寡核苷酸微阵列对DNA拷贝数的高分辨分析

拷贝数分析的验证

只有当每个特征的荧光强度显示出对拷贝数变化的剂量反应时，才能应用WGSA阵列来确定基因组拷贝数。通过两种方法进行测试，即使用不同数量的X染色体样本，以及将一系列相同的DNA等分样品加入不同浓度的PCR产物，以将42个SNP的拷贝数从两倍（对照样本）增加到1000倍。

在X染色体拷贝数实验中，我们用男性的平均值代表1X的情况，用女性的平均值表示2X的情况；我们还收集了含有3X-、4X-和5X-的细胞系的数据。使用(我)为了指示芯片强度，可以编写剂量-反应假设我_一今年C类_ab公司×我_b条，其中我_一是具有拷贝号的区域的强度a、 我_b条是具有拷贝号的同一区域上的强度b条、和C类_ab公司是一个常数，由一和b。$\stackrel{<trans\; data-src="̃">̃</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="S">S公司</trans>}}$（见方法）可以视为对数强度的近似值（所有对对数函数的引用均指自然对数e（电子）除非另有说明）。因此，如果假设为真，则日志转换将导致$\stackrel{<trans\; data-src="̃">̃</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="S">S公司</trans>}}$_一今年$\stackrel{<trans\; data-src="̃">̃</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="S">S公司</trans>}}$_b条+$\stackrel{<trans\; data-src="̃">̃</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="C">C类</trans>}}$_ab公司使用女性平均值作为基线（X染色体上的173个SNP）得出的估计强度比为0.584、1、1.484、1.822和2.243，相当于1.17、2、2.97、3.64和4.49的拷贝数，一倍、二倍、三倍、四倍和五倍实际拷贝数的相关系数为0.981、1、0.943、0.935和0.939，分别（以拷贝数为2的女性值为基线；因此，估计拷贝数等于2×估计强度比）。当绘制估计拷贝数与实际拷贝数的对比图时，可以看到直线响应(R（右）²= 0.9976). 关系斜率0.83与理想值1不同，但与斑点阵列CGH实验的数据相似(Pinkel等人，1998年;Pollack等人，1999年).

通过将相同DNA（NCI-BL2126）的等分样品与42个因其高调用率而选择的单核苷酸多态性PCR产物加标，模拟较高拷贝数值下拷贝数估计的响应。拷贝数从2（对照）增加了2、5、10、25、50、75、100、250、500、750和1000份。在测试的42个SNP中，40个SNP的荧光强度随着拷贝数的增加而增加，达到并包括1000倍的峰值，对数强度和对数拷贝数之间的相关性为0.92(图1). 其中两个SNP的荧光强度没有随着拷贝数的增加而增加；因此，该子集表明阵列上只有一小部分SNP无法报告拷贝数变化。

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图1

加标实验的对数（拷贝数）与对数（强度）的曲线图，在该实验中，18份相同DNA的等分样品被加标不同浓度的42个SNP，从两倍到1000倍不等。黑点表示12个峰值浓度的单个SNP的结果（加上额外的0、2、5、10、25、50、75、100、250、500、750和1000个拷贝）；绿色的点和线表示所有42个SNP的平均值。两个SNP没有报告随着拷贝数的增加荧光增强，这些SNP以红色突出显示。

癌细胞系中拷贝数的变化

在证实了寡核苷酸阵列检测拷贝数增加的实用性之后，我们分析了一组20个癌细胞系。对肿瘤样本的荧光数据进行分析后，发现共有14个假定的高水平扩增，其中至少有三个连续SNP报告的比率>2.5（相当于5个拷贝数，在未处理的荧光数据中也可见）。在这些基因座中，检测了12个基因座，qPCR显示每个基因座的拷贝数超过5个(表1). COR-L96-CAR中c-MYC基因座的基因组扩增示例见图2A; 该扩增的图谱也通过qPCR（SYBR-Green）获得，该qPCR使用设计成来自阵列的SNPs的扩增子；与p501阵列中的数据的比较如所示图3还鉴定了总共10个推定的纯合缺失（再次由三个连续的SNPs报告，并在未处理的荧光数据中可见），所有这些都通过常规PCR进行了评估和确认(表1).图2B显示了LB1047-RCC中p16/INK4基因座纯合缺失的示例。

