Calpain-mediated processing of p53-associated parkin-like cytoplasmic protein (PARC) affects chemosensitivity of human ovarian cancer cells by promoting p53 subcellular trafficking

doi:10.1074/jbc.M111.314765

.2012年2月3日；287(6):3963-75.

doi:10.1074/jbc。M111.314765。 Epub 2011年11月23日。

钙蛋白酶介导的p53相关parkin-like细胞质蛋白（PARC）加工通过促进p53亚细胞贩运影响人类卵巢癌细胞的化疗敏感性

迈克尔·G·吴¹, 开学, 刘嘉音, 海蒂·麦克布莱德, 本杰明·曾荫权

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钙蛋白酶介导的p53相关parkin-like细胞质蛋白（PARC）加工通过促进p53亚细胞贩运影响人类卵巢癌细胞的化疗敏感性

迈克尔·G·吴等。生物化学杂志. 2012.

.2012年2月3日；287(6):3963-75.

doi:10.1074/jbc。M111.314765。 Epub 2011年11月23日。

作者

迈克尔·G·吴¹, 开学, 刘嘉音, 海蒂·麦克布莱德, 本杰明·曾荫权

附属

¹加拿大安大略省渥太华K1Y 4E9渥太华大学妇产科生殖生物学部和妇科肿瘤科。

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摘要

顺铂（CDDP）耐药是成功治疗人类卵巢癌（OVCA）的主要障碍，OVCA细胞的化疗耐药表型与Akt减毒p53介导的凋亡有关。p53的促凋亡功能涉及转录依赖性和非依赖性信号通路，p53的功能失调定位和/或失活有助于化疗耐药的发展。PARC是一种调节p53亚细胞定位和后续功能的细胞质蛋白。对PARC的分子调控机制知之甚少。虽然PARC含有推测的caspase-3切割位点，并且已知CDDP可诱导caspase和calpains的激活，并诱导抗凋亡蛋白的蛋白酶体降解，但CDDP在卵巢癌中是否以及如何调节PARC尚不清楚。在这里，我们提供证据表明CDDP促进钙蛋白酶介导的PARC下调、线粒体和核p53积聚以及化疗敏感但不耐药的OVCA细胞的凋亡。抑制Akt需要以p53依赖的方式使耐药细胞对CDDP敏感，PARC下调会增强这种效应。CDDP诱导的PARC下调可通过抑制钙蛋白酶而非半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶或26S蛋白酶体逆转。此外，体外实验证实了钙蛋白酶在介导钙依赖性PARC下调中的能力。Ca（2+）在PARC下调中的作用被进一步证实为离子霉素诱导卵巢癌化疗敏感性和化疗耐药细胞的PARC下调。这里的数据表明，PARC对p53亚细胞定位和凋亡的调节是卵巢癌细胞CDDP耐药的一个促成因素，PARC翻译后处理和化疗敏感性中的Ca（2+）/calpain。

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数字

**图1。**
**CDDP通过PARC的调节，在化疗敏感但非化疗耐药的OVCA细胞中诱导p53线粒体和核蓄积。** 一个用CDDP（10μ米; DMSO作为车辆控制）。箭头通过免疫荧光/共焦显微镜显示跨场的准确位置，并用于强调p53与TOM20和DAPI、线粒体和核标记物的共同定位是否存在。共焦图像的量化显示了细胞质中p53聚集的细胞数量(细胞)，线粒体(水户)线粒体和细胞核(努克)只有细胞核。在每个复制的每个时间点至少统计200个细胞。B类，PARC在OV2008细胞中过度表达（PEF6-PARC；PEF6-LacZ作为对照；0.5μg，24 h），并用CDDP处理（10μg米，6小时）。亚细胞p53的积累情况如上所述。结果表示为平均值±S.E(n个＝3个重复实验）；***，第页< 0.001.

