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公共科学图书馆一号。2011; 6（3）：e17918。
2011年3月21日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0017918
预防性维修识别码：项目经理3061867
PMID：21445297

Bmi-1沉默增强卵巢化疗反应癌症

王恩峰，1 桑吉布·巴塔查里亚，1 安娜玛丽亚·萨博尔茨，1 克里斯蒂安·罗德里格斯·阿瓜约，5 尼古拉斯·B·詹宁斯，2 加布里埃尔·洛佩斯·贝雷斯坦，三，4，5 普里亚布拉塔·穆克吉，1 阿尼尔·K·苏德，2，三，4和Resham Bhattacharya公司1，*
苏吉特·巴苏，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

毫无疑问，卵巢癌对于患有卵巢癌的患者来说是一种令人烦恼且无法治愈的疾病复发性癌症和治疗选择有限。尽管多梳群体基因，B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1调节正常人的自我更新干细胞和祖细胞与许多人类的发病机制有关然而，Bmi-1在影响化疗反应中的作用尚不明确之前已解决。这里我们证明沉默Bmi-1可以减少细胞内谷胱甘肽水平，从而使耐药卵巢癌增敏细胞转为化疗药物，如顺铂。通过加剧ROS生产对顺铂的反应，Bmi-1沉默激活DNA损伤反应途径、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶和裂解PARP导致细胞凋亡卵巢癌细胞。在一个体内原位小鼠模型纳米脂质体介导Bmi-1基因敲除对化疗耐药的卵巢癌显著抑制肿瘤生长。虽然顺铂单药治疗无效，Bmi-1沉默与顺铂联合几乎完全废除卵巢肿瘤生长。这些发现共同确立了Bmi-1是一种化疗耐药卵巢癌治疗的重要新靶点。

介绍

卵巢癌在所有妇科恶性肿瘤中死亡率最高[1]。尽管如此外科减瘤和一线铂/紫杉烷化疗的初始反应，大多数肿瘤最终会出现耐药复发[2]，[3]证据表明顺铂耐药可能是凋亡程序缺陷的结果。在这个在这种情况下，需要增加DNA损伤水平来诱导信号启动细胞凋亡[4]，[5].

B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1，一个多梳组基因，调节增殖活性正常干细胞和祖细胞[6].对于神经的自我更新[7]，[8]和造血干细胞[9].Bmi-1经常包括卵巢癌在内的多种癌症中的上调及其相关性随着临床分级/分期的增加，淋巴结转移和预后较差报道[10]，[11]，[12]，[13]，[14]，[15]，[16]，[17]，[18]，[19].B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1导致淋巴细胞发生肿瘤转化与H-Ras协同作用引起小鼠转移性乳腺癌[20]，[21]，[22]，全部强烈提示上皮性恶性肿瘤的致癌作用。此外，与对照组相比，分离的卵巢癌干细胞表现出高得多的Bmi-1水平分化或亲代大体积肿瘤细胞，对顺铂和紫杉醇与肿瘤细胞的比较[23]此外，增加的表达Bmi-1是决定细胞表型的关键调节因子之一通过在广泛的耐药临床致命恶性肿瘤[24]尽管关于Bmi-1在影响化疗反应中可能起作用的信息之前已解决。在这种情况下，确定Bmi-1的机制沉默使癌细胞对顺铂敏感对于开发新的治疗策略来对抗卵巢癌。

卵巢癌中最活跃的化疗药物是铂类似物，顺铂和卡铂。顺铂的抗肿瘤活性（顺-二氨基二氯磷灰石（II）是罗森博格及其同事于年发现的1961[25].顺铂是治疗卵巢癌最有效的药物过去40年，卵巢癌患者的预后可通过肿瘤对顺铂的反应[26]虽然大多数卵巢癌患者对一线铂类联合化疗有反应，大多数会发展对顺铂产生耐药性并最终死于病[26].因此预防或克服顺铂耐药性的方法对防治这种疾病的影响。