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图2

与BAC CGH数据相比，p501阵列产生的扩增和缺失示例以及基因分型数据。(顶部面板）p501阵列的荧光比率图，显示样品的平滑荧光强度数据除以参考样品的数字。（第二个面板）第页-通过与29个正常DNA的平均值和标准偏差进行比较，计算出单个SNP的值图，缺失用红线表示，扩增用绿色表示。（第三和第四组）分别为肿瘤和匹配正常样本的基因型；纯合子SNP由中心点下方的红线表示，而杂合标记由中心点上方的绿线表示。(底部中的面板C类和D类仅）基于BAC阵列的CGH的结果（如果可用）。(一个)前列腺细胞系COR-L96-CAR第8号染色体C-MYC位点（箭头）的基因组扩增。(B类)肾癌细胞株LB1047第9染色体上p16/INK4位点的纯合缺失（箭头）。(C类)乳腺癌细胞系HCC1937的18号染色体。（i） 从pter到18q12.1，该染色体的拷贝数为2（强度比为1）。（ii）从18q12.1到18qter，拷贝数下降到1（强度比为0.5），尽管基因分型数据表明该系在18号染色体全长上是杂合的。(D类)小细胞肺癌细胞系NCI-H209的5号染色体。该染色体显示出一个复杂的模式，p臂部分扩增（i），随后荧光强度下降到0.5，相应的LOH由基因分型数据（ii）确定，直到5q23.2（iii），其中强度比恢复到1（拷贝数为2）；然而，该区域仍然代表由基因分型数据确定的LOH，因此代表单个亲本染色体的重复。5q14.3处也有纯合缺失（箭头）。BAC阵列没有检测到这一点，因为该阵列没有覆盖该区域的克隆。

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图3

用p501阵列比较COR-L96-CAR中c-MYC原癌基因扩增的拷贝数估计(一个; 其中拷贝数等于强度比的两倍）和qPCR(B类).

p501阵列还检测到具有更细微拷贝数变化的区域，即放大事件为3个拷贝或拷贝数从2减少到1。对于其中两条线（HCC1937和NCI-H209），我们能够将p501阵列结果与基于BAC阵列的CGH数据进行比较。在这两个品系的44条常染色体中，有34条在两种分析方案中表现出一致的拷贝数模式，与扩展区域的低拷贝数变化进行比较。在使用p501阵列的两个样本中，17、19、20和22号染色体的分辨率都很低，因此造成了80%的不一致。这些染色体的SNP密度最低，分别为0.71、1.25、0.77和1.25 Mb，而基因组其余部分的平均密度为0.44 Mb。对于剩下的18条常染色体，来自p501阵列的数据往往显示出更大的变异性；然而，潜在模式是可识别的，并且与基于BAC阵列的CGH的模式一致(图2C、D).

阵列设计

p501阵列包含与8473个SNP互补的等位基因特异性杂交探针，这些SNP预计位于由400–800-bp XbaI消化基因组DNA片段代表的基因组部分。使用光刻方法合成了与这些SNP对应的寡核苷酸，每个SNP由56个不同的寡核苷酸探针表示。寡核苷酸是25聚体序列，用于询问正、反义链上的多态性位点，并包含完美匹配（PM）和错配（MM）序列，以便进行信噪比测量。合成从多态性位点偏移1-4nt的额外寡核苷酸，以允许数据冗余并最大限度地提高基因型准确性。

目标准备

WGSA依靠基因组表征将基因组复杂性降低约98%，从而改善杂交动力学(Lucito等人，1998年;Kennedy等人，2003年). 在连接适配器和使用适配器特异性引物扩增连接产物之前，使用Xba1将样本DNA消化完成。所用试剂和方案取自Kennedy等人(2003)除了使用400 ng样本DNA，而不是250 ng样本DNA。由于输入DNA的增加，参与消化、连接物连接和扩增阶段的所有反应体积增加了60%，从而保持了反应条件。PCR后，使用QIAGEN微型洗脱PCR纯化试剂盒（目录号28006）浓缩样品，并在30μL EB缓冲液中洗脱，每个PCR使用一个色谱柱，最终洗脱体积为180μL。使用Microcon YM-30过滤器（目录号42410）将其降到50μL。使用Hoeffer DyNA Quant毛细管试管试剂盒对最终浓缩的DNA进行定量；20μg PCR产物为片段，将平均产物大小降至50–150 bp。

杂交和扫描

如Kennedy等人所述，将探针与阵列杂交并染色，同时扫描芯片(2003). 基本上，在与杂交溶液混合并添加到p501阵列中进行杂交之前，使用末端转移酶用生物素N6-ddATP标记片段DNA。杂交后，使用Affymetrix Fluidics Station对阵列进行清洗和染色。染色程序旨在放大退火探针的信号。样品首先用straptavidin染色，然后用生物素化的抗链霉亲和素处理，最后用链霉菌亲和素R0-藻红蛋白结合物处理。使用安捷伦基因阵列扫描仪进行扫描。

