公共科学图书馆一号。2012; 7（1）：e29079。
晚期乳头状浆液性卵巢癌潜在卵巢癌干细胞基因表达谱的鉴定
，#1 ，#2 ，三 ，2 ，4和1，*
维诺德·瓦蒂帕迪埃卡尔
1美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院马萨诸塞总医院癌症中心
迪帕·萨克塞纳
2美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院波士顿儿童医院骨科
塞缪尔·莫克
三美国德克萨斯州休斯顿德克萨斯大学M.D.安德森癌症中心妇科肿瘤系
彼得·V·豪斯卡
2美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院波士顿儿童医院骨科
劳伦特·奥斯本
4美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心细胞和癌症生物学分院
迈克尔·J·伯勒
1美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院马萨诸塞总医院癌症中心
关新元，编辑器
1马萨诸塞州总医院癌症中心、马萨诸塞州总医院、哈佛医学院、美国马萨诸塞州波士顿
2美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院波士顿儿童医院骨科
三美国德克萨斯州休斯顿德克萨斯大学M.D.安德森癌症中心妇科肿瘤系
4美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心细胞和癌症生物学分院
中国香港大学
#贡献均等。
构思并设计了实验：MJB VV LO。执行实验：MJB VV LO DS。分析数据：MJBVV SCM LO PVH。贡献的试剂/材料/分析工具：MJB SCM PVH。撰写论文：MJB VV LO。
2011年7月5日收到；2011年11月21日接受。
版权这是一篇开放存取的文章，没有任何版权，任何人都可以出于任何合法目的自由复制、分发、传播、修改、构建或以其他方式使用。这项工作是在知识共享CC0公共领域奉献下提供的。 这是一篇根据知识共享公共领域声明条款发布的开放存取文章，该声明规定，一旦将本作品置于公共领域，任何人都可以出于任何合法目的自由复制、分发、传播、修改、构建或以其他方式使用本作品。
- 补充资料
图S1：腹水样本的CA125染色：CA125染色和FACS分析证实了从腹水和卵巢癌细胞系SKOV3分离的细胞来源于卵巢。（文件）
GUID:88000C79-FDF1-4BF4-91CD-06541E976642
图S2：腹水样本中SP和MP分类的代表图。（文件）
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GUID:D4D92F52-F086-41DB-9F4E-4A5A003DAF07
图S4：SKOV3和A224细胞系的SP和MP细胞中FPGT表达的蛋白质印迹分析（如上）。ADAM19在A224 SP和MP细胞中的免疫荧光：A224细胞被分选为SP和MP，并在盖玻片上生长。取下组织培养基，用PBS冲洗两次。然后用4%对甲醛固定细胞12分钟，用PBS进行两次快速清洗。然后用1%Triton在0.02%BSA中的PBS中渗透细胞2分钟。然后将细胞与封闭血清（在PBS中含有2%BSA的20%热灭活血清）在室温下孵育20分钟。用PBS清洗细胞，用阻断肽（BP，ADAM19-P，SC-25989，Santa Cruz Biotechnology）培养对照细胞。细胞在室温下用一级抗体（ADAM19山羊plyclonal IgG，SC25989，Santa Cruz Biotechnology）染色2小时。用PBS清洗细胞三次，并在室温下对二级抗体（驴抗羊IgG-FITC，SC-2024，Santa Cruz Biotechnology）进行染色30分钟。细胞用PBS洗涤三次，用DAPI染色5分钟。SP和MP细胞ADAM19分别呈64±4%和33±5%的阳性染色。上述具有代表性的数字。（文件）
指南：7B296BCE-67B6-4E08-BA97-2B6625F1D4EC
图S5：A224和SKOV3 SP和MP细胞中Notch靶基因的表达水平。（文件）
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图S7：A224 SP细胞中转运体基因的表达水平。（文件）
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图S8：PSENEN在A224和SKOV3 SP和MP细胞中的表达水平。（文件）
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表S3：SKOV3 SP和MP上不同细胞表面标记的相对表达。（文件）
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摘要
癌症干细胞基因表达谱的鉴定可能对理解肿瘤生物学和设计针对这些细胞的新疗法具有重要意义。在这里，我们报告了一个潜在的卵巢癌干细胞基因表达谱，该基因来自于来自高级晚期乳头状浆液性卵巢腺癌患者新鲜腹水的分离侧群。Affymetrix U133 Plus 2.0微阵列用于询问侧面群体（SP）和主要群体（MP）之间的差异表达基因，并使用BRB-ArrayTools通过配对T检验分析结果。我们确定了138个上调和302个下调基因，它们在所有10个SP/MP对之间差异表达。使用qRT-PCR验证了微阵列数据，17/19（89.5%）基因在微阵列和qRT-PCR表达数据之间显示出强大的相关性。Pathway Studio分析确定了几个与SP细胞特有的细胞生存、分化、增殖和凋亡相关的基因，并确定了Notch信号激活的机制。为了验证这些发现，我们从人类卵巢癌细胞系中鉴定并分离出富含肿瘤干细胞的SP细胞。与MP对应物相比，SP群体具有更高的集落形成效率，并且能够持续扩展和分化为SP和MP表型。50000个SP细胞在裸鼠体内产生肿瘤，而相同数量的MP细胞在注射后8周未能产生任何肿瘤。SP细胞对特异性γ-分泌酶抑制剂表现出剂量依赖性敏感性，这与Notch信号通路在SP细胞存活中的作用有关。此外，发现生成的SP基因列表在复发性卵巢癌肿瘤中富集。
介绍
上皮性卵巢癌是美国女性第五大死亡原因。2010年，美国估计将新增21880例卵巢癌病例和13850例死亡病例[1]虽然早期卵巢癌患者的5年生存率>90%，但约80%的女性患有晚期疾病，5年生存期仅为30%。标准治疗包括细胞减少手术和一线联合化疗[2]75%的患者最初对常规化疗有反应，然而，超过80%的女性最终复发并死于化疗耐药疾病[2].
