BMI1沉默增强前列腺癌多西紫杉醇活性并损害抗氧化反应

ShBMI1 LNCaP和DU 145细胞的产生

根据该公司提供的协议，使用TRIPZ慢病毒多西环素诱导的Tet-On®shRNA系统（Open Biosystems，Huntsville，AL）生成BMI1沉默细胞。它们从中被称为DU145ShBMI1和LNCaPShBMI1。产生非沉默TRIPZ慢病毒诱导型ShRNAmir表达细胞系（DU145NS和LNCaPNS），并在所有实验中用作对照。在多西环素（1μg/ml）诱导至少3天后进行实验。

细胞活力和半胱氨酸天冬氨酸酶活性的测定

通过CellTiter-Glo-和CaspaseGlo发光分析（Promega，Madison，WL）测量活细胞数和caspase活性。和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶这两种分析之前都有描述²⁴对于细胞活力，进行了三种实验；

1. 为了评估BMI1沉默后的细胞增殖情况，将LNCaP和DU 145细胞（NS和ShBMI1）在96周板（1000个细胞/孔）中分三次电镀。在1、3、5和7天后，测量细胞数量。
2. 为了评估多西紫杉醇治疗后的细胞存活率，将LNCaP和DU 145细胞（NS和ShBMI1）在96个平板（5000个细胞/孔）中三次电镀。第二天，将细胞暴露于不同浓度的多西紫杉醇（1、10、100和1000 nM）中1小时。治疗后，如前所述，细胞在无药物培养基中再生长三天²⁵。在三天结束时测量细胞活力。本研究中使用的多西紫杉醇浓度在临床上是可行的²⁶选择1小时治疗与1小时多西紫杉醇临床输注相类似²⁶.
3. 为了评估活性氧对多西紫杉醇抗肿瘤活性的影响，用NAC（20 mM，如前所述²⁴)，然后暴露于相同浓度的多西他赛1小时，并在含有NAC的培养基中生长3天。对于b）和c）增殖细胞和IC的部分₅₀通过非线性最小二乘曲线拟合计算与未处理培养物相关的数值。

西部印记

使用RIPA裂解缓冲液（Thermo Scientific，Waltham，MA USA）从LNCaP和DU 145（NS和ShBMI1）细胞中分离出总蛋白，并使用BCA蛋白检测试剂盒（Pierce）试剂盒进行定量。每条通道中装载30μg蛋白质提取物至4%至20%的三甘氨酸凝胶（加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen）。为了测试多西紫杉醇和抗氧化剂对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和PARP裂解的影响，实验设置与测试细胞活力的实验相同。将蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上，将其封闭在10%脱脂奶粉、0.1%吐温-20 PBS中，与初级（抗BMI1；Millipore，1/1000稀释；抗肌动蛋白，Abcam 1/5000稀释；抗裂解Caspase 3（1:1000）、抗裂解Caspase 8（1:1000，以及磷酸化Akt（1:1000）细胞信号技术）和二级（美国林肯内布拉斯加州LI-COR生物科学公司）抗体，并通过LI-COR奥德赛红外成像系统进行扫描。

基因表达分析

使用TRIZOL试剂（Invitrogen）从NS和ShBMI1（LNCaP和DU 145）细胞中提取总RNA。按照制造商的说明，使用三磷酸脱氧核苷酸通过SuperScript III第一链合成系统逆转录RT-PCR（Invitrogen，p/n 18080-05）RNA。

定量RT-PCR（qRT-PCR）通过TaqMan基因表达分析（加州福斯特市应用生物系统公司）和StepOne实时PCR机器（应用生物系统）进行。ABCB1、ABCC1、ABCG2、BMI1、FTL HSP40C1和GAPDH的检测编号分别为Hs01067802_m1、Hs00219905_m1和Hs01055362_m1、Hs 00180411_m1、H 00830226_gH和Hs99999905_m1。通过比较Ct法计算差异基因表达。

为了测试微阵列分析的RNA完整性，我们使用了安捷伦RNA 6000纳米实验室芯片试剂盒（安捷伦，p/n 5067-1511）。所有分析样品的RIN>9。使用上标II（Invitrogen）和寡核苷酸-dT逆转录标记LNCaP和DU 145（NS和ShBMI）细胞的10μg总RNA，并使用Cy3-UTP作为通用RNA参考对照（通用人类参考RNA Stratagene p/n 740000）或Cy5-dUTP作为样本。采用全人类基因组寡核苷酸芯片4×44K格式基因表达阵列（Agilent，p/n G4112F）进行基因表达研究。使用安捷伦试剂和以下相关协议进行杂交和清洗，并在GenePix 4000B扫描仪上扫描载玻片（美国加利福尼亚州桑尼维尔市分子设备公司）。通过使用Partek Genomic Suite Package（Partek）对重复数据进行ANOVA分析，确定差异表达基因。通过使用Ingenuity Pathways Analysis，使用制造商描述的统计方法和阈值，进一步分析数据（Ingenuiity®Systems，网址：www.intenuity.com). 除非另有说明，上调或下调超过2倍的基因和p<0.01的基因被称为“显著调控基因”。

