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生物化学杂志。2012年2月3日；287(6): 3963–3975.
2011年11月23日在线发布。 doi（操作界面）：10.1074/jbc。M111.314765号
预防性维修识别码：项目经理3281727
PMID：22117079

钙蛋白酶介导的p53相关Parkin-like细胞质蛋白（PARC）处理通过促进p53亚细胞贩运影响人卵巢癌细胞的化疗敏感性*

迈克尔·G·吴,‡§ 开学,‡‖,1 刘嘉音,‖ 海蒂·麦克布莱德,§和本杰明·曾荫权‡§**，2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

背景：PARC在细胞质中隔离p53；p53定位/功能失调导致卵巢癌化疗耐药。

结果：顺铂促进钙蛋白酶介导的PARC下调、线粒体和核p53积聚以及化疗敏感但不耐药的OVCA细胞的凋亡。

结论：钙蛋白酶介导的PARC处理的失调促进了OVCA细胞的化疗耐药性。

意义：PARC下调是一种预防/逆转顺铂化疗耐药的新策略。

关键词：Akt、凋亡、钙蛋白酶、细胞内贩运、卵巢癌、p53、PARC、化疗耐受性、顺铂、线粒体

摘要

顺铂（CDDP）耐药是成功治疗人类卵巢癌（OVCA）的主要障碍，OVCA细胞的化疗耐药表型与Akt减毒p53介导的凋亡有关。p53的促凋亡功能涉及转录依赖性和非依赖性信号通路，p53的功能失调定位和/或失活有助于化疗耐药的发展。PARC是一种调节p53亚细胞定位和后续功能的细胞质蛋白。对PARC的分子调控机制知之甚少。虽然PARC含有推测的caspase-3切割位点，并且已知CDDP可诱导caspase和calpains的激活，并诱导抗凋亡蛋白的蛋白酶体降解，但CDDP在卵巢癌中是否以及如何调节PARC尚不清楚。在这里，我们提供证据表明CDDP促进钙蛋白酶介导的PARC下调、线粒体和核p53积聚以及化疗敏感但不耐药的OVCA细胞的凋亡。抑制Akt需要以p53依赖的方式使耐药细胞对CDDP敏感，PARC下调会增强这种效应。CDDP诱导的PARC下调可通过抑制钙蛋白酶而非半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶或26S蛋白酶体逆转。此外，在体外实验证实钙蛋白酶介导钙的能力2+-依赖性PARC下调。钙的作用2+在PARC中的下调被进一步证实为离子霉素诱导的卵巢癌化疗敏感性和化疗耐药细胞中的PARC下调。这里的数据表明PARC对p53亚细胞定位和凋亡的调节是卵巢癌细胞和卵巢癌细胞CDDP抵抗的一个促成因素2+/钙蛋白酶在PARC翻译后处理和化疗敏感性中的作用。

关键词：Akt、凋亡、钙蛋白酶、细胞内贩运、卵巢癌、p53、PARC、化疗耐受性、顺铂、线粒体

介绍

卵巢癌（OVCA）三是妇科癌症中最致命的。尽管顺铂（CDDP）及其衍生物是治疗OVCA的有效化疗药物，但CDDP耐药性仍是长期治疗成功的主要障碍。PI3K/Akt信号通路在人类OVCA中经常被激活/过度表达，是化疗耐药性的决定因素。Akt活性下调可使耐药OVCA细胞以p53依赖的方式对CDDP敏感。相反，Akt激活抑制线粒体p53的积累并减弱OVCA细胞中p53的磷酸化和核功能，从而对CDDP产生耐药性(1–4). p53的磷酸化（Ser-15）对于CDDP诱导的凋亡是必要的，尽管Akt调节p53磷酸化的机制尚不清楚。表达活化Akt的OVCA细胞的特征是p53含量增加，这表明Akt减弱了p53功能而不是其含量(5).

p53介导CDDP诱导的细胞凋亡(6)和-独立方式(7–9). 虽然p53功能因失活突变而丧失已被广泛证实(10)有证据表明，控制p53的细胞内定位在调节细胞凋亡和化疗敏感性方面也很重要(5,9).

p53相关的Parkin-like细胞质蛋白（PARC，Cul9）是一种调节p53亚细胞定位和功能的细胞质蛋白。PARC被描述为一种非典型的cullins蛋白和一种推测的E3泛素连接酶，其内源性底物和调节PARC的介质尚不清楚(11,12). PARC形成大小约为100万kDa的多蛋白复合物，其N末端与p53的C末端结合(11). PARC的抗凋亡作用在细胞质p53含量高且对药物治疗反应差的细胞模型中得到证实(11,13). 在这些模型中，大多数细胞质p53与PARC结合，这是通过免疫耗竭试验确定的(11). 这些细胞中PARC的下调促进核p53的积累、转录激活和凋亡。相反，PARC的过度表达阻止了核p53的积累和凋亡(11,13). PARC在调节线粒体p53积累和转录依赖性凋亡中的作用尚未得到研究。

钙蛋白酶是一个钙依赖性半胱氨酸蛋白酶家族，在细胞凋亡中被激活，在坏死中也表现突出。两种主要的亚型，即μ-钙蛋白酶（钙蛋白酶I）和m-钙蛋白酶（钙蛋白酶II），被微量和毫摩尔的钙激活2+分别为。它们在细胞凋亡中的重要性反映在钙蛋白酶底物的不断增加中，包括p53(14)，Bax，投标(15)凋亡诱导因子和几种细胞骨架蛋白(16). 虽然CDDP可以诱导钙蛋白酶激活，但钙蛋白酶是否在卵巢癌细胞PARC的调节中起作用尚不清楚。

