介导的超极化电流通过缝隙连接向平滑肌细胞的电子强直传播的重要性(8,9).

钙的研究²⁺使用传统Ca的内皮细胞信号传导²⁺-结合荧光染料（如Fluo-4）受到强Ca的干扰²⁺-邻近平滑肌细胞的信号传导活性，这些细胞也容易吸收这种染料。最近开发的一种替代品是转基因小鼠，它表达基因编码的Ca²⁺血管壁内皮中专用的生物传感器（GCaMP2）(10,11). GCaMP2是Ca的融合蛋白²⁺-结合蛋白钙调蛋白和循环排列增强型绿色荧光蛋白（EGFP），当Ca²⁺与钙调蛋白结合。GCaMP2蛋白在整个EC中均匀表达(10)并允许长时间、稳定地记录细胞内钙²⁺在完整血管壁的内皮细胞中，没有来自平滑肌的信号污染。使用此模型，我们之前确定了本地、IP₃R介导的钙²⁺EC中的事件，称为Ca²⁺脉冲星(10)之前，传统成像协议无法检测到。

识别Ca²⁺-阻力动脉（即对调节外周阻力和血压很重要的动脉）内皮细胞内的内流途径，我们对钙进行了成像²⁺用共焦显微镜观察GCaMP2小鼠分离的肠系膜小动脉（直径100μm）的荧光(12). 通过手术打开并固定分离的动脉，使EC表面朝上（面部准备），以提高光学分辨率(10). 在单个视场中，局部Ca²⁺可同时记录14个单个EC中的信号，空间分辨率（0.3μm）和时间分辨率（15 ms）都很高。通过测量1.7μm范围内随时间变化的荧光强度，离线分析事件²与活动站点相对应的图像上的感兴趣区域。

带IP₃用肌浆网/内质网钙预处理消除R介导的信号²⁺-ATP酶（SERCA）抑制剂、环丙磺酸（CPA）或磷脂酶C（PLC）阻滞剂U73122(10)，当地Ca²⁺可以检测到不同于脉冲星的信号[图1，A（左）和B（左上）；图S2A（左）；和电影S1]尽管频率很低[2.8±0.8（SEM）每2分钟每个场的事件位置；n个=5]，可能反映细胞外钙²⁺大量涌入。内皮表面暴露于有效的选择性TRPV4通道激动剂GSK1016790A（GSK；10 nM）(13,14)诱导显著增加[30.4±2.5（SEM）–倍，n个=5]这些钙的活性²⁺信号[图1，A（右）和B（右上）；图S2、A和B; 和电影S2]，不增加全局[Ca²⁺]_我(图1B和电影S1到S4).

在单独的窗口中打开

图1

GSK诱导钙²⁺信号代表Ca²⁺通过质膜TRPV4通道流入。(A类)钙²⁺对表达GCaMP2的小鼠肠系膜三级动脉的表面制备进行成像，显示局部IP活性的变化₃R非依赖Ca²⁺从感兴趣区域（1.7μm）随时间（记录道，如下）记录的信号²)，由图像中的方框表示（如上）。字段中的EC用红色虚线表示（左上图）。比例尺：10μm。左下：在缺少IP的情况下检测到的本地化事件（箭头）₃R-介导的信号传导；右下角：添加GSK（10 nM）后的局部事件。(B类)顶部面板：显示所有IP的伪彩色覆盖图像₃R非依赖Ca²⁺在94-s间隔内单个场中不存在或存在GSK（10 nM）时检测到的信号事件。比例尺：10μm。底部面板和记录道：在相同间隔内从单个站点记录的伪线扫描图像和相关记录道。比例尺：2秒。右侧的校准条指示信号强度(F类/F类₀; 荧光F类除以基线荧光F类₀). (C)显示IP动力学特性差异的代表性痕迹₃R介导的钙²⁺脉冲星（左）和TRPV4介导的Ca²⁺在存在10 nM GSK（无CPA）的情况下，从相同视野观察到的事件（右）。(D类)每个领域每2分钟增加的站点数量和每个领域的活动（右图；n个=4至6条动脉），存在GSK（10 nM）、4α-PDD（5μM）或11,12-EET（1μM）。(E类)HC（1μM；n个=5）和RuR（5μM；n个= 3). 误差条（C和D）、SEM。

与Ca不同²⁺短脉冲星（<300ms）、尖峰信号、GSK诱导的钙²⁺事件呈现出振幅离散的平台阶段(图1C). 它们在EC内的空间分布为11.2±0.4（SEM）μm²（50个站点，n个=5条动脉），约占细胞总表面积的0.6%，且在相同部位重复出现(图1、A和B). 也与Ca形成对比²⁺脉冲星，主要出现在与内皮细胞向平滑肌的投射位置相对应的内部弹性层（IEL）中的“孔”处(10)，TRPV4-介导的钙²⁺信号大致均匀分布在这些孔（39%）和细胞末端（31%）之间；图S2B).

