阻断刺猬信号抑制胰腺癌侵袭和转移：实体癌联合治疗的新范式

细胞生长分析

如前所述进行3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑啉（MTT）测定(9). 简而言之，每孔2000个细胞在含有0.5%FBS的100μL培养基中与6μmol/L环胺、溶剂或仅培养基孵育96小时。最后，添加20μL/孔CellTiter96溶液（普罗米加，麦迪逊，威斯康星州）1 h，并在Wallac-1420平板读取器上以490 nm的吸光度读取平板（马萨诸塞州波士顿珀金-埃尔默）。所有实验一式四份，以确定平均值和标准偏差。

RNA提取和实时逆转录PCR

使用转子-定子均质机（Polytron PT1200C，Kinematica，Newark，NJ）均质组织样品。在细胞培养皿中溶解细胞，并使用RNeasy Mini试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚市齐根）提取RNA。使用寡核苷酸-dT引物在42°C下使用SuperScript第一链系统（Invitrogen）逆转录RNA 50分钟。人或小鼠定量PCRGli1、Gli2、Ptch、巢穴、蜗牛、和E-钙粘蛋白在7300实时PCR系统上使用按需分析（Applied Biosystems，Foster City，CA）或Quantitect SYBR Green PCR试剂盒（Qiagen）进行。使用2（-ΔΔCt）方法确定相对折叠水平(10)，使用PGK1系列用作人类抄本的内务管理控制GUSB公司用于小鼠分析。

软琼脂分析

在六孔板中建立软琼脂分析，每个孔包含一层1%琼脂糖（Invitrogen）的底层，一层0.6%琼脂糖的中间层，包括10000个细胞，以及一层仅含培养基的顶层。在适用的情况下，用环胺或溶剂补充每个孔中的混合物，并将平板培养3周。接下来，向每个孔中添加1.5 mL 0.5%Wright染色溶液。在4°C孵育过夜后，通过超紫外线照明对菌落进行可视化，并使用分析软件QuantityOne（Bio-Rad，Hercules，CA）进行计数。

细胞凋亡测定

如前所述，使用Guava Multicaspase试剂盒（Guava Technologies，Hayward，CA）来测定细胞凋亡诱导(9). 简言之，在本试验中，细胞的门控发生如下：活细胞和非承诺性凋亡细胞，SR-VAD-FMK（−），7-AAD（–）；“早期”凋亡细胞：SR-VAD-FMK（+），7-AAD（−）；“晚期”凋亡细胞，SR-VAD-FMK（+），7-AAD（+）；“死”电池，SR-VAD-FMK（−或dim），7-AAD（+）。

细胞周期分析

药物治疗后，将细胞固定在70%乙醇中，用碘化丙啶染色，并根据制造商提供的标准协议在番石榴个人细胞分析系统（番石榴石技术公司）上进行分析。G中细胞的百分比₀-G公司₁、S或G₂-使用ModFitLT软件版本3.0（Guava Technologies）确定M期。

Gli1在HPDE细胞中的瞬时过表达

HPDE细胞(11)以每孔200000粒接种到六孔板上，第二天使用FuGene6转染试剂（印第安纳波利斯罗氏）每孔或空载体转染1μg pSR-α-GLI。

改良Boyden室侵入/迁移分析

如前所述，进行改良的Boyden小室分析以评估侵袭/迁移(12). 简言之，将20μg/孔的Matrigel（BD Biosciences，San Jose，CA）应用于孔径为8μm的24孔transwell板（BD Biosciences）上，并使其固化过夜。然后，添加培养基并将30000个细胞接种到每个孔中。在适用的情况下，添加环胺（6μmol/L）或溶剂。使用非Hh依赖性细胞系Panc-1和Hh依赖细胞系L3.6pl进行检测。E3LZ10.7细胞系不能用于本实验，因为尽管多次尝试，但无论是对照细胞还是处理细胞都无法越过Matrigel屏障。因此，使用L3.6pl细胞，其对环胺的生长抑制作用几乎相当。相反，通过瞬时转染Hh转录因子在HPDE细胞中异常激活Hh信号Gli1公司将平板在37°C下培养96 h，然后将底部的细胞固定在乙醇中并进行染色。对10个随机选择的显微镜视野中的细胞进行计数，并计算平均值和标准偏差。如前所述，将移植细胞归一化为活细胞团(13).