在本研究中，我们首次证明了PARC对卵巢癌细胞中p53亚细胞定位和CDDP敏感性的控制，以及Akt可能参与这一调控。我们还提供了Ca的证据2+-CDDP诱导的细胞凋亡中激活的钙蛋白酶介导的PARC处理，并且CDDP抗性与PARC稳定和上调有关。

实验程序

试剂

CDDP、二甲基亚砜、Hoechst 33258、苯基甲基磺酰氟（PMSF）、原钒酸钠（Na三VO（旁白）4)，抑肽酶，EGTA，5′-氮杂-2′-脱氧胞苷，氯化钙脱水（CaCl2-2小时2O） 从西格玛公司购买了乳酸菌素和钙蛋白酶1以及离子霉素钙盐。兔多克隆α-fodrin、p-p53（Ser-15）、p-Akt（Ser-473）、p-GSK-3β（Ser-9）和PARP抗体来自Cell Signaling Technology，Inc.（马萨诸塞州贝弗利）。小鼠单克隆GAPDH、活性和前caspase-3来自Abcam（马萨诸塞州剑桥）。小鼠单克隆p53（Western blot，DO-1；immunofluorescence，pAb1801）、山羊多克隆钙蛋白酶1抗体和过氧化物酶结合的驴抗羊免疫球蛋白从圣克鲁斯生物科技公司（加州圣克鲁斯）获得。兔多克隆PARC从Bethyl Laboratories Inc.（Montgomery，TX）获得。过氧化物酶结合的山羊抗小鼠和山羊抗兔免疫球蛋白购自Bio-Rad。钙肽和环氧化合物购自EMD Chemicals（Gibbstown，NJ）。API-2、Z-DEVD-FMK和Z-VAD-FMK来自Tocris Bioscience（密苏里州埃利斯维尔）。

细胞系与细胞培养

CDDP敏感OV2008(17)和A2780(18,19)和CDDP抗性C13*(20)，OVCA420型(21)，OVCA433型(22,23)，还有嘿(24)人卵巢癌细胞系来源于卵巢浆液性囊腺癌。C13*细胞系是OV2008的等基因耐药对应物，通过慢性接触不断增加的CDDP浓度选择。IOSE397国际证交所(25)是一种通过转染SV40大T抗原而永生化的人卵巢表面上皮细胞系。如前所述，所有细胞系均为p53野生型(9,21,26–28)以及来自Rakesh Goel博士和Barbara Vanderhyden（加拿大安大略省渥太华市渥太华地区癌症中心）的礼物。

细胞保存在RPMI 1640培养基（化疗敏感性OV2008和化疗耐药C13*和HEY）和DMEM/F-12培养基（化学敏感性A2780s和化疗耐药OVCA420和OVCA433）中，永生化卵巢表面上皮细胞系IOSE397在MCDB/M199中培养。RPMI 1640和DMEM/F-12培养基含有热灭活的FBS（10%）、链霉素（50000μg/升）、青霉素（50000单位/升）和真菌酮（625μg/L；Invitrogen）(29). MCDB/M199培养基（1:1）中含有热灭活FBS（15%）。除非另有说明，否则将细胞以40%的汇合度放置在60-mm培养皿中，并在37°C和5%CO的条件下培养2，95%O2.

细胞凋亡的评估

使用Hoechst 33258核染色从形态学上鉴定凋亡细胞(1,30,31). 每个治疗组在随机选择的领域中至少评估300个细胞，研究人员对样本组不进行观察，以避免实验偏差。Western blot检测PARP从全长116-kDa肽裂解为其裂解形式（89-和24-kDa多肽），进一步证实了细胞凋亡(32).

蛋白质提取和Western Blot检测

如前所述进行蛋白质提取和Western blot分析(29). 在4°C下将膜在一级抗体（PARC（1:10000）、p53（1:10000，然后用辣根过氧化物酶结合二级抗体孵育（1:1000 RT，1 h；1:10000用于GAPDH和p53）。用密度计评估信号强度（增强化学发光试剂盒（Amersham Biosciences））（Scion Image软件，4.02版；Scion Corp.，Frederick，MD）。

逆转录酶聚合酶链式反应

如前所述进行逆转录聚合酶链式反应(5). PCR引物（Invitrogen）如下：PARC（正义5′-TGTACCCTTTGCCGTACCTC-3′和反义5′-AGACGAGCTTGGTTCAT-3′）；GAPDH（正义5′-ACAGTCAGCCATCTTCTT-3′和反义5′-GACAGCTCCCGTTCTCAG-3′）。激活后（15分钟；95°C）使用HotStarTaq聚合酶（Qiagen）进行PCR，如下：变性，94°C下30 s；退火（60°C下为30）；延伸，72°C下1分钟；PARC和GAPDH分别为34和21个循环。