**图2。**
**抑制Akt需要以p53依赖性的方式使耐药OVCA细胞对CDDP敏感，PARC下调会增强这种效应。**PARC过度表达可减弱CDDP诱导的化疗敏感性OVCA细胞凋亡。在存在或不存在CDDP（10μ米; 24小时）。一个，PARC siRNA（加扰序列(*S.序列。*)作为对照；100牛顿米，48小时；**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001 (与加扰序列）。B类，DN-Akt（LacZ作为对照(*CTL公司*); 48 h）有无PARC siRNA（加扰序列控制，100 n米，48小时；***，第页< 0.001 (与加扰序列）；⁺⁺,第页< 0.01;⁺⁺⁺,第页< 0.001 (与各自的DN-Akt（感染的多重性(*内政部*), 0));^#,第页< 0.05;^##,第页< 0.01;^###,第页< 0.001 (与各自的CDDP CTL））。C，API-2（预处理1小时）（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01 (与无API-2））。D类，PARC siRNA（加扰序列作为对照；100 n米，48小时）与p53 siRNA（100 n米，48小时），然后是API-2（25μ米; CDDP前1小时预处理）（**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001 (与无PARC siRNA和p53 siRNA）；⁺⁺,第页< 0.01;⁺⁺⁺,第页< 0.001 (与PARC siRNA）；^##,第页< 0.01;^###,第页< 0.001 (与相应的CDDP控制）。E类，PARC在PARC阴性化疗敏感性（A2780s）OVCA细胞中过度表达（PEF6-PARC；PEF6-LacZ作为对照；1μg，24 h），并用CDDP（10μg）处理米; 24小时）（**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001). 结果表示为平均值±S.E(n个=3–5个重复实验）。

**图3。**
**CDDP对化疗耐药OVCA细胞中PARC和p53的相互作用没有影响。**蛋白A Dynabeads与PARC抗体（Bethyl，A300-096A；2μg/mg裂解液；1 h）孵育，然后与C13*全细胞裂解液孵育1 h（1000μg；裂解缓冲液对照(*LB（磅）*))从处理过的CDDP中获得（0–10μ米)不同持续时间的单元格。共同免疫沉淀产生的PARC下拉和p53含量不受时间或CDDP治疗的影响(*3–10车道*). 还显示了控件(*CTL公司*)抗体IgG的潜在非特异性条带(*车道1*和2)和裂解缓冲液(*车道1*和11). 为了证实CDDP治疗的有效性，对上述样本的PARC、p53和GAPDH含量以及凋亡计数进行了检测。结果用平均值±标准误差表示(n个=3个重复实验）。*IP（IP）*免疫沉淀；*工作分解结构*，Western blot。

**图4。**
**CDDP下调PARC和Akt活性，增加化疗敏感但不耐药OVCA细胞中p-p53（Ser-15）的含量和凋亡。** 一个CDDP治疗（24小时）增加了化疗敏感性（OV2008）和耐药（C13*）细胞中的p53含量，仅在敏感细胞中增加了p-p53（Ser-15）含量、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和钙蛋白酶激活（分别以PARP和α-酪蛋白裂解表示）。CDDP仅降低敏感细胞中PARC含量和Akt活性（以p-Akt（Ser-473）和p-GSK-3β（Ser-9）表示）。只有CDDP处理的OV2008细胞（***，第页< 0.001 (与无CDDP））。B类，CDDP以时间依赖性的方式降低了OV2008细胞中PARC含量，增加了p-p53（Ser-15）和总p53含量以及凋亡（***，第页< 0.001 (与控制(*CTL公司*))).CCDDP诱导化疗敏感（IOSE397和OV2008）但不耐化疗（C13*、HEY、OVCA420和OVCA433）OVCA细胞中PARC下调和凋亡。用CDDP（10μ米24小时；DMSO对照组），并评估PARC含量和细胞凋亡。与耐药细胞相比，化疗敏感细胞中的基础PARC含量较低，但OVCA420细胞除外，其中PARC和GAPDH（负荷控制）含量始终较低（***，第页< 0.001).D类，CDDP（10μ米; DMSO控制）不影响化疗敏感性（OV2008）OVCA细胞中PARC mRNA的含量。E类，CDDP（10μ米)PARC含量降低，钙蛋白酶和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3活性增加（以α-fodrin和PARP裂解为代表），细胞凋亡呈时间依赖性。(**,第页< 0.01; ***,第页< 0.001 (与无CDDP）；⁺⁺,第页< 0.01;⁺⁺⁺,第页< 0.001 (与时间=0））。结果表示为平均值±S.E(n个=3-4个重复实验）。