我们在这里证明了这一点B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1在以下方面发挥着重要作用卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性。我们也证明了这一点这种敏化是通过Bmi-1调节的一种新途径，即反应性氧物种（ROS）诱导引起DNA损伤反应（DDR）的参与导致细胞凋亡的途径。我们还将Bmi-1确立为有效的治疗靶点体内使用易于翻译的纳米脂质体方法将siRNA导入卵巢癌原位小鼠模型。

结果

敲除Bmi-1增强体外顺铂敏感性

我们之前已经证明卵巢癌中Bmi-1蛋白水平的降低使用微小RNA 15a/16的细胞减少克隆生长和增殖[27].在这里，我们想测试Bmi-1的敲除是否影响顺铂介导的卵巢癌细胞凋亡。A-2780和A-2780中Bmi-1的高效击倒通过与转染的打乱对照相比，证实了CP-70细胞48小时后的细胞(图1).将siRNA转染的细胞用顺铂处理48小时，然后进行凋亡通过Annexin/FITC方法测定。化疗敏感性A-2780的细胞凋亡用5或单独使用10 uM顺铂。相反，细胞凋亡当用10或20μM治疗时，耐药CP-70为-17%和40%顺铂单独使用分别表明这些细胞对顺铂诱导细胞凋亡(图。1). 顺铂对Bmi-1沉默细胞的重要治疗作用通过以下途径持续增强两种细胞系的凋亡∼15–20% (图。1). 对于这两种细胞系，凋亡的基础水平决定了未经任何治疗者为～10%。三种细胞凋亡实验其他细胞系如OVCAR-5、OV-202和OV-167产生了类似的结果（未显示数据）。这些数据证实了Bmi-1的敲除可以使卵巢癌细胞对顺铂诱导的细胞死亡。

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Bmi-1敲除通过以下途径使卵巢癌细胞对顺铂敏感ROS途径。

顶部面板显示了siRNA在卵巢癌细胞系（SC = 加扰控制siRNA）。底部面板显示Annexin/FITC-PI染色测定的细胞凋亡百分比。卵巢用干扰对照或Bmi-1 siRNA转染的癌细胞接受或不接受顺铂治疗48小时。进行NAC预处理适当情况下，在添加顺铂前1小时。

最近，有报道称神经元、胸腺细胞和骨髓细胞从Bmi-1缺失小鼠中分离的ROS水平比野生型小鼠增加相对应的人[28]，[29]此外，研究报告称其参与顺铂介导的细胞凋亡中ROS的产生[30]，[31]因此，要确定如何沉默Bmi-1使耐药卵巢癌细胞对顺铂敏感诱导细胞凋亡，我们研究了ROS的可能参与。因此，Bmi-1或干扰控制siRNA转染卵巢癌细胞用1 mg/ml的N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理1 h，然后顺铂治疗48小时。顺铂介导的显著抑制在对照细胞和Bmi-1敲除细胞中观察到凋亡活性氧清除剂NAC(图。1). 这些数据表明，在顺铂处理的Bmi-1沉默细胞是由于ROS的参与和诱导我们将确定ROS生产作为下一个逻辑步骤。

敲除Bmi-1增加顺铂介导的活性氧生成

接下来，我们测定了干扰对照或转染Bmi-1 siRNA的ROS生成通过使用DCFDA测量荧光，对接受或不接受顺铂治疗的细胞进行检测。单用顺铂治疗后10 uM时ROS生成显著增加A-2780细胞，CP-70细胞在10和20μM时。在两个细胞系中，顺铂治疗后Bmi-1的敲除显著增加ROS生成(图2).这些数据证实了我们之前对细胞凋亡的观察，并假设ROS为卵巢癌细胞对顺铂。为了确定ROS恶化的原因观察细胞凋亡，然后测定细胞内总谷胱甘肽（GSH）水平。

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Bmi-1敲除增加顺铂介导的ROS生成卵巢癌细胞。

干扰对照或Bmi-1 siRNA转染卵巢癌细胞用或不用顺铂处理24小时在新鲜HBSS中与5µM羧基H2DCFDA孵育30分钟37°C时。用胰蛋白酶和荧光采集细胞在485nm的激发波长和使用Fluorolog 3（Jobin-Yvon Horiba），发射波长为530 nm。平均荧光强度（MFI）与未处理样品的比值表示加扰控制。