特征提取

p501阵列设计为每个SNP使用28个探针对，14个探针对用于等位基因A和14个探针对等位基因B。每个等位基因的14个探针配对在正、反义链之间平均分配。探针对包括完全匹配单元和不匹配单元。我们使用

作为任何给定SNP的基本测量，其中颗粒物_我是探针对的完美匹配单元的强度我和MM（毫米）_我是探针对不匹配单元的强度我该值在对数尺度上测量完美匹配和不匹配之间的平均强度差。对数变换使分布更加高斯。之后S公司为给定芯片上的所有SNP计算，将其缩放为具有零的平均值。换句话说：

j个= 1,...,J型都是芯片上的常染色体SNP。

副本数量估计

在估计拷贝数时，对特征提取的输出进行平滑处理，通过取五个SNP的中位数（测试SNP和每个数据点的两个侧翼SNP）去除第一个离群值，然后取五个SNP的平均值。然后，通过计算荧光比率与一系列29个正常DNA的平均读数，将其转换为拷贝数。因此，如果SNP来自测试样品的二倍体区域，那么当被正常参考样品除以时，其读数将为1，表示拷贝数为2。

重要性计算

为了评估靶癌细胞系中拷贝数变化的重要性，我们将其与包含29个正常DNA样本的参考集进行比较。对于任何给定的SNPj个，我们假设$\stackrel{<trans\; data-src="̃">̃</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="S">S公司</trans>}}$_j个遵循高斯分布；使用29个正常参考样本估计平均值和方差。

哪里k个= 1,...,K（K）表示正常参考集。假设目标癌细胞株有价值SNP上j个，差异的重要性正态参考分布由第页-值：

这个概率表明正常人群的值与癌细胞系的值一样极端的可能性有多大。它越小，癌细胞与正常细胞之间的差异越大。

BAC阵列CGH

BAC阵列CGH使用包含约4100个公开可用BAC的1-Mb阵列进行。阵列构造基于Hodgson等人对协议的修改(2001). 使用QIAGEN REAL试剂盒从15 h培养物中提取DNA，并使用简并寡核苷酸引物（5′-CCGACTCGAGNNNNATGTG-3′）进行扩增。在两个不同的退火温度（58°C和60°C）下放大每个BAC以提高覆盖率。将PCR产物混合、纯化（QiaQuick kits，QIAGEN）并冻干，然后再悬浮在50%二甲基亚砜/水中，最终浓度为～300 ng/μL。每张幻灯片上至少打印了每个克隆的两个副本。

标记DNA（随机素标记试剂盒，Invitrogen）并与Cot-1 DNA在37°C下杂交48–72小时。按照Hodgson等人的描述清洗载玻片(2001)并使用Affymetrix428微阵列扫描仪进行扫描。使用Genepix软件（Axon）进行分析，并根据标签效率的变化进行调整（基于打印时间的数据调整；Yang等人2001).

CA重复基因分型

使用ABI的10cM微卫星标记集（LMS-MD10）进行基因分型。使用ABI True Allele PCR预混料（目录号403061）从12 ng DNA中扩增标记，总体积为10μL。在Kbiosystems“Duncan”热循环机上进行循环，使用94°C变性、60°C退火和72°C延伸的40个循环程序，每个循环程序持续30秒，然后在94°C下浸泡10分钟以激活Amplitaq Gold，最后在72°C下浸渍10分钟以完成延伸。根据制造商的说明制备样品并将其装载到ABI 3700或ABI 3100 DNA分析仪上。使用ABI Genescan（V5.1）和Genotyper（V3.6）软件对数据进行分析。通过比较每个样本集中包含的对照DNA（CEPH 1347-02）的数据，在运行之间对片段大小进行标准化。

纯合子缺失的确认

PCR证实了纯合子缺失。引物设计用于报告缺失的SNP和侧翼SNP。如果可能，在SNP的两侧设计引物；否则，引物应尽可能靠近SNP。对测试DNA和正常对照进行了两次PCR。通过凝胶电泳观察PCR产物。

癌症基因组项目的工作得到了威康信托基金的支持。其他资助包括英国癌症研究所（M.G.）和艾布拉姆森家族癌症研究院（B.L.W.）。我们感谢癌症基因组项目的工作人员对这项工作的贡献。

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