**图5。**
**CDDP诱导的PARC处理和化疗敏感性部分由Ca介导²⁺-钙蛋白酶的依赖性激活。** 一个，OV2008全细胞裂解物(*WCL公司*)（30μg）与人血浆中纯化的钙蛋白酶I孵育（1 h；30°C）。通过煮沸、EGTA处理和不含CaCl抑制钙蛋白酶活性₂在孵化过程中。当CaCl激活天然钙蛋白酶时，PARC发生裂解₂(*第8车道*). α-Fodrin裂解表明钙蛋白酶活性。B类，钙蛋白酶活性导致的PARC处理为Ca²⁺-依赖。OV2008细胞裂解物如上所述与增加的CaCl一起培养₂浓度。钙蛋白酶介导的PARC处理在250μ米氯化钙₂α-Fodrin解理发生在低CaCl₂浓度，并用作钙蛋白酶活性的指标。C，用细胞渗透性钙蛋白酶抑制剂calpeptin（1 h；DMSO对照）预处理的化疗敏感性OVCA细胞（OV2008）减弱了CDDP（24 h）（*，第页< 0.05; ***,第页< 0.001 (与无钙肽）；⁺⁺⁺,第页< 0.001 (与无CDDP））。*CTL公司*，控制。D类在化疗敏感（OV2008）和化疗耐药（C13*、HEY和OVCA420）OVCA细胞中，离子霉素诱导PARC下调，所有细胞类型的凋亡增加。在化疗敏感性IOSE397和化疗耐药OVCA433细胞（*，第页< 0.05; ***,第页< 0.001). 结果表示为平均值±S.E(n个=3个重复实验）。

**图6。**
**半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和泛素蛋白酶体途径不是CDDP诱导的PARC处理的主要介质。**CDDP诱导的PARC下调与半胱氨酸蛋白酶无关。用caspase-3特异性抑制剂Z-DEVD-FMK预处理OV2008细胞2小时(一个)和泛酶抑制剂Z-VAD-FMK(B类)然后是CDDP（24小时；DMSO作为对照）。两种药物的预处理均以浓度依赖的方式阻止了CDDP诱导的caspase活性（PARP裂解表明）和凋亡（*，第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.001 (与无CDDP）；⁺⁺⁺,第页< 0.001 (与无半胱氨酸蛋白酶抑制剂）；一个和B类)，但与对照组相比未能抑制CDDP诱导的PARC下调(*CTL公司*). 结果表示为平均值±S.E(n个=6个重复实验）。CCDDP诱导的PARC下调并非由泛素-蛋白酶体途径介导。用蛋白酶体抑制剂epoxomicin预处理的OV2008细胞（30分钟；DMSO作为对照）和lactacystin（30分钟；DMSO作为对照）没有阻止CDDP诱导的（24小时）PARC下调，但减弱了细胞凋亡（**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001 (与无CDDP）；⁺⁺⁺,第页< 0.001 (与无蛋白酶体抑制剂）。D类，纯化的活性caspase-3与OV2008全细胞裂解物孵育(*WCL公司*; 2 h，30°C）导致5μg/ml的PARP完全裂解，即使在测试的最高caspase-3浓度（15μg/ml）下，PARC含量也没有显著影响；第页>0.05之间。结果表示为平均值±S.E(n个=3个重复实验；C和D类).

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