Bmi-1调节谷胱甘肽的生产

还原的谷胱甘肽是细胞抗氧化网络的关键组成部分直接参与清除活性氧和维持其巯基蛋白还原态[32]，[33]，[34]从而确定ROS增加的原因在Bmi-1沉默细胞中观察到介导的凋亡，接下来我们测定了总的细胞内谷胱甘肽水平。裂解物是用打乱的对照品或Bmi-1制备的siRNA转染细胞经顺铂或不经顺铂处理。Bmi-1的拆除单独使用可显著降低细胞GSH水平（A-2780和～40%（CP-70），当与顺铂治疗（A-2780为～45%，CP-70为～56%）(图3). 顺铂然而，单独治疗对谷胱甘肽水平没有影响。这些数据表明至少在Bmi-1中观察到一些氧化应激介导的效应击倒卵巢癌细胞是由于细胞内GSH水平降低。

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Bmi-1敲除干扰GSH生物合成途径。

顶部面板表示测得的总细胞谷胱甘肽(材料和方法)卵巢内用干扰对照或Bmi-1 siRNA处理的癌细胞转染使用或不使用顺铂24小时。底部面板代表褶皱基因表达的变化（用β肌动蛋白标准化，与卵巢定量RT-PCR测定的打乱对照用干扰对照或Bmi-1 siRNA转染癌细胞48小时。

进一步研究Bmi-1沉默细胞中谷胱甘肽含量降低的原因接下来，我们确定了参与GSH生物合成途径发生改变。我们进行了定量RT-PCR测定谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GCLM）和Bmi-1 siRNA转染卵巢癌细胞中的谷胱甘肽合成酶（GSS）线。谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCLM）是谷胱甘肽生物合成途径[35]。在第二步中，谷胱甘肽合成酶（GSS）将γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸转化为谷胱甘苷[35].虽然Bmi-1沉默的细胞中Bmi-1的mRNA表达如预期的那样降低，有趣的是，GCLM的mRNA表达显著降低，而GSS的mRNA则显著降低增加(图3). 这个这两种卵巢癌细胞系的趋势相似。这些结果表明GCLM的扰动，速率限制酶足以减少总细胞GSH水平和随后GSS mRNA水平的倍数增加代表细胞试图释放氧化的防御机制强调。

Bmi-1调节DDR途径

进一步研究ROS介导的细胞凋亡增强机制我们想检测Bmi-1沉默卵巢癌细胞中的顺铂参与DNA损伤和修复（DDR）途径。以前的研究有据报道，氧化应激可触发DDR通路的激活[36].按顺序为了测试这一点，我们测定了Chk2和H2AX的磷酸化水平，这两个重要的DNA损伤和DDR通路激活的生物标记物[37].单用顺铂治疗可诱导大鼠脑内Chk2和H2AX的磷酸化浓度依赖性方式和Bmi-1的敲除进一步加剧了这种情况效果(图4A). 在证实，53 BP1观察到核病灶形成增加顺铂对CP-70 Bmi-1敲除细胞免疫荧光的影响(图4B). 这些结果表明Bmi-1击倒耦合后产生的持续活性氧水平顺铂治疗足以直接破坏DNA并参与DDR途径。大量文献支持DNA损伤可能导致caspases激活引起的细胞凋亡[38]，[39]因此，我们接下来继续测定Bmi-1沉默卵巢癌中caspase的激活用或不用顺铂处理的细胞。

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Bmi-1基因敲除增强顺铂中DDR通路的参与治疗过的卵巢癌细胞。

（A） 干扰对照或Bmi-1转染卵巢癌细胞用或不用顺铂处理siRNA 48小时对磷酸化Chk-2、总Chk-2，磷酸化H2AX，总H2AX和β肌动蛋白使用各自的抗体。（B） 加扰控制或Bmi-1对siRNA转染的CP-70细胞进行共聚焦显微镜观察用53BP1抗体（红色）和DAPI（蓝色核染色）显示核病灶形成。