越来越多的证据表明，肿瘤中称为癌干细胞（CSC）的少量细胞有助于肿瘤的维持和进展，并且对旨在破坏快速分裂细胞的治疗具有内在的抵抗力[3]，[4]，[5]，[6]，[7]CSC已从几种人类实体癌（如乳腺癌）中描述出来[8]，大脑[9]，[10]，冒号[11]，[12]、头部和颈部[13]和胰腺癌[14].对人类急性髓细胞白血病进行的实验[15]和实体肿瘤[8]，[9]表明CSC显示出三个功能特征：1）当注射到裸鼠体内时，它们具有形成肿瘤的潜在致瘤性，2）它们表达不同的表面标记，允许重复和差异纯化，3）它们有能力重建母肿瘤的完全表型异质性[16]，[17]因此，CSC的定义是功能性的，与正常干细胞具有两个重要的功能特征：自我更新和分化[3]，[7].
表征正常和癌症干细胞的困难在于，这些细胞群很少见，并且缺乏特定的细胞表面标记，这对分离和鉴定纯干细胞群是一个挑战。无法分离出纯干细胞群体，引发了对CSC模型的激烈争论[18]，[19]，[20]一些干细胞标记物（CD133、CD44、Sca1）已成功用于分离正常和肿瘤组织中的干细胞[21]，[22]，[23]然而，还没有发现干细胞上特有的标记[7]在一个组织的干细胞上发现的细胞表面标记物并不总是有助于识别另一个组织中的干细胞，因为其中许多标记物也存在于无关组织和器官的非干细胞上[7].
Goodell等人首次报道，由于Hoechst染料更有效的流出和更低的荧光强度信号，少量细胞显示出明显的FACS分布在主要细胞群一侧[24]该细胞亚群被称为侧群（SP），并且富集来自小鼠骨髓的造血干细胞[24]许多关于SP的研究已经在许多癌症中进行，例如白血病、脑、前列腺、胃肠道、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤和许多癌细胞系，导致了这样的假设：SP富含CSC[8]，[25]，[26]，[27]，[28]，[29]，[30]，[31]现已证明，与许多其他肿瘤一样，卵巢癌也含有SP细胞，这些SP细胞明显对应于负责肿瘤生长的CSC[32]，[33]卵巢癌SP细胞对苗勒抑制物质和IFN-α的敏感性已被证实[32]，[33]我们提出，患有高级晚期乳头状浆液性卵巢腺癌的女性腹水的副群将富含癌症干细胞，并将在卵巢癌干细胞中表达“干性”的基因特征趋势。
材料和方法
道德声明
新鲜腹水是在马萨诸塞州波士顿布里格姆妇女医院进行初级细胞减少手术时，从10名患有高级晚期卵巢腺癌的妇女身上获得的。所有标本都是根据Brigham and Women’s Hospital机构审查委员会批准的方案收集的，并获得患者的知情书面同意。根据指南和MGH动物护理和使用委员会的批准（方案编号：2009N000148）进行动物护理和实验。
肿瘤标本与亚群细胞的分离
在马萨诸塞州波士顿Brigham and women’s Hospital进行初级细胞减少手术时，从10名患有高级晚期卵巢腺癌的女性患者身上获得新鲜腹水。腹水样本以1400 RPM的转速离心分离细胞。在红细胞溶解后，将剩余的细胞接种到培养皿中，无需传代。分选前，细胞用CD45染色以排除血细胞污染，用CA125抗体染色以确认这些细胞的卵巢来源。使用FACS进行CD45和CA125分析。CD45和CA125抗体分别购自BioLegend和Invitrogen。在第7天到第10天之间，用Hoechst33342或0.5µg/mL罗丹明123（Rho）对细胞进行染色[34]并在配备紫激光的BD FACSAria上进行分拣。控制实验验证了Hoechst仪表板集成模块
与。罗仪表板集成模块两种方法分离的侧群（SP）组分在丰度百分比和基因表达谱上相似。
Affymetrix基因芯片杂交和图像采集
使用RNeasy试剂盒从SP和MP中提取总RNA（马里兰州Germantown市Qiagen）。在进一步操作之前，首先由BioAnalyzer（安捷伦，加州帕洛阿尔托）检查总RNA质量。如前所述，使用了两轮放大[35]如前所述进行杂交、处理和图像采集[35].