荧光显微镜

将细胞接种在poly上-d日-在CDDP处理之前，赖氨酸涂层（0.05%w/v；Sigma）8孔玻璃培养载玻片（BD Biosciences）并在生长介质中培养（48小时）。为了进行免疫染色，细胞被固定在多聚甲醛中（4%，1h，RT），在PBS中清洗，并用1%牛血清和1%山羊血清封闭。使用抗p53小鼠单克隆抗体（1:50；Santa Cruz Biotechnology）和Alexa Fluor 488山羊抗小鼠二级抗体（1:500；Invitrogen）检测p53。使用抗TOM20兔多克隆抗体（1:200；Santa Cruz Biotechnology）和德克萨斯红山羊抗兔二级抗体（1:500；Invitrogen）检测TOM20。使用合适的氩激光（DAPI，405 nm；Alexa Fluor 488；488 nm；Texas Red，543 nm）在Olympus IX81倒置显微镜上获得共焦图像（×100物镜NA1.4）。

p53亚细胞定位的测定

将培养玻片上的细胞与抗p53、TOM20（线粒体标记物）和DAPI（核染色）抗体孵育。每个治疗组至少分析400个细胞，以确定p53信号与TOM20和/或DAPI的共同定位。

免疫沉淀

细胞裂解物在Pierce免疫沉淀细胞裂解缓冲液（伊利诺伊州Rockford的Thermo Fisher Scientific Inc.）中孵育（4℃，1 h），该缓冲液补充有1×蛋白酶抑制剂混合物I（Sigma）和1×PhoSTOP磷酸酶抑制剂（Roche Applied Science），并离心（14000×克，10分钟，4°C）。将1 mg上清液蛋白（200μl）与涂有兔多克隆抗PARC抗体（2μg/200μl；1 h，RT）的蛋白A Dynabeads（Invitrogen）孵育并免疫沉淀（4℃，2 h）。将珠粒制成丸，重新悬浮在Laemmli样品缓冲液（2×；40μl；Bio-Rad）中，煮沸（10分钟），并加载到9%SDS-PAGE上。蛋白质转移到硝化纤维后，通过Western blotting检测PARC和p53。

RNA干扰

根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将PARC（Santa Cruz Biotechnology）、p53 siRNA（Dharmacon）和扰乱序列控制（Dharmcon）转染细胞（48小时）。

腺病毒感染

用HA标记的“三A”（K179A、T308A和S473A）显性阴性Akt（DN-Akt）或LacZ cDNA对照感染细胞(9). X-半乳糖染色法测定，在40次多重感染时的感染效率>90%。通过针对HA表位的Western blot证实DN-Akt表达。

PARC过表达质粒的构建

质粒pcDNA3-HA2-PARC和PCR引物分别来自Addgene（Cambridge，MA）和Invitrogen。克隆引物如下：PARC正向5′-AAGGTACATGGTGGGGGAAC-3′和PARC反向5′-GGTCTAGGCTCCA-3′。利用上述引物从pcDNA3-HA2-PARC质粒中扩增出PARC的人类编码序列。通过KpnⅠ和XbaⅠ位点将PARC的人类编码序列克隆到pEF6/V5-His-TOPO/LacZ表达载体（Invitrogen）中，构建PARC-V5-His融合。

瞬时转染

用pEF6衍生载体（0–1μg；1 ml无血清培养基）进行转染时，使用了Lipofectamine和PLUS试剂（Invitrogen）。去除培养基（转染后24小时），根据需要采集或处理细胞。

纯化钙蛋白酶体外降解PARC蛋白

如前所述，将纯化的钙蛋白酶（μ-钙蛋白酶；人血浆，1单位/6.25μg蛋白质）与全细胞裂解物（30μg蛋白质；1小时，30°C）孵育(33). 通过煮沸（10分钟）和/或加入EGTA（10分钟）使钙蛋白酶失活米)和氯化钙2（0–1米米). 将样品煮沸（10分钟）并离心，上清液蛋白在9%SDS-PAGE上溶解。

体外Caspase-3治疗

在Pipes分析缓冲液（Pipes（20 m）中培养全细胞裂解物（50μg）（30°C，2 h米)、氯化钠（100 m米)，二硫苏糖醇（滴滴涕，10 m米)，乙二胺四乙酸（1米米)，Chaps（0.1%，w/v），蔗糖（10%，w/v），pH 7.2），含有重组活性半胱天冬酶-3（0-15μg/ml）。样品在Laemmli样品缓冲液中煮沸（10分钟）并离心，上清液蛋白在9%SDS-PAGE上进行解析。

统计分析

结果显示为至少三个独立实验的平均值±S.E。数据通过单因素、双因素和三因素方差分析进行分析，随后通过事后检验（PRISM软件版本3.0，GraphPad，圣地亚哥）。统计显著性推断为第页< 0.05.

结果

CDDP诱导化疗敏感而非化疗耐药OVCA细胞中p53线粒体和核蓄积，由PARC调节

CDDP诱导的OVCA细胞凋亡是p53依赖性的，p53在细胞核和线粒体的功能丧失是化疗耐药性的决定因素(5,9). 为了确定CDDP对化疗敏感（OV2008）和化疗耐药（C13*）OVCA细胞中p53亚细胞定位的影响，用CDDP处理细胞，并用免疫荧光/共聚焦显微镜评估p53亚胞定位(图1一个). TOM20和DAPI分别作为线粒体和核标记物。CDDP处理的化疗敏感性细胞中，亚细胞p53以时间依赖性的方式存在差异性积累(即细胞质→ 线粒体→ 核能）。然而，耐药细胞在所有时间点仅显示细胞质p53(图1一个). 单向方差分析表明，在OV2008细胞中检测的所有亚细胞组分都存在显著的时间效应(第页<0.01），但不包括C13*细胞。OV2008细胞中PARC的过度表达减弱了CDDP诱导的线粒体和细胞核p53的积累，并增加了6小时时细胞质p53的保留，表明PARC参与了p53亚细胞定位的调节(图1B类; 双向方差分析，PEF6-PARC(第页<0.001），分数(第页<0.001），以及这两个因素之间的相互作用(第页< 0.001)).