TRPV4通道的药理激活剂4α-福尔波12,13-二元酸（4α-PDD）和TRPV4渠道的内源性激活剂11,12-环氧三烯酸（11,12-EET）诱导IP₃R非依赖Ca²⁺与GSK诱发事件类似的信号(图1D和图S3C). 选择性TRPV4通道拮抗剂HC-067047（HC；1μM）(13,15)非选择性TRPV孔隙阻滞剂钌红（RuR；5μM）抑制GSK（10 nM）诱导的Ca²⁺信号约93%，减少了站点数量和每个站点的活动(图1E和图S2D和S3B). 此外，葛兰素史克对TRPV4的动脉没有影响^−/−老鼠[P（P）= 0.88,n个= 5; 成对双样本t吨测试(12)]. 值得注意的是，快速去除外部钙²⁺消除GSK诱导的钙²⁺事件(n个= 4;图S2C). 因此，这些IP₃与R无关的光信号反射Ca²⁺通过质膜TRPV4通道流入。

TRPV4介导的钙²⁺信号表现出单通道的特征，包括平方、离散振幅(图1，A到C;图S2、A、C和D; 和图S3、A至C). 这种荧光信号可以推断为代表钙²⁺如果满足以下标准，则通过单通道流入(16)：（1）记录体积很小（<1 fL）；（2） 事件是量子的（即，表现出固定振幅步长）；（3） 振幅步长取决于Ca²⁺电化学梯度；（4） 振幅步长不取决于激动剂或拮抗剂的浓度或性质；（5） 事件持续时间呈指数分布；和（6）通道具有高Ca²⁺磁导率和单通道电导。对于厚度约为0.5μm（产生约0.8 fL的记录体积）的天然EC，第一个标准可能是自然存在的，并且TRPV4信道满足最后一个标准(17). 多高斯拟合荧光信号的全点直方图(图2A) (12)显示的量子振幅（标准2），间隔均匀F类/F类₀增量(F类/F类₀：相对于基线荧光的荧光变化）0.19，细胞外钙浓度为2 mM²⁺.增加细胞外钙²⁺从2到10毫微米增加了这些事件的振幅(图2A)和100 mM K的膜去极化⁺振幅降低(图2B)表明对钙的依赖性²⁺电化学梯度（标准3）。此外，这些事件与所用激动剂或拮抗剂的浓度和性质无关（标准4）：GSK浓度从3 nM增加到10 nM，活性增加（荧光积分）3.7±0.8（SEM）–倍(n个=3条动脉；图S3A，左），但没有增加振幅(图S3A，右）；特异性TRPV4抑制剂HC降低活性，但不降低幅度(图S3B)；和其他TRPV4通道激活剂（4α-PDD和11，12-EET）对振幅没有差异影响(图S3C). 最后，GSK（3 nM）诱导事件的持续时间呈指数分布（标准5），时间常数为37.0±0.7 ms(图2C) (12). 因此，每个量子能级似乎代表Ca²⁺通过血管内皮细胞质膜中单个TRPV4通道的内流。与L型钙类似²⁺首次在心肌细胞中描述的通道介导事件(18)，我们使用术语TRPV4火花表示光学检测到的细胞外钙内流²⁺通过单个TRPV4通道。

在单独的窗口中打开

图2

TRPV4钙²⁺火花作为显示协同激活的单一事件。(A类)多个高斯拟合到显示均匀间距Δ的所有点直方图F类/F类₀2 mM细胞外钙水平为0.19²⁺在10mM Ca下为0.29²⁺. (B类)降钙效果²⁺100mM K膜去极化的电化学梯度⁺关于Ca²⁺信号。(C)使用Fluo-4和10μM EGTA-AM的GSK（10 nM）诱导火花持续时间的指数分布。采样率，50至60图像/sτ，时间常数。(D类)通过第二、第三和第四级频率的偏差（以开放概率衡量，P（P）_{O（运行）})根据二项分布预测独立事件。条件与（C）相同。