定量实时PCR
如前所述，使用iCycler实时检测系统（Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA）对50 ng扩增RNA进行qRT-PCR[37]，根据制造商的说明使用SuperScript III铂金SYBR绿色一步法qRT-PCR（加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen）。通过归一化三个看家基因的表达水平，获得每个基因的相对表达水平(亲环素、GUSB、GAPDH)[38]实时PCR表达值用于与微阵列信号强度的相关性分析。Pearsons和Spearmans的等级相关性使用GraphPad Prism 5.00（GraphPad Software Inc.，San Diego，CA）进行。
细胞系和培养条件
将人卵巢癌细胞系SKOV3、A224、OVCAR-3和UCI-107保存在RPMI 1640（Invitrogen Life Technologies）中，补充10%胎牛血清、1%L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素，保存在含有5%CO的湿化培养箱中2在37°C时，如Mok等人所述[39].
流式细胞仪分析
通过胰蛋白酶分离细胞，离心并重悬于含有浓度为1×10的2%血清的组织培养基中6细胞/mL。用5.0µg/mL Hoechst33342染料在37°C下单独或与ABCB1外排泵抑制剂维拉帕米（100µM）联合标记细胞90分钟。培养结束后，在低温下离心细胞，并将其重新悬浮在含有2%血清的低温新鲜培养基中。在FACS分析之前，将7-氨基-放线菌素D（7AAD）添加到细胞中，使最终浓度达到2µg/mL，以将死亡细胞排除在分析之外。使用BD-LSRII系统（BD Biosciences）进行SP分析。用紫外激光激发赫斯特染料，并用675LP（赫斯特红）和440/40滤光片（赫斯特蓝）测量其荧光。
假定干细胞标记物染色
使用荧光异硫氰酸盐（FITC）、藻红蛋白（PE）和别藻蓝蛋白（APC）结合单克隆抗体对SP细胞进行免疫表型鉴定。在抗体染色之前，使用如上所述的Hoechst 33342对细胞进行SP细胞染色。然后将细胞洗涤并与CD24-RPE（AbD-Serotec）、CD34-FITC（Miltenyi Biotec）、CD44-FITC（AbD-Serotec）、CD117-PE（Miltenyi Biotec）和CD133-APC（Miltenyi Biotec）在PBS中在4°C的黑暗中孵育15分钟。使用BD CompBeads抗小鼠Ig进行多色流式细胞术分析的荧光补偿设置，κ（BD Biosciences），所有分析均使用BD LSRII系统（BD bioscience）进行。在488 nm处激发FITC和PE抗体，并使用530/30 nm（FITC）和575/26 nm（PE）过滤器收集。APC抗体在633 nm处激发，在660/20 nm处收集。
集落形成效率测定
为了分析集落形成效率（CFE），在六孔组织培养板中以每孔100个细胞的速度培养SP和MP细胞，并培养14天。然后用冷甲醇在4°C下固定细胞20分钟，并用0.5%结晶紫溶液染色，以便通过显微镜计数菌落数量。对随后的两段进行分析。菌落形成效率也计算为第14天产生菌落的单个细胞的百分比。用Hoechst染料对细胞进行染色，并使用FACS对单个细胞进行MP和SP分类，将其放入含有200µL组织培养基的96孔板中。细胞生长14天，然后用甲醇和结晶紫溶液固定和染色。
锚固独立增长
通过软琼脂克隆检测锚定非依赖性生长。PBS中7%的低胶凝琼脂糖储备在RPMI培养基/10%血清中稀释至0.7%琼脂糖的最终浓度。对于底层，将1.5 ml 0.7%琼脂糖添加到6孔板中，并在4°C下冷却。将培养基中剩余的0.7%琼脂糖在RPMI培养基/10%血清中进一步稀释至0.35%的最终琼脂糖浓度。对于顶层，2500个细胞（SKOV3）/5000个细胞（A224）置于6 ml 0.35%琼脂糖中。在4°C下孵育1小时后，将平板转移至37°C并孵育14天。然后用0.5 mg/ml的硝基蓝四氮唑（西格玛-阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州）对细胞进行过夜染色，并用生物计数4000P（德国Biosys）对100–2000微米之间的菌落进行计数。对每个电镀样品进行两次独立实验，每次实验一式三份。
SKOV SP和MP细胞的生长体内
雌性裸鼠（Balb/C裸鼠）购自Charles River Laboratories（美国马萨诸塞州威尔明顿）。这些小鼠在4-6周龄时被用于这些实验。产生肿瘤，SKOV3-SP和MP（5×104将细胞/100µL PBS）细胞皮下注射到小鼠背部。对于体内注射后，将细胞分为SP和MP级分并培养8天。然后将细胞胰酶化，在4°C下以800 rpm离心7分钟，用PBS洗涤两次，并在PBS（GIBCO/Invitrogen）中重组。只有存活率>95%的单细胞悬液（通过台盼蓝排除法测定）用于体内注射。