Bmi-1调节细胞凋亡效应物

已建立的细胞凋亡介质包括胱天蛋白酶[40]。我们下一步决定对照干扰或Bmi-1 siRNA中caspase 8和caspase 9的裂解用或不用顺铂处理的转染细胞。单用顺铂治疗导致caspase 8断裂，但caspase 9没有断裂。似乎较高的可以观察到caspase9的顺铂裂解浓度。重要的是然而，联合Bmi-1敲除和顺铂治疗显著并且caspase 8和caspase 9在两种细胞中的裂解均呈剂量依赖性增加细胞系(图5).

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Bmi-1敲除对凋亡标记物的影响。

干扰对照或Bmi-1 siRNA转染卵巢癌细胞用或不用顺铂治疗48小时使用各自的抗体。

PARP是活化半胱天冬酶和裂解PARP的主要切割靶点之一促进细胞分解，并作为细胞经历细胞凋亡[40]在Bmi-1敲除细胞中，PARP的清晰分裂为顺铂剂量依赖性观察(图5). 所有这些在里面体外数据表明，顺铂治疗Bmi-1基因敲除细胞通过增加活性氧的产生来增强凋亡，导致DDR途径和激活半胱天冬酶。接下来，我们继续确定沉默Bmi-1对原位化疗耐药小鼠的治疗作用卵巢癌模型。

敲除Bmi-1提高体内顺铂敏感性

接下来通过以下方法测试Bmi-1的治疗潜力体内使用DOPC传递Bmi-1 siRNA（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）纳米脂质体的原位研究CP-20小鼠模型。这种输送方法已被广泛描述之前用于击倒持续时间，并且已经证明缺乏非特异性炎症反应[41]，[42].模拟先进的小体积处理肿瘤细胞注射后1周开始治疗。小鼠分为以下四组（n = 每只10只小鼠组）：（a）对照siRNA-DOPC（150µg/kg i.p.每周两次），（b）对照siRNA-DOPC+顺铂（每周160微克/小鼠腹腔注射），（c）Bmi-1siRNA DOPC（150µg/kg，每周两次腹腔注射）和（d）Bmi-1 siRNA DOPC+顺铂（剂量与个别治疗相同）。所有的动物都是治疗4周后处死。高效击倒Bmi-1（～85%）首先通过RT-PCR确认(图6A). 仅用Bmi-1 siRNA治疗与对照组相比，肿瘤重量显著减轻（～60%）对照siRNA组。Bmi-1 siRNA与顺铂联合治疗导致肿瘤重量比单纯顺铂治疗组(图6B). 为了进一步评估这种效果测定各组形成的结节。联合治疗再次显示与对照组相比，最大疗效为肿瘤结节减少约70%单纯顺铂治疗组(图。6亿). 在治疗期间，未发现动物有明显毒性通过行为、饮食习惯和活动能力的变化来评估实验。两个治疗组的平均体重也相似（数据不一致如图所示）。

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Bmi-1基因敲除对原位化疗耐药卵巢癌的影响增长。

为了评估siRNA治疗对肿瘤生长的影响，治疗方法为静脉注射后1周开始（1.0×106CP20）第页，共页肿瘤细胞。小鼠被分为四组（n） = 每组10只小鼠）：（a）对照siRNA-DOPC（每周两次150µg/kg i.p.），（b）对照siRNA-DOPC+顺铂（每周160微克/小鼠腹腔注射），（c）Bmi-1 siRNA-DOPC（150µg/kg i.p.每周两次），和（d）Bmi-1 siRNA-DOPC+顺铂（剂量与个别治疗相同）。继续治疗直至肿瘤接种后4周处死。（A） 总RNA从部分肿瘤组织中分离并进行RT-PCR使用Bmi-1和β肌动蛋白引物。比较级Ct吨方法用于计算比较的信使核糖核酸的相对丰度β肌动蛋白表达。实验是在使用双面学生t确定三份和显著性经检验，P<0.05具有显著性。（B） 小鼠和肿瘤重量和（C）使用学生t检验（用于两组的比较）。双尾P≤0.05被认为具有统计学意义。