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CDDP通过PARC的调节，在化疗敏感但非化疗耐药的OVCA细胞中诱导p53线粒体和核蓄积。 一个用CDDP（10μ米; DMSO作为车辆控制）。箭头通过免疫荧光/共焦显微镜显示跨场的准确位置，并用于强调p53与TOM20和DAPI、线粒体和核标记物的共同定位是否存在。共焦图像的量化显示了细胞质中p53聚集的细胞数量(细胞)，线粒体(水户)线粒体和细胞核(努克)只有细胞核。在每个复制的每个时间点至少统计200个细胞。B类，PARC在OV2008细胞中过度表达（PEF6-PARC；PEF6-LacZ作为对照；0.5μg，24 h），并用CDDP处理（10μg米，6小时）。亚细胞p53的积累情况如上所述。结果表示为平均值±S.E(n个＝3个重复实验）；***，第页< 0.001.

抑制Akt是以p53依赖性方式使化疗耐药OVCA细胞对CDDP敏感的必要条件，PARC下调和PARC过度表达可增强这种效应，从而减弱CDDP诱导的化疗敏感OVCA凋亡

为了评估Akt在PARC抗凋亡作用中的调节作用，我们首先确定在CDDP治疗前PARC下调化疗敏感性（OV2008）和化疗耐药（C13*）OVCA细胞后，PARC在CDDP敏感性调节中的作用。正如预期的那样，CDDP单独诱导OV2008细胞凋亡，但不诱导C13*细胞凋亡。PARC下调增强CDDP诱导的化疗敏感性OVCA细胞凋亡(图2一个; 双向方差分析，OV2008，PARC siRNA(第页<0.001），CDDP(第页<0.001）和PARC siRNA×CDDP(第页< 0.01); C13*、PARC siRNA CDDP效应和PARC siRNA×CDDP(第页>0.05））。

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抑制Akt需要以p53依赖性的方式使耐药OVCA细胞对CDDP敏感，PARC下调会增强这种效应。PARC过度表达可减弱CDDP诱导的化疗敏感性OVCA细胞凋亡。在存在或不存在CDDP（10μ米; 24小时）。一个，PARC siRNA（加扰序列(S.序列。)作为对照；100牛顿米，48小时；**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001 (与加扰序列）。B类，DN-Akt（LacZ作为对照(CTL公司); 48 h）有无PARC siRNA（加扰序列控制，100 n米，48小时；***，第页< 0.001 (与加扰序列）；++,第页< 0.01;+++,第页<0.001(与各自的DN-Akt（感染的多重性(内政部), 0));#,第页< 0.05;##,第页< 0.01;###,第页< 0.001 (与各自的CDDP CTL））。C类，API-2（预处理1小时）（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01 (与无API-2））。D类，PARC siRNA（加扰序列作为对照；100 n米，48小时）与p53 siRNA（100 n米，48小时），然后是API-2（25μ米; CDDP前1小时预处理）（**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001 (与无PARC siRNA和p53 siRNA）；++,第页< 0.01;+++,第页< 0.001 (与PARC siRNA）；##,第页< 0.01;###,第页< 0.001 (与相应的CDDP控制）。E类，PARC在PARC阴性化疗敏感性（A2780s）OVCA细胞中过度表达（PEF6-PARC；PEF6-LacZ作为对照；1μg，24 h），并用CDDP（10μg）处理米; 24小时）（**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001). 结果表示为平均值±S.E(n个=3–5个重复实验）。

因为Akt减弱CDDP诱导的线粒体p53积累和凋亡，并赋予化疗敏感性OVCA细胞耐药性(5)然后，我们检查了卵巢癌细胞中的p53功能和CDDP敏感性是否依赖于PARC和Akt介导的调节。DN-Akt表达下调Akt对CDDP诱导的OV2008细胞凋亡无影响，与PARC沉默无关。相反，下调Akt活性显著诱导C13*细胞凋亡，PARC下调可增强这种效应(图2B类; 三向ANOVA-OV2008，PARC siRNA(第页<0.01），DN-Akt(第页<0.01），CDDP(第页<0.001），这些因素之间没有交互作用；C13*，PARC siRNA(第页<0.001），DN-Akt(第页<0.001），CDDP(第页<0.01），PARC siRNA和DN-Akt相互作用(第页< 0.05)). 为了进一步研究Akt的作用，使用了第二种抑制剂。Akt抑制剂API-2预处理C13*细胞(34)，减弱Akt及其下游靶点GSK-3β的活化和磷酸化，并诱导p53磷酸化（Ser-15）和凋亡，而不考虑CDDP的存在(图2C类; 双向ANOVA-API-2剂量反应(第页< 0.01)).