每个火花点显示了多达四个量子能级，其间散布着长时间的静止期。如果这些离散振幅阶跃代表独立运行的信道，则其概率应遵循二项式分布。观察到的分布明显偏离了二项式分布(P（P）< 0.01; χ²测试），超过两次、三次和四次事件(图2D) (12)表明TRPV4通道协同开放，可能反映了细胞内钙离子对附近TRPV4渠道的增强作用²⁺(19). 火花活动的扩散和终止程度可能反映了较高浓度细胞内钙的抑制作用²⁺(17). 在所使用的成像条件下本应可以分辨的第五个水平没有被可靠地检测到，这表明TRPV4通道形成了四通道元结构。

钙²⁺-敏感的IK和SK通道是Ca的潜在重要靶点²⁺通过TRPV4通道流入(20). 使用膜片钳技术的穿孔膜片钳结构测量新鲜隔离内皮细胞的膜电流(12)结果表明，在生理盐浓度和电压（−50 mV）下，GSK（10 nM）诱导的外向电流被IK阻滞剂charybdotoxin（ChTx）显著降低，并通过随后添加SK阻滞剂apamin进一步降低(图3A). 使用电压放大器协议（−100到+40 mV，200 ms），我们发现用GSK（10 nM）激活TRPV4通道将IK和SK通道电流密度增加到15.6±2.5和3.6±0.9 pA/pF（±SEM；n个=5个细胞），分别在0 mV时，与用3μM Ca透析细胞获得的最大IK和SK电流密度相似²⁺(图3B).

在单独的窗口中打开

图3

钙激活IK和SK通道并诱导EDHF依赖性血管舒张²⁺通过TRPV4通道流入。(A类)300 nM ChTx抑制GSK（10 nM）诱导的外向电流(n个=5个细胞）或300 nM阿帕明(n个=5个单元格）。(B类)GSK（10 nM）处理细胞或3μM Ca透析细胞的IK和SK通道电流密度²⁺(n个=8个单元格）。Conv.W.C.，常规全细胞配置；性能补丁，性能补丁配置。(C)顶迹线：谷胱甘肽（3 nM）引起的肠系膜加压动脉（80 mmHg）的血管扩张；中微量：100μM L-NNA+10μM吲哚美辛（吲哚美星；n个=5），或1μM帕罗西林(n个=3）GSK诱导的扩张；底部痕迹：L-NNA和30μM CPA的影响(n个=5）对GSK（10nM）诱导的扩张；条形图（左）：TRPV4拮抗剂HC无作用（1μM；n个=4）和RuR（5μM；n个=4）和TRPV4敲除(n个=3）IK和SK激动剂NS309（1μM）诱导的舒张作用；条形图（右）：CPA+L-NNA效应的量化(n个=5），L-NNA+印度(n个=5），帕罗西林(n个=3），内皮清除(n个=5），卢比(n个=5），HC(n个=5）和TRPV4淘汰赛(n个=4）GSK（10 nM）诱导的扩张。(D类)在存在或不存在200 nM ChTx的情况下，对GSK（3、10、30 nM）的血管舒张反应(n个=7），或ChTx+300 nM apamin（Apa）。相对于初始色调[26±1%（SEM），测定对膨胀的影响[（C）和（D）中的条形图]，n个=10]，定义为相对于外部Ca的直径，动脉直径相对于压力（80 mmHg）的下降百分比²⁺-自由溶液。误差条（B至D）、SEM。

我们的成像数据表明，GSK（≤10 nM）激活了每个细胞少量的通道[平均活性，用10 nM GSK每个细胞2.8±0.4（SEM）火花；n个=五个字段中的15个单元格]。为了估计每个细胞的TRPV4通道数，我们测量了全细胞K⁺在最大限度减少Ca的条件下，+100 mV下通过TRPV4通道的电流²⁺通过TRPV4进入(12). 在这些条件下，10 nM GSK时TRPV4电流为63±27 pA，100 nM GSK时为1228±242 pA（±SEM；n个=每个5个单元；图S4)，分别对应于每个细胞8个和152个通道激活的电流。

虽然通过3到10 nM GSK激活TRPV4，但在EC中仅打开了少数TRPV4通道(图S5和电影S5)，它使平滑肌膜电位超极化约10 mV(图S6)并导致加压动脉的最大内皮依赖性舒张(图3C) (12). GSK诱导的扩张被RuR和HC阻断，并且在TRPV4的动脉中不存在^−/−老鼠(图3C)，不影响对直接IK和SK通道激动剂NS309的扩张反应的条件(图3C)；它们也通过去除内皮而被消除，并且不受平滑肌钙抑制的影响²⁺-敏感K⁺带paxiline的（BK）通道(图3C). 值得注意的是，10 nM GSK诱导的TRPV4介导的扩张不受NOS和COX分别用硝基-L-精氨酸（L-NNA）和吲哚美辛抑制的影响(图3C). 使用ChTx阻断IK通道，消除了对3nM GSK的扩张反应，并大大减少了对10nM GSK的扩张反应(图3D). 在ChTx存在下用apamin治疗完全阻止了对10和30nM GSK的扩张(图3D)表明在这些较高的GSK浓度下，TRPV4通道的更大激活导致通过SK通道的信号增加。因此，局部Ca²⁺通过TRPV4通道的流入通过IK和SK通道而不是通过eNOS或COX起作用，证明了TRPV4激活与内皮介导的血管扩张的EDHF途径之间的特定联系。