Bmi-1基因敲除对体内增殖和凋亡的影响

为了证实我们的在体外我们接下来研究的数据是Bmi-1击倒体内肿瘤细胞增殖和Ki67和TUNEL染色检测细胞凋亡。Bmi-1 siRNA联合治疗顺铂表现出最大的疗效与对照未治疗组相比的增殖(图7). 类似地，一个近似值联合治疗组细胞凋亡增加80%与对照组相比(图7). 因此，我们证明卵巢癌细胞中Bmi-1的沉默是否在体外或体内增加顺铂引起的细胞凋亡。

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Bmi-1的敲除导致增殖减少和增加卵巢肿瘤细胞凋亡体内.

（A） Ki67和（B）TUNEL的免疫组织化学染色用于评估细胞增殖和凋亡。原稿放大200倍。量化以图形方式显示在右侧。治疗臂使用Student t检验进行比较，认为P≤0.05具有统计学意义。

讨论

毫无疑问，卵巢癌对于复发患者来说是一种令人烦恼、无法治愈的疾病癌症和治疗选择有限[1]，[43]这里我们演示Bmi-1基因沉默是一种有效的选择，与顺铂联合使用可增强治疗效果更进一步。此外，我们描述了增加敏感性主要通过ROS生产。一线化疗卵巢癌涉及铂/紫杉烷方案的使用，众所周知诱导活性氧生成。我们假设Bmi-1的敲除在与此方案的联合治疗。在这方面，最近的一份报告证明Bmi-1在早期被招募到双链断裂现场电离辐射损伤[44].我们的结果证实并扩展了这一观点证明在体外和体内Bmi-1沉默与氧化应激增加协同作用，导致DNA积累损伤和凋亡。

之前至少有两篇论文证明神经元中ROS水平升高，从Bmi-1缺失小鼠中分离出胸腺细胞和骨髓细胞[28]，[29]然而，ROS的原因这种产生被不同程度地归因于p53依赖性和独立性抑制抗氧化基因表达或线粒体能量学受损[28]，[29]。我们在这里展示除这些途径外，Bmi-1还通过调节参与谷胱甘肽生物合成途径的酶的转录。尤其是GCLM的转录受转录因子如Nrf-1的正向调节和NFκB。在Bmi-1敲除的背景下，这两种转录因子分别在神经元和胶质瘤细胞中下调[28]，[45]。因此，有可能Bmi-1沉默导致卵巢癌中Nrf-1和/或NFκB下调细胞，从而降低GCLM的转录，导致GSH合成减少。重要的是，我们表明Bmi-1通过调节ROS和GSH水平保护化疗损伤的卵巢癌细胞。

DNA损伤反应途径可以被基因毒性应激激活，例如由化学治疗和DNA氧化损伤引起。事实上，DDR的激活可以导致细胞周期进程暂停、衰老或凋亡。根据我们发现Bmi-1敲除和顺铂治疗，已知会导致DNA中的双链断裂随着活性氧的产生，卵巢癌细胞的凋亡阈值由诱导i）Chk2和H2AX的磷酸化，ii）通过53BP1和凋亡标记物的裂解，如iii）半胱天冬酶和PARP。

正如我们在体内实验，击倒由于以下原因，Bmi-1可能在临床环境中有用；a）Bmi-1下调增强顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡细胞。b） Bmi-1是干细胞自我更新和维护所必需的，包括定义为对化疗药物耐药的卵巢癌干细胞[23].c）Bmi-1调节多种途径，其中最突出的是端粒酶的诱导导致乳腺上皮细胞永生化[46].d）下调Bmi-1导致ink4a的去表达，它编码肿瘤抑制因子p16Ink和p19Arf调节衰老和凋亡[47].这些途径的激活被称为重要的肿瘤抑制屏障，因为这些途径作为受损细胞增殖或繁殖的有效抑制剂。e） 在此外，我们假设顺铂和Bmi-1作用于影响线粒体功能和/或ROS生成增加导致DNA损伤从而有效诱导细胞凋亡。DNA损伤程度增加增加启动凋亡的信号。因此，Bmi-1是一个重要的新靶点化疗耐药卵巢癌和其他恶性肿瘤的治疗以Bmi-1过度表达为特征。