SKOV3和A224 SP细胞对SP和MP组分的再增殖
如上所述，用Hoechst 33342染料对细胞进行染色以进行分类。分选后的SP细胞和MP细胞在相同条件下分别培养8天，然后用Hoechst 33342染料保存并重新分析。
γ-分泌酶抑制剂IX（GSI-IX）SKOV3 SP和MP细胞的作用
将γ-分泌酶抑制剂GSI-IX（Calbiochem，EMD Biosciences Inc.，La Jolla，CA）溶解在100%二甲基亚砜（DMSO）中以制备储备溶液（5 mg/ml），然后在培养基中稀释以获得所需浓度。用10和20µg抑制剂处理分选的SKOV3 SP和MP细胞，以评估抑制剂对细胞集落形成效率的影响。对照SKOV3 SP和MP细胞用DMSO处理，处理量等于溶解抑制剂所需的DMSO浓度。
复发性卵巢癌患者表达数据库中SP基因特征的富集
利用人类卵巢癌临床表达数据库分析复发性卵巢癌患者与原发肿瘤患者SP基因特征的富集情况。我们的临床数据库中有6个患者信息，其中包含12个样本（原发性和复发性）的表达文件。我们使用生物特征研究分支（BRB）阵列工具的稳健多芯片平均方法（RMA）获得了每个探针集的表达值。排除了被评分为缺失的探针集，分析中只包括SP细胞基因特征上调的基因。从SP基因列表中随机选择基因，对原发性和复发性卵巢肿瘤样本进行qRT-PCR。
结果
腹水标本中SP/MP细胞的表达谱分析
FACS的CA125阳性染色证实了腹水分离细胞的卵巢来源(图S1)使用Hoechst和/或Rho染色分析这些细胞的SP和MP细胞。腹水样本的SP和MP分类代表图如所示图S2在所有患者样本中，SP范围在0.25%左右(). 未经培养未对腹水标本进行检查，为了排除血细胞污染，我们在分析中仅使用CD45阴性的细胞。对分离的SP和MP亚群进行继代培养，并使用Affymetrix U133 Plus 2阵列获得全球基因表达谱。对数据进行初始过滤后，生成了16964个序列的信息数据集。通过配对T检验分析，确定了代表432个基因的446个差异表达探针，显著性为P（P）<0.01. 与MP相比，SP中有142个探针上调，304个探针下调。热图显示了所有SP和MP样本中438个差异表达的探针，见.
腹水标本中SP/MP细胞的表达谱。（A） 热图显示了卵巢癌患者中区分SP细胞和MP细胞的438个探针的表达模式。垂直列表示单个样本；水平行代表单个基因。红色和蓝色分别表示上调和下调。（B） 使用qRT-PCR验证微阵列数据：使用19个随机选择的基因验证微阵列的数据。为了计算每个基因的相对表达，2-ΔΔCT方法是将三个看家基因（亲环素A、GUSB、GAPDH）的CT值平均为一个参考基因值。（C） 微阵列和qRT-PCR数据之间相关性分析的代表图：2-ΔCT根据信号强度值（微阵列）绘制数值（qRT-PCR）。使用GraphPad Prism 4.00版，通过Pearson和Spearman方法对每个基因进行相关性分析。
表1
腹水样本中确定的SP细胞百分比。
| 患者ID | 确定的SP百分比 |
| 样品1 | 0.23 |
| 样品2 | 0.16 |
| 样品3 | 未注明日期。 |
| 样品4 | 0.2 |
| 样品5 | 0.2 |
| 样品6 | 0.3 |
| 样品7 | 未注明日期。 |
| 样品8 | 未注明日期。 |
| 样品9 | 0.3 |
| 样品10 | 未注明日期。 |
通过对19个随机选择的差异表达基因进行qRT-PCR分析，验证了微阵列结果。与MP相比，SP中过表达和欠表达基因的qRT-PCR表达差异在17/19个基因中得到验证(). 使用Pearsons和Spearmans的秩相关分析分析微阵列和qRT-PCR生成的数据的相关性(图S3&表S1，S2系列). 17/19个基因在微阵列表达数据和qRT-PCR表达数据之间显示出显著相关性，导致微阵列验证率为89.5%。两个代表性基因（KITLG和GEMIN6）的线性回归图如所示.
识别与卵巢癌SP细胞存活、自我更新和肿瘤维持有关的信号通路
在438个差异调节基因中，与MP细胞相比，SP细胞中表达不足的基因略多（68%）。差异表达的基因签名丰富了基因本体生物学过程中的基因(P（P）细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖、转运、信号转导、转录、翻译、蛋白质修饰、代谢和蛋白水解(). 这些基因的主要部分没有任何生物功能，可能包含与潜在干细胞特征相关的新基因。为了确定与SP细胞存活和分化相关的信号通路，使用Pathway Studio 6.0（Ariadne Genomics）分析微阵列数据。生物相关过程的数据挖掘显示了与差异表达基因相关的生物过程(). 正常干细胞功能相关基因NUP[40]，ST3GAL[41]，长期业务伙伴[42]SP上调。除此之外；SP细胞显示出与活性抗凋亡机制相关的不同基因().