然后，我们研究了PARC在OVCA细胞中Akt介导的CDDP抵抗中的作用，并研究PARC下调导致CDDP敏感性增强是否与p53相关。API-2下调Akt活性可促进CDDP诱导的耐药细胞（C13*）凋亡，PARC下调进一步增强了这种反应(图2D类). 这些反应依赖于p53，并通过p53沉默而减弱(图2D类; 三元方差分析-API-2（25μ米)，CDDP(第页<0.01），PARC siRNA(第页<0.001），p53 siRNA(第页<0.001），PARC siRNA×p53 siRNA相互作用(第页< 0.05)). 综上所述，这些发现表明，一旦Akt活性被抑制，PARC下调可以提高p53依赖性CDDP敏感性。

PARC阴性A2780s细胞（化学敏感性）中PARC过度表达可减少CDDP诱导的凋亡，但不影响p53的含量(图2E类). 双向方差分析表明PARC表达有显著影响(第页<0.001）和CDDP(第页<0.001）以及这两个因素之间的相互作用(第页< 0.01). 由该表达载体产生的融合PARC蛋白与p53相互作用（数据未显示）。

CDDP对化疗耐受性OVCA细胞中PARC和p53相互作用无影响

基础PARC和p53含量丰富且在C13*细胞中稳定表达，可以共同免疫沉淀，这一现象不受CDDP治疗的影响。CDDP对PARC和p53含量没有影响，也没有像预期的那样诱导细胞凋亡(图3).

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CDDP对化疗耐药OVCA细胞中PARC和p53的相互作用没有影响。蛋白A Dynabeads与PARC抗体（Bethyl，A300-096A；2μg/mg裂解液；1 h）孵育，然后与C13*全细胞裂解液孵育1 h（1000μg；裂解缓冲液对照(LB（磅）))从处理过的CDDP中获得（0–10μ米)不同持续时间的单元格。共同免疫沉淀产生的PARC下拉和p53含量不受时间或CDDP治疗的影响(3–10车道). 还显示了控件(CTL公司)抗体IgG的潜在非特异性条带(车道1和2)和裂解缓冲液(车道1和11). 为了证实CDDP治疗的有效性，对上述样本的PARC、p53和GAPDH含量以及凋亡计数进行了检测。结果表示为平均值±S.E(n个=3个重复实验）。IP（IP）免疫沉淀；工作分解结构，Western blot。

CDDP对化疗敏感和耐药OVCA细胞中PARC、p53、p-p53（Ser-15）和Akt的影响

OVCA的耐化学性与Akt的高表达和活性以及p53磷酸化和功能的降低有关(5,9). 因为PARC调节p53定位和核功能(11,35)，我们比较了CDDP对化疗敏感和化疗耐药OVCA细胞中PARC、p53和Akt的影响。CDDP降低PARC含量和Akt活性，增加caspase和calpain活性以及p53和p-p53（Ser-15）含量，诱导OV2008细胞凋亡，但不诱导C13*细胞凋亡。与OV2008细胞相比，C13*细胞中的基础PARC和p53含量较高(图4一个). 双向方差分析表明CDDP治疗有显著效果(第页<0.001）和细胞系(第页<0.001）和两个因素之间的相互作用(第页< 0.001). CDDP诱导的OV2008细胞中p53（Ser-15）磷酸化是一个早期事件，发生在检测到总p53含量增加之前(图4B类; 双向方差分析(第页<0.001），时间(第页<0.001）和CDDP×时间交互(第页< 0.001)). CDDP降低了化疗敏感性（IOSE397和OV2008）细胞中PARC的含量并诱导凋亡，但对化疗耐药（C13*、HEY、OV420和OV433）细胞没有影响，并且与化疗敏感性细胞相比，化疗耐药细胞中的基础PARC含量通常更高(图4C类; 双向方差分析，细胞系(第页<0.001），CDDP(第页<0.001）和细胞系×CDDP相互作用(第页< 0.001)). CDDP诱导的化疗敏感性细胞PARC下调与PARC mRNA含量的变化无关(图4D类)而是caspase和calpain激活和凋亡(图4E类; 双向方差分析，时间(第页<0.001），CDDP(第页<0.001），以及时间×CDDP相互作用(第页<0.001））。

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CDDP下调PARC和Akt活性，增加化疗敏感但不耐药OVCA细胞中p-p53（Ser-15）的含量和凋亡。 一个CDDP治疗（24小时）增加了化疗敏感性（OV2008）和耐药（C13*）细胞中的p53含量，仅在敏感细胞中增加了p-p53（Ser-15）含量、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和钙蛋白酶激活（分别以PARP和α-酪蛋白裂解表示）。CDDP仅降低敏感细胞中PARC含量和Akt活性（以p-Akt（Ser-473）和p-GSK-3β（Ser-9）表示）。只有CDDP处理的OV2008细胞（***，第页< 0.001 (与无CDDP））。B类，CDDP以时间依赖性的方式降低了OV2008细胞中PARC含量，增加了p-p53（Ser-15）和总p53含量以及凋亡（***，第页< 0.001 (与控制(CTL公司))).C类CDDP诱导化疗敏感（IOSE397和OV2008）但不耐化疗（C13*、HEY、OVCA420和OVCA433）OVCA细胞中PARC下调和凋亡。用CDDP（10μ米24小时；DMSO对照组），并评估PARC含量和细胞凋亡。与耐药细胞相比，化疗敏感细胞中的基础PARC含量较低，但OVCA420细胞除外，其中PARC和GAPDH（负荷控制）含量始终较低（***，第页< 0.001).D类，CDDP（10μ米; DMSO控制）不影响化疗敏感性（OV2008）OVCA细胞中PARC mRNA的含量。E类，CDDP（10μ米)PARC含量降低，钙蛋白酶和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3活性增加（以α-fodrin和PARP裂解为代表），细胞凋亡呈时间依赖性。(**,第页< 0.01; ***,第页< 0.001 (与无CDDP）；++,第页< 0.01;+++,第页< 0.001 (与时间=0））。结果表示为平均值±S.E(n个=3-4个重复实验）。