原位胰腺癌异种移植的产生及药物治疗

所有动物实验都符合约翰·霍普金斯大学动物护理和使用委员会的指导方针，动物的饲养也符合美国实验动物护理协会的指导方针。E3LZ10.7电池[5×10⁶将总体积为200μL的1/1（v/v）PBS/Matrigel]皮下注射到雄性CD1中数值/数值裸鼠（马萨诸塞州威明顿市查尔斯·里弗）。2至4周后，收集皮下肿瘤并切割成约1 mm的立方体³.外螺纹CD1数值/数值6至8周龄的无胸腺小鼠使用挥发性气体麻醉进行麻醉。通过肋下左侧约1 cm的切口打开腹部。在对脾脏和粘连胰腺进行可视化后，使用显微镜（马里兰州盖瑟斯堡Roboz外科器械公司）在胰腺内准备一个小口袋，将一块皮下肿瘤植入其中。胰腺切口用8-0尼龙单丝缝合线缝合，腹壁用6-0尼龙单丝线缝合，皮肤用伤口夹进行调整。

L3.6pl为10⁶将细胞重新悬浮在50μL PBS/Matrigel 1:1（v/v）混合物中，并直接注入小鼠胰腺。异种移植物植入后21天，通过超声波测量E3LZ10.7原位肿瘤体积（加拿大多伦多视觉超声公司Vevo660）。将携带E3LZ10.7原位异种移植物的动物分为四组，平均肿瘤体积相似，然后将其随机分为四组：(一)车辆；(b条)环丙胺，每日2次，每次25毫克/千克，经口灌胃；(c（c）)吉西他滨，每4天静脉注射100 mg/kg；和(d日)以上剂量的环胺加吉西他滨的联合治疗。将环帕明溶解在含有10%（w/w）2-羟丙基-β-环糊精（Sigma-Aldrich）的柠檬酸钠/磷酸盐缓冲液（pH 3）中，浓度为2.5 mg/mL；吉西他滨溶于0.9%氯化钠中。从初次异种移植物植入后21天开始，给药共30天。将50 mg/kg/d的环胺皮下注射在三油酸乙醇载体中，对L3.6pl荷瘤小鼠进行15天的治疗(6).

原发性肿瘤生长和转移的尸检和评估

药物治疗30天后，对小鼠实施安乐死；检查脾、肝、肾、肠、腹膜和肺是否有肉眼可见的转移，并将其保存在10%福尔马林溶液（Sigma-Aldrich）中进行组织学检查。将原发性肿瘤的样本snap冷冻在干冰上进行mRNA分析。除了宏观检查外，还对每只动物的肝脏、脾脏、肾脏、肺部和肠道的一个随机组织学切片进行显微镜检查，以确定是否存在微转移。如果肉眼检查怀疑淋巴结转移，则采集区域淋巴结并进行组织切片检查。

一系列原位L3.6pl异种移植物仅用于评估是否存在肝和腹膜转移。

异种移植物的免疫组织化学分析

用福尔马林固定、石蜡包埋的原位肿瘤样品制备显微镜载玻片，加热至60°C 1 h，用二甲苯脱蜡，并用一系列分级乙醇洗液进行水合。抗原检索通过在10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中微波加热10分钟来完成。内源性过氧化物酶活性在3%H中孵育10分钟后熄灭₂O（运行）₂用10%的血清阻断非特异性结合。然后在含有1%FBS的PBS中在4°C下过夜，用主要山羊抗人抗体[Shh（明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司）、Ptch和nestin（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）]探测切片。在用PBS洗涤两次后，添加二级抗体（1:250）1 h。再次用PBS冲洗两次载玻片，用Vectastain Elite Kit（Vector Labs，Burlingame，CA）和3,3′-二氨基联苯胺开发，并用h&E进行复染。

原发性和转移性胰腺癌标本

如前所述，原发性和转移性胰腺癌的匹配样本来自胰腺癌快速尸检程序(13). 简言之，这些组织是从患有晚期播散性胰腺癌的患者身上获取的，这些患者已同意在尸检后采集组织。共获得8对配对，包括肝、网膜、肺和淋巴结转移瘤以及相应的原发肿瘤。在组织病理学证实肿瘤细胞后，提取RNA进行逆转录-PCR（RT-PCR）分析。

醛脱氢酶活性的评价

在低血清条件下用环胺（6μmol/L）或溶剂培养3天后，根据制造商的说明，使用Aldefluor试剂（干细胞技术，加拿大温哥华）对细胞进行醛脱氢酶（ALDH）染色，并在FACSCalibur流式细胞仪（Becton Dickinson）上进行分析。与含有ALDH抑制剂二乙氨基苯甲醛的对照染色反应相比，通过计算显示更大荧光的总细胞百分比来量化ALDH阳性细胞。