确定与卵巢癌SP细胞存活、自我更新和肿瘤维持有关的假定信号事件。（A） 微阵列数据的基因本体分析（P值<0.01）：饼图显示了SP和MP细胞之间差异表达基因的生物学功能。基因签名丰富了凋亡、细胞周期、细胞增殖、转运、信号转导、转录、翻译、蛋白质修饰、代谢和蛋白水解等基因本体生物学过程中的基因。其他代表参与防御反应、血管生成、凝血、视觉感知、个体发生、细胞基质粘附和原始卵泡生长启动的基因。（B） 文献的图形表示衍生出有关SP细胞生物途径的事实。Pathway Studio 6.0软件用于识别SP细胞中激活的通路。实心符号表示SP细胞中下调的基因（EGFR、TNFRSF6、BCL2L11、FOXO3A、RUNX1），开放符号表示上调的基因（EPHB4、EPHB2、PAWR、AKT1），灰色符号表示SP和MP细胞之间表达没有显著变化的基因。（C） Notch信号通路：该图显示了Notch信号转导元件的示意图。SP细胞中的过度表达蛋白（FPTG、ST3GAL6和ADAM19）显示为蓝色。前体Notch-protein的翻译后修饰包括被转高尔基体中的蛋白酶和糖基化裂解。Notch胞外结构域（ECN）与Notch胞内结构域（ICN）的粘附导致成熟的Notch异二聚体并转移到细胞膜。受体与邻近细胞上DSL家族配体（Delta、Serrate、Lag3）的相互作用通过ECN的糖基化调节。细胞外配体区域与ECN的EGF-like重复序列的成功相互作用导致ADAM蛋白酶和具有γ-分泌酶活性的早老素通过两个连续步骤对Notch跨膜结构域进行蛋白水解裂解。释放的Notch胞内结构域被转位到核酸酶，在那里它与CSL1相互作用，取代CSL阻遏物，并与Mastermind-like因子和转录辅激活物形成转录复合物。这种转录复合物激活下游靶基因，并可能解释卵巢肿瘤干细胞存活、自我更新和肿瘤维持。
我们已经鉴定了几个可能赋予卵巢SP细胞干性特征的基因。由于SP中细胞群的异质性，我们预计可能不存在明确的通路。ADAM19、FPGT和ST3GAL6在SP细胞中过度表达，可能是潜在的肿瘤干细胞相关基因。基于SP基因签名列表中FPGT、ST3GAL6和ADAM19的表达谱，我们提出了一种可能的机制，该机制可能活跃于SP细胞中，从而解释卵巢中SP细胞的存活、分化和肿瘤维持(). 图中显示了三种酶参与Notch信号通路的激活。FPTG激活GDP-岩藻糖的合成，并通过岩藻糖基转移酶将其并入Notch受体。酶ST3GAL6可以激活末端唾液酸残基的添加，ADAM19进一步催化细胞外Notch跨膜结构域的蛋白水解裂解。
卵巢癌细胞系中副群（SP）细胞的鉴定
我们使用流式细胞术分析排除DNA结合染料Hoechst33342，从四种人类卵巢癌细胞系中鉴定出SP细胞。作为对照，我们使用了维拉帕米，它可以阻断药物转运蛋白的活性，防止它们流出染料。显示了SKOV3和A224卵巢癌细胞系的荧光激活细胞分选图。门控SP细胞的轮廓显示为占总细胞数的百分比。当维拉帕米加入Hoechst孵育时，SP被消融。我们在所有评估的四种癌细胞系中检测到SP细胞，即SKOV3（1.54%）、A224（1.02%）、OVCAR-3（0.08%）和UCI-107（0.12%）。为了进一步检查分离的旁系细胞的真实性，对患者SP基因列表中随机选择的基因（ADAM19、FPGT、ST3GAL6、LLGL1和TK2）进行qRT-PCR。所有基因在从SKOV3分离的SP细胞上都得到了很好的验证，支持癌干细胞在侧群分离细胞中的富集(). 分别用免疫荧光法和免疫印迹法在蛋白水平验证了ADAM 19和FPGT在SP细胞中的过度表达(图S4). 为了验证使用pathway studio鉴定的Notch通路基因，我们在SP和MP人群中使用qRT-PCR评估了Notch靶基因。Notch靶基因的显著上调包括HES1型和槽口1与MP对应物相比，在SP人群中检测到(图S5).
卵巢癌细胞系副群细胞的鉴定和验证。（A） 已建立的人卵巢癌细胞系中SP细胞的鉴定。用Hoechst 33342染料标记SKOV3和A224细胞株并进行流式细胞术分析。概述了在维拉帕米（一种多药转运蛋白抑制剂）存在下消失的SP细胞，并显示为占总细胞数的百分比。三次独立测量得到了类似的结果。（B） 验证从SKOV3细胞系分离的SP和MP细胞的SP基因列表中随机选择的基因。（C，D）集落形成效率测定：来自SKOV3和A224细胞系的分选SP和MP细胞的集落形成率。为了分析集落形成效率（CFE），SP和MP细胞在组织培养六孔板中等量分选和培养，并生长14天。然后用冷甲醇固定细胞，用0.5%结晶紫溶液染色，用显微镜计数菌落数。实验分三次进行。（E，F）传代数：根据传代数评估SKOV3和A224细胞系中分选的SP和MP细胞的集落形成效率。细胞用冷甲醇固定，并用0.5%结晶紫染色。
从细胞系中分离的SP细胞的生物学验证
评估从SKOV3和A224细胞株分离的SP和MP细胞的集落形成效率（CFE）。SKOV3 MP细胞CFE为13.0±2.0%，而SP细胞CFE则为27±1.0%(P（P） = 0.0077) (). A224 MP细胞的CFE为3.0±1.0%，而SP细胞的CFE为9.0±1.0%(P（P） = 0.0043) (). 对来自这些平板的SKOV3的SP和MP细胞的未染色菌落进行胰蛋白酶处理，并再次将细胞以每孔100个细胞的速度放置在六孔组织培养板中，然后再生长14天，并估计CFE。SKOV3 MP细胞的CFE为8.0±1.5%，而SP细胞的CFE为44.0±4.0%。首次传代后，SKOV3的MP和SP之间CFE的最初2倍差异增加到5倍(P<0.001) (). A224 SP细胞也有类似的趋势(). CFE随着传代的增加而增加，这表明SKOV3和A224的SP组分中肿瘤干细胞样细胞的富集，以及其持续扩张的能力。
为了评估每个细胞系的SP和MP细胞的非锚定生长，评估其在软琼脂中形成菌落的能力。A224 SP细胞每培养皿形成约90个菌落/5000个细胞，而A224 MP细胞仅形成几个菌落(P<0.001)SP电池的电镀效率为1.8%。对于SKOV3电池，SP和MP电池的电镀效率分别为4.8%和1.6%().