定量免疫荧光

为了测量多西他赛处理后的ROS效应，将LNCaP和DU145（NS和ShBMI1）细胞接种在96孔板上。对于每个细胞系，在IC用多西紫杉醇处理细胞₅₀NS细胞的浓度，如“细胞增殖试验”所述。处理后，细胞在甲醇中固定15分钟，在PBS和1%鱼油明胶（PBSG）的溶液中清洗，并在相同的溶液中培养60分钟以封闭。阻断后，将细胞与初级抗体（小鼠抗氧鸟嘌呤，密理博，1/200稀释；兔抗肌动蛋白，Abcam，1/500稀释）在PBSG中孵育过夜。用PBSG+0.1%吐温-20洗涤后，用IRDye 800CW标记的驴抗鼠抗体和IRDyde 680CW标记驴抗兔抗体（LI-COR生物技术，1/200稀释）孵育细胞2小时。用PBSG+0.1%吐温20清洗后，用LI-COR Odyssey红外成像系统扫描细胞。

细胞周期分析

细胞在50%的汇合处接种，以确保对数生长，并用多西紫杉醇和抗氧化剂处理，处理方式与细胞活力测定所用的去氧方法相同。在治疗后，一百万个细胞被固定在冰凉的70%乙醇中过夜。固定后，离心细胞并将其重新悬浮在含有40μg/mL碘化丙啶和100μg/mL RNA酶A的PBS中，并在37°C下培养1小时。

体外数据与临床数据相关性的Meta分析

将BMI1沉默的体外数据与来自Oncomine 4.2数据库分析工具的前列腺癌表达谱进行比较(http://www.oncomine.org). 同时利用肿瘤素数据库研究抗氧化基因与前列腺癌预后的相关性。为此，我们确定了22项关于Oncomine数据库的PC研究。。基于高于0.5的相关系数，我们选择了与BMI1正相关的基因。为了避免对同一样本进行重复分析，我们确定了同一第一作者的研究，并分析了BMI1相关基因数量最多的研究（基于相关系数）。按照Chinnaiyan及其同事的描述计算与该荟萃分析相关的所有统计值²⁷.

BMI1沉默后的细胞活力和caspase活性

我们首先测试了BMI1沉默影响PC细胞增殖的假设。BMI1沉默细胞的细胞生长没有显著影响（数据未显示）。鉴于这些结果，我们研究了BMI1沉默对多西紫杉醇抗肿瘤活性的影响。正如预期的那样，多西紫杉醇治疗诱导了剂量依赖性生长抑制，IC₅₀浓度分别为6.53±1.59和22.60±2.64 nM（LNCaP NS和DU 145 NS）。BMI1沉默导致严重IC₅₀两种细胞系的减少（LNCaP和DU 145分别为2.01±0.76和9.96±1.02 nM，图2A). 这些结果与细胞周期和凋亡测量结果一致。多西他赛处理的NS和ShBMI1 LNCaP细胞显示出相似的细胞周期分布(图2B)但BMI1沉默增加了流式细胞术测定的凋亡细胞数量（从41%增加到51%）和caspase 3/7活性(图2D). 相反，在DU145细胞中BMI1沉默并没有增强多西他赛诱导的凋亡（数据未显示），但增加了G2/M期阻滞细胞的百分比（从12%增加到23%，图2C).

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图2

BMI1沉默对多西紫杉醇活性的影响

A类：集成电路₅₀不同多西紫杉醇浓度处理的细胞数*p<0.05，T检验。B、 C类：多西他赛处理细胞的细胞周期分布。D类：在IC用多西紫杉醇处理的LNCaP细胞中Caspase 3/7活性₅₀NS细胞浓度**p<0.01，T检验。