Hh信号独立于增殖调节胰腺上皮的侵袭表型

已经确定了Hh信号对在体外生长时，我们想进一步剖析该途径是否对侵袭表型有影响，侵袭表型是衡量癌症传播的关键指标。在改良的Boyden小室实验中，经环胺处理的Hh-依赖性L3.6pl细胞的迁移细胞数量减少了500倍以上(P（P）<0.0001），且此现象与细胞生长抑制无关(图2天). 相比之下，环胺治疗对Hh-非依赖性细胞系Panc-1的侵袭性没有影响(图2天). 然后我们从相互作用的角度进行了这些分析（即通过异常过度表达Hh转录因子Gli1公司并测定这种异位表达对细胞生长和侵袭的影响）。我们首先确定，根据报告研究和靶基因表达（数据未显示），亲代HPDE细胞具有最小的内源性Hh活性。然后我们证实，与模拟转染细胞相比，HPDE细胞中异位Hh激活导致细胞生长增加(P（P）= 0.029;图3A类); 因此，入侵检测标准化为活细胞计数，以排除细胞数量增加对迁移的任何影响。与细胞生长无关，Gli1公司与模拟转染细胞相比，过度表达对96小时时HPDE细胞的侵袭特性具有深远而显著的影响(P（P）< 0.0001;图3B类)但没有引起任何形态学变化在体外（未显示）。

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图3

MTT分析显示，Gli1的短暂过度表达导致增殖增加(A类)和入侵/迁移(B类)在体外在永生化正常导管上皮细胞系HPDE中。实时RT-PCR显示，转录因子Gli1的瞬时过表达导致E-Caddherin的时间依赖性下调(C类). *, 与对照细胞相比，差异具有统计学意义。

环磷酰胺消除胰腺癌原位异种移植模型的转移并与吉西他滨协同作用

无胸腺小鼠对手术原位种植耐受性良好，肿瘤摄取率为100%。在30天的治疗过程中，未观察到环胺或吉西他滨在给定剂量下单独或联合使用的明显副作用或行为障碍，并且药物引起的四个治疗组之间的体重也没有差异(图4A类). 然而，D组（环胺+吉西他滨）中的七只小鼠中有一只在治疗12天后死亡，原因不明（无法进行尸检），因此，该组只分析了六只小鼠。虽然环磷酰胺组的原发肿瘤往往比对照组小，但治疗结束时通过原位肿瘤体积测量，环磷酰胺治疗并未显著抑制E3LZ10.7原发肿瘤的生长(P（P）= 0.097). 相反，与两种模拟治疗相比，吉西他滨抑制了原发性肿瘤的生长(P（P）<0.001）和环丙胺处理的动物(P（P）= 0.004). 与单独使用吉西他滨相比，联合使用环胺和吉西他宾治疗对抑制原发性肿瘤生长没有额外作用，但与单独使用环胺相比，显著降低了肿瘤生长(P（P）= 0.001;图4B类).

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图4

A、，在30天的治疗期间，单独使用载体、环丙胺、吉西他滨或吉西他宾与环丙胺联合治疗的小鼠体重没有差异。B、，治疗结束时原发性异种移植瘤的肿瘤大小。环磷酰胺组的肿瘤并不明显小于对照组。与载体或环胺相比，吉西他滨治疗导致平均肿瘤大小显著减小。在控制原发性肿瘤生长方面，环胺与吉西他滨联合治疗并不优于单独使用吉西他宾治疗。

虽然环胺治疗对E3LZ10.7原发性肿瘤的生长没有显著影响，但对肿瘤转移的影响是深远的(表1). 在系统治疗30天结束时，从宏观和组织切片上看，所有7只（100%）车用治疗的对照动物均出现远处转移(图5A类和B类); 具体而言，7只动物中有6只有脾脏转移，7只有4只有肝脏转移，3只有区域淋巴结转移，2只动物分别有腹膜和肾脏转移。相比之下，在治疗组B中，只有7只小鼠中的1只（14%）表现出组织学上可证实的肺微转移（仅限环胺），而在接受环胺和吉西他滨联合治疗的动物中，转移完全没有（D组）。在仅用吉西他滨治疗的小鼠（C组）中，7例中有3例转移到脾脏，7例有1例转移到区域淋巴结，但未发现转移到其他器官部位。