乙酰胆碱或卡巴胆碱（CCh）激活毒蕈碱受体通过NO和EDHF机制诱导血管舒张(1–6,8,9). ACh诱导的扩张在TRPV4的肠系膜大动脉中的NO-依赖性成分适度减少^−/−小鼠，而EDHF介导的舒张功能则显著降低(3–5). 因此，一氧化氮介导的对毒蕈碱受体激活的舒张反应可能主要由IP驱动₃R介导的全球Ca增加²⁺和钙²⁺脉冲星，而EDHF成分可能反映Ca局部增加的作用²⁺通过少量TRPV4通道流入。全球Ca²⁺和钙²⁺脉冲星通过毒蕈碱受体刺激而增加，通过阻断PLC或SERCA而消除(图4A) (10). 在没有IP的情况下，仅ACh（5μM）就增加了基础火花活动₃R介导的钙²⁺释放和TRPV4激动剂[2.3±0.3（SEM）-折叠，n个=4条动脉]，表明毒蕈碱信号通路可以增加Ca²⁺通过TRPV4通道流入。在亚最大浓度的GSK（3 nM）存在下，ACh（5μM）使TRPV4火花活性增加2.9±0.4倍（SEM）–(n个=5），TRPV4拮抗剂HC抑制的作用(图4B). CCh对血管内压（80 mmHg）收缩的动脉的内皮依赖性扩张依赖于NO（34%）和EDHF（66%）(图4C). 毒蕈碱受体刺激诱导TRPV4火花的实验表明，该途径应引起血管舒张。事实上，HC对TRPV4的抑制使毒蕈碱受体诱导的EDHF扩张减少了76%(图4C)表明这些扩张的EDHF成分在很大程度上反映了TRPV4火花介导的IK和/或SK通道激活。

在单独的窗口中打开

图4

毒蕈碱受体激活对总钙的影响²⁺和TRPV4火花。（A）)全球Ca²⁺，显示为用CCh（10μM）处理的轮廓完整细胞的分数荧光，有和没有CPA（30μM）。(B类)GSK（3 nM）–在存在或不存在5μM ACh（左）和1μM HC（右）的情况下诱导火花；n个= 5). (C)200 nM ChTx+300 nM apamin（Apa；n个=5），100μM L-NNA(n个=6），L-NNA+HC(n个=5）和ChTx+Apa+L-NNA(n个=4）对毒蕈碱激动剂CCh（1μ。误差条（B和C）、SEM。除非用括号表示（学生的t吨测试），P（P）-这些值用于与控制进行比较（单向方差分析）。

我们的结果表明，少量活性TRPV4通道（每个细胞约三到八个）介导局部Ca²⁺激活IK和SK通道（主要是IK）以导致阻力动脉最大扩张的信号。我们认为集群中TRPV4通道的协同激活利用了大量的Ca²⁺通过单个TRPV4通道流入以产生更大量的Ca²⁺信号(图S1)高钙进一步促进了²⁺钙调素赋予IK和SK通道的敏感性(20). IK和SK通道激活引起的电流可能通过肌内皮缝隙连接传播到周围平滑肌，导致平滑肌细胞超极化和血管舒张(8,9). IK通道局限于内皮投射，其中部分（39%）TRPV4火花出现，肌内皮缝隙连接集中(10,21,22)，这种安排可能有助于局部钙激活IK通道²⁺信号。

然而，使用合成激动剂（例如3到10 nM GSK）或通过毒蕈碱受体刺激对TRPV4通道的低水平激活导致显著的血管扩张(P（P）< 0.0001; 配对双样本t检验），较高水平的活化（100 nM GSK）导致全球Ca快速增加²⁺内皮细胞过载和血管直径振荡(图S7和电影S6). 在这方面值得注意的是，GSK对TRPV4通道的系统激活会导致血压降低和全身循环衰竭(14). 总的来说，这些观察结果表明，少数EC TRPV4通道调节血管生理，并表明以血压降低和血管通透性增加（例如，感染性休克）为特征的病理学可能涉及EC TRPV通道的过度激活。

补充材料

致谢

脚注

参考文献和注释