CDDP诱导，钙蛋白酶介导的PARC下调

基于钙蛋白酶参与CDDP诱导的细胞凋亡的报道(15,36)，然后我们检查PARC是否是钙蛋白酶的底物。体外实验证实PARC是钙蛋白酶底物(图5一个)钙蛋白酶介导的PARC下调是钙2+-从属的(图5B类). OV2008全细胞裂解物与钙蛋白酶和钙螯合剂EGTA同时孵育可防止PARC和α-fodrin（已知钙蛋白酶底物）的降解(37–39). 钙蛋白酶失活（通过煮沸）也可以防止钙蛋白酶诱导的PARC和α-fodrin损失(图5一个). 此外，钙蛋白酶在钙中同时降解PARC和α-fodrin2+-PARP含量不变时，依赖方式与caspase活性无关(图5B类). 这些结果表明钙蛋白酶是PARC处理的主要介质。

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CDDP诱导的PARC处理和化疗敏感性部分由Ca介导2+-钙蛋白酶的依赖性激活。 一个，OV2008全细胞裂解物(WCL公司)（30μg）与人血浆中纯化的钙蛋白酶I孵育（1 h；30°C）。通过煮沸、EGTA处理和不含CaCl抑制钙蛋白酶活性2在孵化过程中。当CaCl激活天然钙蛋白酶时，PARC发生裂解2(第8车道). α-Fodrin裂解表明钙蛋白酶活性。B类，钙蛋白酶活性导致的PARC处理为Ca2+-依赖。OV2008细胞裂解物如上所述与增加的CaCl一起培养2浓度。钙蛋白酶介导的PARC处理在250μ米氯化钙2α-Fodrin解理发生在低CaCl2浓度，并用作钙蛋白酶活性的指标。C类，用细胞渗透性钙蛋白酶抑制剂calpeptin（1 h；DMSO对照）预处理的化疗敏感性OVCA细胞（OV2008）减弱了CDDP（24 h）（*，第页< 0.05; ***,第页< 0.001 (与无钙肽）；+++,第页< 0.001 (与无CDDP））。CTL公司，控制。D类在化疗敏感（OV2008）和化疗耐药（C13*、HEY和OVCA420）OVCA细胞中，离子霉素诱导PARC下调，所有细胞类型的凋亡增加。在化疗敏感性IOSE397和化疗耐药OVCA433细胞（*，第页< 0.05; ***,第页< 0.001). 结果表示为平均值±S.E(n个=3个重复实验）。

为了确定钙蛋白酶系统对CDDP诱导的PARC处理的影响，先用细胞渗透性钙蛋白酶抑制剂钙肽对OV2008细胞进行预处理，然后再进行CDDP处理。钙肽预处理可阻止CDDP诱导的PARC下调、α-酪蛋白裂解和凋亡。在25μ米钙肽，高浓度时细胞毒性作用明显(图5C类). 双向方差分析表明钙肽有显著作用(第页<0.001）和CDDP(第页<0.001）和calpeptin×CDDP相互作用(第页< 0.001).

钙蛋白酶激活为Ca2+-依赖性，CDDP增加细胞内钙2+化疗敏感性OV2008细胞中的水平，但不包括其耐药变体（C13*）(40). 因为钙蛋白酶在化疗敏感和耐药OVCA细胞中的含量相同(图4一个)，我们检查了离子粘蛋白是否诱导钙2+化疗敏感和耐药的OVCA细胞内流将导致PARC下调和凋亡。如所示图5D类，离子霉素降低了化疗敏感（OV2008）和化疗耐药（C13*、HEY和OVCA420）OVCA细胞中PARC的含量，并诱导了所有检测细胞类型的凋亡。双向方差分析表明离子霉素有显著作用(第页<0.001）和细胞系(第页<0.001）和两个因素之间的相互作用(第页< 0.001). 在化疗敏感性IOSE397和化疗耐药OVCA433 OVCA细胞中，离子霉素没有诱导PARC下调，这可能反映了钙的替代机制2+这些细胞中的调节。这些数据暗示Ca2+/钙蛋白酶在CDDP诱导的PARC处理和化疗敏感性中的作用。

此外，CDDP诱导的PARC下调分别未被caspase-3特异性抑制剂和泛酶抑制剂Z-DEVD-FMK和Z-VAD-FMK阻止(图6,一个和B类; 双向方差分析(第页<0.001），Z-VAD-FMK(第页<0.001），CDDP(第页<0.001），以及每个caspase抑制剂与CDDP之间的相互作用(第页<0.001）），也不通过两种26S蛋白酶体的特异性抑制剂乳酸菌素和环氧霉素(图6C类; 双向方差分析；环氧缩宫素(第页<0.01），CDDP(第页<0.01），相互作用(第页< 0.001); 乳杆菌素(第页<0.001），CDDP(第页<0.001），相互作用(第页< 0.001)). 此外，在体外实验表明caspase-3不是PARC处理的主要介质(图6D类).