卵巢癌细胞系分离的SP细胞的生物学验证。（A，B）来自SKOV3和A224细胞系的分选SP和MP细胞的锚定非依赖性生长。（C，D）96孔板中的单细胞分析：在单个孔中培养A224和SKOV3 SP和MP细胞的单细胞。让单个细胞生长14天，并使用结晶紫染色评估集落形成效率。（E）体内SKOV3 SP和MP细胞在雌性裸鼠体内的肿瘤生长。
为了确定SP和MP细胞的单细胞克隆效率，使用FACS将A224和SKOV3 SP和MP单细胞培养物制备成96孔板。让平板生长14天，用结晶紫染色法评估菌落形成效率。A224 MP细胞CFE为3.0±1.5%，而A224 SP细胞CFE则为17±1.0%(P（P） = 0.005)而SKOV3 MP细胞的CFE为2.0%，而SKOV 3 SP细胞的CFE6.0±1.0%(). 此外，SP细胞产生的菌落生长到每个微孔的80%以上，而MP组分形成的菌落在微孔中生长有限(图S6).
要评估体内SKOV3中SP和MP细胞的致瘤潜能，5×104将100µL PBS中的细胞皮下注射到裸鼠背部。注射SP细胞后8周，三只动物中有三只出现肿瘤生长，而注射等量MP细胞的动物当时没有发现肿瘤(). 为了阐明SP细胞是否能自我更新和生成MP细胞，分选的SP细胞和MP细胞在相同条件下分别培养8天，然后用Hoechst 33342染料保存并重新分析。结果表明，两种细胞系的SP细胞均能再生SP和MP细胞，但两种细胞株的MP细胞只产生MP细胞().
来自细胞系的SP细胞的验证以及GSI-IX抑制剂对SP细胞集落形成效率的影响。（A） 重组试验：SKOV3和A224细胞用Hoechst 33342染料染色，并根据SP和MP群体进行分类。将细胞培养8天进行重新繁殖，然后用流式细胞仪重新分析。这表明SP细胞富集（SKOV3和A224分别为22.5%和10.4%），具有再生MP细胞的能力。干细胞标记基因和转运蛋白基因的（B，C，D）qRT-PCR分析（p<0.01）。为了计算每个基因的相对表达，2-ΔΔCT方法是将三个看家基因（亲环素A、GUSB、GAPDH）的CT值平均为一个参考基因值。（E，F）GSI-IX对SKOV3分选SP和MP细胞集落形成效率的抑制作用。将细胞分为SP和MP群体，并用10和20µg GSI-IX处理。抑制剂载体DMSO用作对照。
SKOV3和A224细胞系SP和MP细胞中干细胞标记基因、转运体基因和CD标记的表达
通过qRT-PCR评估SKOV3和A224细胞系分选的SP和MP细胞中干细胞标记物（oct4和nanog）和ABC转运蛋白基因（ABCG2、ABCC4和ABCB1）的相对mRNA表达水平。与MP细胞相比，SKOV3和A224 SP细胞中与自我更新相关的基因nanog的表达升高。在SKOV3和A224 SP细胞中观察到oct4的边际上调(P<0.01) (). 评估三种不同ABC转运体（ABCG2、ABCC4和ABCB1）的表达水平。与MP对应物相比，SKOV3 SP细胞中ABCG2和ABCC4显著上调(). 在A224 SP细胞中发现ABCG2和ABCB1上调(图S7). 使用FACS评估CD标记。表中提供了SKOV3 SP和MP细胞上不同细胞表面标记的相对表达(表S3). 发现SP和MP细胞强烈表达肿瘤转移标记CD44。与MP细胞相比，SKOV3 SP细胞表现出CD24的强表达（基因编码唾液糖蛋白）。与SP细胞相比，SKOV3 MP细胞的CD117/c-kit表达更高。
γ-分泌酶抑制剂GSI-IX对SKOV3 SP和MP细胞的影响
使用γ-分泌酶基因特异性引物（PSENEN）的qRT-PCR鉴定出与MP对应物相比，SP群体中该基因的过表达具有统计学意义(图S8). 在分选的SKOV3 SP和MP细胞上评估γ-分泌酶抑制剂GSI-IX（Notch信号通路抑制剂）对集落形成效率的影响。SP细胞CFU效率降低70%(P（P） = 0.0102)在10µg GSI-IX中观察到。然而，在相同浓度下，MP细胞观察到边际减少，这在统计学上不显著(P（P） = 0.2567) (). 较高浓度的GSI-IX（20µg）对SKOV3 SP的抑制率为92%(P（P） = 0.0001)证明SP细胞对GSI-IX的剂量依赖性敏感性().