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图5

A、，原发性异种移植脾的远处转移(我)，肾脏(ii（ii）)和肝脏(三).B、，脾脏的组织学图像(我)，肾脏(ii（ii）)和淋巴结转移(三). 在一只接受环胺单药治疗的动物中，在组织切片中检测到肺微转移(iv（四）).C、，载体治疗异种移植瘤的组织学研究(我)，环胺(ii（ii）)，吉西他滨(三)或联合使用环胺和吉西他滨(iv（四）)治疗30d后。D、，原位胰腺癌异种移植中Hh靶基因的表达。车辆处理后巢蛋白的免疫组织化学(我)和经环胺处理的(ii（ii）)肿瘤组织。图中显示了小鼠和人类巢蛋白、补丁以及人类蜗牛的相对稳态mRNA表达。要点，均值；酒吧，SD.*，与对照组相比具有统计学显著性差异。

我们第一次使用原位注射技术的实验也显示了对另一种胰腺癌细胞系L3.6pl的异种移植瘤的转移抑制作用(补充表S1). 9只对照动物中有9只出现了肝转移（100%），9只对照病例中有4只出现了腹膜转移（44%），而环丙胺治疗的小鼠没有发现转移。

对照组和环胺处理的异种移植物在原发性E3LZ10.7肿瘤中没有明显的形态学差异。然而，在接受吉西他滨（含或不含环胺）的异种移植物中，组织学切片显示单个多形性癌细胞显著，而不是坏死肿瘤细胞的汇合片，以及残留基质细胞显著(图5C类). 与对照组和环丙胺治疗组动物之间缺乏组织学差异一致，Hh配体Shh和Hh受体Ptch的免疫组织化学表达没有差异，在两组动物中均观察到大量表达（数据未显示）。巢蛋白免疫组织化学，用于强调小鼠起源的肿瘤新生血管(14,15)，也显示环胺和对照组之间没有显著差异(图5天).

然后在四个治疗臂的主要异种移植物中检测各种药效学参数。小鼠巢蛋白在异种移植物的肿瘤新生血管中表达(14,15)而人类nestin分析有望检测肿瘤细胞内的任何nestin表达。定量RT-PCR分析显示，与对照组相比，接受吉西他滨治疗组（添加或不添加环胺）的小鼠巢蛋白mRNA显著下调，这与肿瘤新生血管减少相一致，而对照组和仅使用环胺组之间没有显著差异。在接受环胺治疗的两个治疗组中，人类巢蛋白水平均呈下降趋势；然而，由于样本数较小，且各样本之间的差异较大，这些差异没有达到统计显著性(图5天). 老鼠普奇反映基质成分中Hh表达的水平在治疗组中显示出表达降低的趋势；然而，由于在吉西他滨臂中也观察到这种减量，基于机制的意义尚不确定。我们没有发现人类表达的显著差异或趋势普奇(图5天); 同样，在小鼠和人类中也没有显著差异或趋势Gli1公司或Gli2公司mRNA（数据未显示）。在以下方面无显著差异蜗牛mRNA水平可以观察到，同样可能是因为所研究的样本数量太少(图5天).

Gli1在人胰腺癌转移瘤中过度表达

根据我们一贯的在体外和体内通过实验观察，将Hh信号与胰腺癌细胞的侵袭和转移能力相关联，我们检测了8个匹配的胰腺癌患者快速（“温热”）尸检获得的原发和转移样本。我们发现，与原发肿瘤相比，8个匹配转移灶中有4个（50%）的Gli1转录物显著过度表达(图6A类); snail转录物在4例研究病例中有3例过度表达（数据未显示）。

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图6

A、，在匹配的人类组织样本中，发现与8例研究病例中的4例原发肿瘤相比，转移性结节中Gli1 mRNA表达上调。B、，流式细胞术显示，经环胺治疗后，ALDH-high细胞减少了约3倍在体外(P（P）= 0.048). 具有类似结果的两个实验的代表性数据。C、，定量实时RT-PCR分析显示，与未分类细胞相比，流动分类ALDH-bright E3LZ10.7细胞中Gli mRNA过度表达。Ptch和E-cadherin的表达没有明显变化。*，P（P）< 0.05.

拨款支持：NIH授予了R01CA113669和R21DK072532，Sol Goldman胰腺癌研究中心，AACR-PanCAN奖（A.Maitra），以及德国学术交流服务（DAAD）Postdoc-Programme（G.Feldmann）的奖学金。

我们感谢Infinity Pharmaceuticals（马萨诸塞州剑桥）对环胺的慷慨捐赠。