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半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和泛素蛋白酶体途径不是CDDP诱导的PARC处理的主要介质。CDDP诱导的PARC下调与半胱氨酸蛋白酶无关。用caspase-3特异性抑制剂Z-DEVD-FMK预处理OV2008细胞2小时(一个)和泛酶抑制剂Z-VAD-FMK(B类)然后是CDDP（24小时；DMSO作为对照）。两种药物的预处理均以浓度依赖的方式阻止了CDDP诱导的caspase活性（PARP裂解表明）和凋亡（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001 (与无CDDP）；+++,第页< 0.001 (与无半胱氨酸蛋白酶抑制剂）；一个和B类)，但与对照组相比未能抑制CDDP诱导的PARC下调(CTL公司). 结果表示为平均值±S.E(n个=6个重复实验）。C类CDDP诱导的PARC下调并非由泛素-蛋白酶体途径介导。用蛋白酶体抑制剂epoxomicin预处理的OV2008细胞（30分钟；DMSO作为对照）和lactacystin（30分钟；DMSO作为对照）没有阻止CDDP诱导的（24小时）PARC下调，但减弱了细胞凋亡（**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001 (与无CDDP）；+++,第页< 0.001 (与无蛋白酶体抑制剂）。D类，纯化的活性caspase-3与OV2008全细胞裂解物孵育(WCL公司; 2 h，30°C）导致5μg/ml的PARP完全裂解，即使在测试的最高caspase-3浓度（15μg/ml）下，PARC含量也没有显著影响；第页>0.05之间。结果表示为平均值±S.E(n个=3个重复实验；C类和D类).

讨论

将p53限制在细胞质中会降低癌细胞对放疗和化疗引起的基因毒性应激的反应性(9,11,41). 因此，了解p53亚细胞定位调控的分子机制非常重要。在这项研究中，我们首次表明PARC调节p53亚细胞定位和CDDP敏感性，这两种反应依赖于细胞的Akt状态(5,9). 我们还首次证明了Ca对PARC的翻译后处理2+-依赖性半胱氨酸蛋白酶钙蛋白酶。

p53转运到线粒体是p53依赖性凋亡的早期事件(8,9,42)并被认为会启动和放大较慢的转录反应。由于p53在凋亡中的多效性作用，PARC对p53的细胞质隔离可能是最基本的调控形式。事实上，PARC含量在化疗敏感和耐药的OVCA细胞中都存在，耐药细胞中的PARC含量更高。CDDP降低了敏感但不耐药细胞中的PARC含量，这表明较高水平的PARC可能在赋予CDDP耐药性方面很重要。PARC-null、p53 WT、化学敏感性OVCA细胞系（A2780s）的鉴定进一步支持了这一观点，而PARC在化学抗性A2780cp对应物中高度表达（数据未显示）。A2780s细胞中的PARC无效表型依赖于DNA甲基化，因为5-氮杂-2′-脱氧胞苷诱导PARC表达（数据未显示）。据我们所知，这是第一次证明PARC含量发生改变的生理条件。

卵巢癌细胞化疗耐药性的一个主要决定因素是PI3K/Akt通路的激活。尽管没有修改或变异阿克特据报道，人类体内存在基因，阿克特基因扩增在高级侵袭性卵巢肿瘤中很常见，与各种OVCA细胞系中蛋白质含量升高和激酶活性升高相对应。我们之前已经证明，CDDP在化学敏感但不耐药的OVCA细胞中以胱天蛋白酶-3依赖的方式促进Akt切割(1).

Akt激活减弱CDDP诱导的p53磷酸化、定位和凋亡(5,9). 在此，我们首次证明CDDP降低了Akt活性，这与OV2008细胞中p53磷酸化（Ser-15）和凋亡的增加相对应，但在耐药的C13*细胞中没有。Akt特异性抑制剂API-2对Akt活性的抑制增加了耐药C13*细胞中p-p53（Ser-15）的含量和凋亡。这些结果与有关Akt激活是OVCA化疗耐药性的重要决定因素的报道一致(1,9,34,43).

在化疗耐药的OVCA细胞中，CDDP未能诱导p53介导的凋亡，这部分归因于高Akt活性导致p53不能积聚到线粒体和/或细胞核(5,9). 我们证明PARC和p53在卵巢癌细胞中相互作用，并且这种相互作用不受化疗耐药卵巢癌细胞CDDP的影响。在涉及PARC/p53相互作用的未来研究中使用耐化学药物的C13*细胞具有吸引力，因为它不需要异位表达突变的p53来避免WT-p53依赖性凋亡，因为C13*的细胞表达高基础WT-p53和PARC水平，并且对CDDP有抗药性。相反，对化疗敏感性OV2008细胞中PARC/p53相互作用的研究表明，由于基础p53含量维持在较低水平，CDDP需要诱导p53上调，继而导致PARC下调、p53易位和凋亡，因此出现了各种并发症。调控PARC/p53相互作用的细胞机制尚不清楚，可能涉及对PARC、p53或两者的修饰。可能的修饰包括位点特异性磷酸化和单泛素化，因为两者都被报道影响p53易位(9,44). Akt在这些过程中的作用也需要进一步调查。

PARC下调增强CDDP诱导的化疗敏感但不耐药OVCA细胞凋亡。有趣的是，抑制Akt需要以p53依赖的方式使耐药细胞对CDDP敏感，PARC下调会增强这种效应。虽然p53可以自由移动到不同的亚细胞隔室，但我们认为耐药细胞中Akt活性升高会抑制p53的磷酸化和功能(5). p53诱导的凋亡需要Ser-15和/或Ser-20上p53的磷酸化(45). CDDP诱导的OVCA细胞中Ser-15磷酸化似乎是凋亡的关键残基，因为该位点的突变减弱了CDDP诱导凋亡(5). Ser-15磷酸化影响p53凋亡能力的机制尚不清楚；然而，证据表明它不是由p53依赖性转录激活介导的(5). p53磷酸化可能影响PARC/p53相互作用的可能性需要进一步研究。