复发性卵巢癌患者表达数据库中SP基因特征的富集
据推测，干细胞（及其基因特征）将在复发性卵巢癌标本中富集。对12个样本（原发和复发）的6名患者的表达文件和各自的mRNA进行评估。使用qRT-PCR评估SP基因列表中随机选择的基因在原发性和复发性卵巢肿瘤样本上的表达水平。与原发肿瘤相比，所有被评估的基因在复发肿瘤中均过度表达。此外，根据肿瘤复发时间将肿瘤样本分为两组。第1组肿瘤复发时间为1至12个月，第2组为13至24个月。qRT-PCR数据显示，与第2组患者相比，第1组评估的所有基因的表达水平都很高(). 我们发现，第1组患者的SP细胞基因特征富集率为72%，而第2组患者的这一比例仅为39%。显示了单个患者的SP细胞富集数据。这些结果还进一步验证了晚期卵巢癌患者腹水中SP基因表达谱中潜在癌干细胞的富集。
卵巢肿瘤复发表达数据库中SP细胞特征的验证。（A，B）qRT-PCR验证复发性卵巢癌标本中的SP细胞基因特征。（A） 第1组肿瘤复发时间为1至12个月，第2组为13至24个月。（C） 复发性卵巢癌患者SP细胞基因签名的电子验证。
讨论
SP细胞是一种罕见的细胞群，最初用于鉴定造血干细胞，最近已用于富集各种组织类型的干细胞[24]，[43]为了专门针对SP细胞，必须阐明SP细胞的基本生物学知识以及SP细胞与其他细胞群之间存在的潜在差异。本研究报告了使用Affymetrix U133 Plus 2.0微阵列平台从患有高级晚期乳头状浆液性卵巢腺癌的女性新鲜腹水分离的SP中获得的SP细胞基因表达特征。阵列结果确定了438个独特的探针集，将SP群体与剩余的癌细胞（MP）区分开来(表S4). 对阵列结果的基因本体论分析表明，SP细胞基因与不同的生物学过程有关，包括凋亡、细胞周期、信号转导和细胞增殖，这与MP群体不同。为了验证患者样本的基因特征，并支持SP部分包含干细胞样细胞，我们提供了几行证据。1） 从患者SP基因列表中随机选择的基因（ADAM19、FPGT、ST3GAL6、LLGL1和TK2）在从细胞系分离的SP细胞上进行验证。2） 发现两个与干细胞相关的基因Nanog和Oct4在细胞系的SP细胞中过度表达。据报道，Nanog和Oct4是维持干细胞多能性和自我更新所需的转录因子[44].3）与MP细胞相比，从SKOV3和A224细胞系分离的SP细胞的集落形成效率提高的结果也证实了SP细胞中潜在的肿瘤干细胞的富集。CFE作为传代的一个函数，表明SP群体相对于MP的持续扩张能力。分选的单个细胞的集落形成能力与平板试验结果有良好的相关性。4） 与MP细胞相比，从SKOV3和A224细胞系分离的SP细胞的锚定非依赖性生长增加。5） 最后体内裸鼠体内的致瘤实验表明，SP细胞有可能以较低的数量启动肿瘤生长。
使用Pathway Studio 6.0对生物相关过程进行数据挖掘，发现SP细胞中与功能性癌症干细胞样表型相关的过表达基因。此外，SP基因在不同正常组织中富集了与干细胞特征相关的基因。SP中与正常干细胞功能相关的基因（NUP、ST3GAL、LTBP、KLF、TLE、NFAT、ATRX）上调。我们发现SP基因列表中EPHB4和EPHB2过度表达。EPHB4是一种跨膜受体酪氨酸激酶，最近被报道为一种新的卵巢肿瘤标记物和生物治疗的可行靶点[45]EPHB4的过度表达可能与抑制CASP8激活和随后CASP8介导的凋亡有关(). 也发现AKT1在SP细胞中上调，该基因可能通过多种途径抑制凋亡过程而参与细胞生存途径[46]，[47]，[48]，[49]，[50]凋亡途径的改变是肿瘤干细胞存活的已知机制之一[25].