基因表达分析

由于BMI1依赖性化疗耐药的一个可能解释可能是药物转运体调节，我们研究了BMI1是否沉默了参与多西紫杉醇化疗耐药的下调的三个ABC转运体²⁸并由PC细胞表达^7，29。如所示补充图1 A与DU145细胞相比，LNCaP细胞表达的ABC转运体mRNA要低得多。有趣的是，LNCaP对多西他赛更敏感，并且比DU145细胞表达更低的BMI1(图1和​和2）。2). 然而，BMI1沉默并没有显著调节ABC转运体的表达。由于多西他赛耐药也与Akt通路的诱导有关，我们还观察了BMI1沉默后Akt磷酸化。同样，我们发现BMI1沉默并没有显著降低两种细胞系中的Akt磷酸化(补充图1 B)为了剖析BMI1依赖性化疗敏感性的分子途径，我们比较了ShBMI1和NS细胞的基因表达谱。BMI1沉默产生564（LNCaP）和880（DU 145）基因的显著调节(补充标签1和2). 我们的阵列数据显示，BMI1沉默上调了两个细胞系中的280/564（49.6%）和492/879（55.9%）基因。为了深入了解BMI1沉默的后果，我们分析了BMI1调节的基因类别(补充表3)，使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）软件。有趣的是，我们发现在这两种细胞系中调节的大多数基因与癌症显著相关（9.3e^-15<p<3.9e^-2个). 尤其是LNCaP和DU145细胞中分别有150和141个基因与肿瘤发生相关。我们还发现，“细胞死亡”和“细胞生长和增殖”受到显著影响(补充表3). 由于多西紫杉醇敏感性可能通过调节促凋亡和抗凋亡途径介导，我们进一步评估了这些基因的功能和分类。在LNCaP和DU145中，BMI1沉默后，我们无法确定促凋亡或抗凋亡途径的显著调节。这些数据与NS和Sh BMI1细胞中类似的Akt磷酸化水平一致。由于经典死亡途径的分析无法解释我们关于多西紫杉醇活性的数据，我们研究了BMI1沉默后调控的TOX途径。这种IPA分析确定了基因表达变化对几种细胞应激的反应，包括DNA损伤、缺氧和外源性物质。有趣的是，BMI1沉默能够调节两种细胞系中的ROS相关基因。特别是，“氧化应激反应”基因在严重受影响的TOX类别中排名第一(补充标签4). 与我们的细胞周期分析一致，G2/M过渡基因也受到了显著的调控。更有趣的是，我们发现BMI1沉默能够下调每个细胞系中的抗氧化基因集(图3 A). 其中，我们发现了经典的抗氧化基因（γ-谷氨酰转移酶）、不同的热休克蛋白（HSP）40亚型和铁蛋白轻链（FLT）。值得注意的是，BMI1沉默从未导致抗氧化基因的上调。在DU 145细胞中，这种效应与ROS生成（MAOA）相关基因的上调有关³⁰和活性氧依赖性细胞凋亡（caspase 8）³¹有趣的是，BMI1沉默也上调了KEAP1的表达，KEAP1被认为可以抑制抗氧化反应。此外，我们通过qRT-PCR证实了FTL和HSP40基因的显著下调。

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图3

活性氧在多西紫杉醇抗肿瘤活性中的作用

A类BMI1沉默后的“氧化应激反应”基因表达谱*经qPCR证实。铁蛋白轻链；GGT，γ-谷氨酰转移酶；环氧水解酶；谷胱甘肽过氧化物酶；热休克蛋白；谷胱甘肽硫转移酶；HK，己糖激酶；单胺氧化酶A；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8；KEAP1，Kelch-like ECH相关蛋白1。B类：氧鸟嘌呤水平（多西紫杉醇处理细胞/未处理细胞）*p<0.05，T检验（NS vs.ShBMI1）。C和D：在ShBMI1细胞中NAC-多西他赛或仅多西他赛处理后的细胞存活率**p<0.01，***p，0.001，T检验（NS vs.ShBMI1）

活性氧在多西紫杉醇活性中的作用

由于我们的阵列数据强烈表明BMI1沉默会干扰PC细胞的抗氧化反应，因此我们分析了多西紫杉醇治疗后ROS的生成。为此，我们测量了NS和ShBMI1细胞中的氧鸟嘌呤水平。氧鸟嘌呤是DNA氧化损伤的主要产物，广泛用于测量氧化应激³²如预期，多西紫杉醇治疗导致氧鸟嘌呤水平增加1.5至2倍(图3 B). 更重要的是，BMI1沉默的细胞在两种细胞系中都显示出明显更高的氧鸟嘌呤浓度(图3 B). 最后，为了证明ROS在多西紫杉醇抗肿瘤活性中发挥关键作用，我们用抗氧化剂NAC处理了BMI1沉默的细胞。如所示图3（C、D）NAC治疗大大减少了多西他赛依赖性细胞死亡。这些结果表明，BMI1沉默损害PC抗氧化反应，从而增强多西紫杉醇的抗肿瘤活性。

为了进一步证实我们的数据，我们测量了多西紫杉醇处理和未处理细胞中的PARP和caspase裂解。此外，我们评估了两种抗氧化剂分子（NAC和α-生育酚）对多西他赛处理细胞的影响。与我们之前的结果一致，在BMI1沉默后，LNCaP细胞表现出更大的PARP和caspase 9和7分裂(图4). 在DU145细胞中，我们没有检测到胱天蛋白酶9的切割，而是检测到胱天蛋白酶8的切割。然而，与NS DU 145细胞相比，BMI1沉默细胞中的caspase或PARP裂解没有变化。，重要的是，在LNCaP和DU145细胞中，两种抗氧化剂都能够挽救多西他赛处理的细胞形成凋亡。

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图4

多西他赛处理细胞中的PARP和caspase裂解

NAC，N-乙酰半胱氨酸，toco，α-生育酚。