最近有报道称，PARC具有抑癌作用并促进小鼠p53依赖性凋亡(46). 这些结果与我们和其他人的数据相反(11,13,35). 裴等。(46)尽管PARC在人胸腺中的表达很低，但检查了PARC敲除在γ射线照射的小鼠胸腺和胸腺细胞中的作用(11). 此外，尽管有趣的是，他们的PARC基因敲除小鼠表现出生存时间缩短和自发性肿瘤，但之前的PARC缺失小鼠没有表现出身体畸形、生长缺陷或健康问题(47). 尽管这些差异的原因尚不明确，但是否与所用的胁迫信号和/或物种/细胞类型有关仍有待确定。

我们已经证明，CDDP诱导的PARC下调并不是mRNA含量降低的结果。尽管PARC含有三个Asp-Xaa-Xaa-Asp（DXX年D） 基序，指示潜在的胱天蛋白酶-3切割位点，PARC处理是不依赖于胱天蛋白酶的。重要的是，我们的结果表明，CDDP诱导的PARC下调不仅仅是凋亡的结果，因为半胱氨酸蛋白酶抑制显著减弱了细胞死亡，但无法逆转PARC下调。此外，PARC已被证明具有自我泛素化作用在体外在PARC和泛素过度表达的人类细胞中检测到高度泛素化的PARC物种(11,12). 在本研究中，我们表明CDDP诱导的PARC下调并非由泛素-蛋白酶体途径介导。由Lys-48连接的多泛素链修饰的底物的最佳特征是靶向蛋白酶体(48)而单泛素化或与其他赖氨酸残基偶联的链，如Lys-63和Lys-29，则提供非蛋白水解信号(48–50). 先前报道的泛素化PARC物种可能不是Lys-48型，而是控制PARC功能或定位的修饰。这些研究没有检查泛素链结构对PARC的修饰作用以及相应的功能结果。已提出通过翻译后修饰调控PARC，可能涉及NEDD8的共价修饰(12,49)（与泛素有关；也称为Rub1），是一种控制连接酶活性的调节性修饰(51). 有趣的是，尽管PARC不能泛素化p53，但p53的活性可以被neddylation抑制(52). 卵巢癌中PARC是否和如何被泛素化或neddylation修饰，及其在CDDP敏感性中的意义尚待确定。

在这项研究中，我们提供了证据表明钙蛋白酶是CDDP诱导PARC下调的主要介质。据我们所知，这是第一次证明调控PARC处理和功能的信号通路。钙蛋白酶在凋亡中的作用反映在越来越多的底物中，包括p53、Bcl-2、Bax、凋亡诱导因子、半胱氨酸蛋白酶和细胞骨架蛋白(14,36,53–55). 钙蛋白酶活性为Ca2+-依赖性和钙蛋白酶激活对钙的反应2+信号传导是CDDP诱导细胞凋亡的早期事件(56)，调解投标分割(15)以及凋亡诱导因子的释放和caspase-9/-3的激活(36). 此外，钙的减少2+信号转导可以阻止PARC过程并促进化疗耐药。这与最近的报告一致，即CDDP诱导化疗敏感但不耐药的OVCA细胞内钙浓度增加(40).

除了调节钙蛋白酶激活外，钙2+显示可抑制Akt活性(57)因此，它是细胞凋亡和CDDP敏感性的重要调节器。由于钙蛋白酶在化疗敏感细胞和耐药细胞中的表达水平相同，我们的结果表明，CDDP敏感性的差异涉及钙2+响应(40). 通过诱导钙2+在这两种细胞类型中，离子霉素诱导化疗敏感和化疗耐药OVCA细胞内流、PARC裂解和凋亡。在对IOSE397敏感的永生化卵巢表面上皮细胞和对化疗耐药的OVCA433细胞中，离子霉素治疗并没有诱导PARC处理，可能是由于钙的不同2+监管机制(56,58).

总之，我们已经证明CDDP诱导的PARC处理和凋亡在化疗敏感和化疗耐药的人OVCA细胞中受到不同的调节。PARC的处理由钙介导2+-依赖性半胱氨酸蛋白酶钙蛋白酶，尽管CDDP诱导的凋亡可能涉及不同蛋白水解途径的相互作用。确定控制PARC处理的分子机制可能有助于当前对p53功能和凋亡的理解，并最终了解人类卵巢癌化疗耐药的潜在机制。

致谢

我们感谢Kenneth Walsh博士（波士顿大学医学院惠特克心血管研究所）慷慨提供DN-Akt，并感谢David G.Dagenais就共焦显微镜数据的显示提供技术建议。

*这项工作得到了加拿大卫生研究所MOP-15691赠款和韩国国家研究基金会世界一流大学项目的部分支持，并得到了教育、科学和技术部R31-10056赠款的支持。

三使用的缩写如下：

奥夫卡
卵巢癌
CDDP公司
顺铂
帕洛阿尔托研究中心
p53相关Parkin样细胞质蛋白
PARP项目
聚ADP-核糖聚合酶
DN阿克特
主导-负Akt
UPP公司
泛素-蛋白酶体途径
方差分析
方差分析
Z轴
苄氧羰基
FMK公司
氟甲基酮。

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文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会