组织干细胞使用多种信号通路来控制正常干细胞的自我更新，这些通路的放松可能会随着肿瘤干细胞的发展而产生肿瘤增殖[51]，[52]ADAM蛋白酶和早老素对Notch跨膜结构域的裂解对Notch通路的激活至关重要。ADAM蛋白酶被认为是具有多种功能的多域蛋白，参与其他跨膜蛋白的蛋白水解过程、细胞粘附和细胞信号事件。据报道，ADAM8、ADAM9、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17和ADAM28在各种癌症中过度表达[53]Notch受体的胞外区与N-聚糖和O-聚糖（包括岩藻糖和葡萄糖）糖基化。岩藻糖的转移由岩藻糖基转移酶（Pofut1）催化，岩藻糖可以用N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）延伸，然后用半乳糖和唾液酸延伸[54]岩藻糖在Notch信号传导中的重要作用首次在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中显示，这些细胞产生极少量的GDP-岩藻糖，这是Pofut1的底物[55]因此，参与GDP-岩藻糖合成的酶在Notch信号通路中也起着关键的调节作用。岩藻糖可以通过一种酶，即岩藻糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶（FPGT），通过挽救途径转化为GDP岩藻糖。然后，GDP-岩藻糖可以作为Pofut1的底物，将岩藻糖转移到Notch受体并随后激活Notch信号通路。ST3GAL6（ST3β-半乳糖苷α-2,3-唾液酰基转移酶6）催化唾液酸从胞苷5-单磷酸质体-N-乙酰神经氨酸转移到糖蛋白和糖脂的末端位置。Chen等人报道，细胞表面聚糖对人类造血干细胞和祖细胞的细胞信号转导至关重要[41]基于这些结果和在我们的SP基因列表中对这些基因（FPGT、ST3GAL6和ADAM19）的鉴定，我们确定了一种潜在的机制，它可能在SP细胞中起作用，解释了卵巢中SP细胞的存活、分化和肿瘤维持(). 图中显示了三种酶（FPGT、ST3GAL6和ADAM19）参与Notch信号通路的激活。这些酶的增加表达可导致转位到核酸酶的Notch胞内结构域的释放增加，在核酸酶中，Notch与转录复合物相互作用并激活下游靶基因。我们发现Notch靶基因槽口1，HES1型，NRARP公司和对外汉语教学5与MP组分相比，SP组分显著上调。这些结果表明SP和MP群体之间的Notch激活和信号传递存在差异。这些结果表明notch通路是卵巢癌的潜在治疗靶点。对特异性γ-分泌酶抑制剂（GSI-IX）的研究证明了Notch信号通路在卵巢SP细胞存活中的机制意义以及可能的治疗干预。
据报道，癌症干细胞在多种恶性肿瘤中有助于化疗耐药性和肿瘤进展[5]，[6]如果SP细胞富含干细胞样细胞，那么我们假设SP基因特征在复发迅速的肿瘤中显著。与原发肿瘤相比，在复发性卵巢肿瘤中发现SP细胞基因的富集。复发患者数据根据肿瘤复发时间分为两组（第1组患者复发时间为1-12个月，第2组患者复发12个月）。这一分组与铂敏感性有关[56]，[57]SP特征基因的百分比在早期与晚期复发的肿瘤中检测到的频率更高。这与快速复发的肿瘤含有更多SP细胞的概念有关。从SKOV3和A224细胞系分离的SP细胞显示出不同ABC转运体基因的表达高于其MP对应部分。据报道，这些转运体基因可以保护细胞免受化学毒剂和低氧条件的影响[58]，[59]当然，如上所述的Notch信号可能对肿瘤复发至关重要。据报道，卵巢癌中不同的细胞表面标记物与肿瘤干细胞特性相关[60]，[61]，[62]，[63]，[64]，[65]还评估了SP和MP群体之间细胞表面标记表型的异质性。
总之，报道了卵巢癌患者腹水中富含肿瘤干细胞样细胞的SP的表达谱。通过鉴定几个与干细胞相关的基因，包括激活的Notch信号通路，证明了SP基因特征的“干”性质。使用从人类卵巢癌细胞系中鉴定的SP群体对结果进行生物学验证。卵巢癌患者产生的SP基因列表也被发现在卵巢癌患者复发的肿瘤中丰富。这些结果对肿瘤复发和潜在的治疗方法具有重要意义。SP细胞对Notch通路抑制剂表现出剂量依赖性敏感性，提示Notch信号通路可能是卵巢癌的重要治疗靶点。
支持信息
图S1
腹水样本的CA125染色：CA125染色和FACS分析证实了从腹水和卵巢癌细胞系SKOV3分离的细胞来源于卵巢。
（文件）
图S4
SKOV3和A224细胞系的SP和MP细胞中FPGT表达的蛋白质印迹分析（如上）。ADAM19在A224 SP和MP细胞中的免疫荧光：A224细胞被分选为SP和MP，并在盖玻片上生长。取下组织培养基，用PBS冲洗两次。然后用4%对甲醛固定细胞12分钟，用PBS进行两次快速清洗。然后用1%Triton在0.02%BSA中的PBS中渗透细胞2分钟。然后将细胞与封闭血清（在PBS中含有2%BSA的20%热灭活血清）在室温下孵育20分钟。用PBS清洗细胞，用阻断肽（BP，ADAM19-P，SC-25989，Santa Cruz Biotechnology）培养对照细胞。细胞在室温下用一级抗体（ADAM19山羊plyclonal IgG，SC25989，Santa Cruz Biotechnology）染色2小时。用PBS清洗细胞三次，并在室温下对二级抗体（驴抗羊IgG-FITC，SC-2024，Santa Cruz Biotechnology）进行染色30分钟。细胞用PBS洗涤三次，用DAPI染色5分钟。SP和MP细胞ADAM19分别呈64±4%和33±5%的阳性染色。上述具有代表性的数字。
（文件）
图S5
A224和SKOV3 SP和MP细胞中Notch靶基因的表达水平。
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图S7
A224 SP细胞中转运体基因的表达水平。
（文件）
图S8
PSENEN在A224和SKOV3 SP和MP细胞中的表达水平。
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表S3
SKOV3 SP和MP上不同细胞表面标记的相对表达。
（文件）
脚注
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
基金：这项工作得到了美国国立卫生研究院（5R01CA142832-02 216288 2009A051746，1RC4CA156551-01 217168 2010A053125）对MJB的部分资助。PVH和DS得到了CDMRP-DOD（W81XWH-06-1-0422和W81XWH-09-1-0292）、Susan G.Komen for the Cure（BCTR 0600935）和波士顿儿童医院矫形外科基金会的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。本研究未收到额外的外部资金。
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