材料和方法

试剂

Bmi-1抗体来自美国加利福尼亚州的Zymed来源：Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich，St.Louis，MO.Phospho-H2AX，Phospho-Chk-2，53BP1裂解的caspase-8、caspase-9和PARP抗体来自细胞信号马萨诸塞州Technologies Inc.。Annexin/FITC-PI凋亡试剂盒来自Biovision Inc。

细胞培养

A-2780和CP-70细胞在含有10%FBS和1%的RPMI中生长抗生素（青霉素/链霉素），根据供应商的建议。CP-20细胞系是根据我们之前的公布的程序[48].

SiRNA转染

卵巢细胞A2780或CP-70在各自的培养基中生长一个转染前一天。使用低聚体胺转染细胞25 nM干扰对照或Bmi-1 siRNA。48小时后处理细胞western blot或凋亡检测[49].

西部印记

采集的卵巢癌细胞，无论是经过处理的还是未经处理的，均在PBS中清洗并在冰镇放射免疫沉淀（RIPA）缓冲液中溶解，添加新的0.01%蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma）并在冰上培养30分钟。通过13000 rpm离心10分钟4℃，上清液（30–50µg蛋白质）在SDS-页面[49].

活性氧测定

干扰对照或Bmi-1转染卵巢癌细胞系siRNA用顺铂处理24小时。用HBSS洗涤后，细胞用5µM羧基-H2DCFDA培养（Invitrogen，Carlsbad，CA）[50]在里面37°C下新鲜HBSS 30分钟。清洗掉过多的探针。电池用胰蛋白酶采集并测量标记细胞的荧光在485nm的激发波长和530nm的发射波长下荧光3（Jobin-Yvon Horiba）。实验重复了三次平均荧光强度[50]已录制。使用双侧Student t检验确定统计显著性，P<0.05为显著性。

细胞凋亡测定

干扰对照或Bmi-1 siRNA转染卵巢癌细胞48小时用顺铂再治疗48小时加顺铂前1h应用。细胞受到利用FACSCalibur流记录Annexin-FITC/PI染色和荧光细胞仪（Becton-Dickinson）。实验一式三份用双侧Student t检验确定显著性，P<0.05为被认为是重要的。

谷胱甘肽含量测定

根据制造商的方案（Cayman化学品）。简单地说，卵巢癌细胞系转染了干扰对照或Bmi-1 siRNA用顺铂处理24小时通过超声处理裂解细胞，并通过以下方式收集在50mM磷酸盐缓冲液中在4°C下以10000 g离心15分钟。接下来是裂解物使用TEAM试剂和根据通过测量405nm 25处的吸光度同时生成的标准曲线添加分析鸡尾酒后min。实验一式三份采用双侧Student t检验确定显著性，P<0.05为被认为是重要的。

实时PCR

使用TRIzol试剂（Invitrogen）从转染细胞中分离出总RNA。RNA首次使用TaqMan®逆转录试剂盒进行逆转录（Applied Biosystems），然后使用TaqMan®进行实时PCRSYBR Green Master Mix（应用生物系统）。人类Bmi-1、GCLM、，GSS和β肌动蛋白来自马里兰州弗雷德里克SA BioscienesC类t吨方法用于计算mRNA的相对丰度与β肌动蛋白表达的比较[51]。实验是一式三份，用双面测定显著性学生t检验，P<0.05被认为具有显著性。

脂质体siRNA制备

对于体内递送，如前所述，将siRNA并入DOPC[48].简单地说，siRNA和DOPC以1∶10（w/w）siRNA/DOPC的比例混合在过量的叔丁醇。吐温20以1∶19（吐温20:siRNA/DOPC）。涡流后，混合物被冻结在丙酮/干冰浴和冻干。在体内给药之前用0.9%的盐水将混合物水合至25每次注射使用µg/mL和200µL混合物。

卵巢癌原位模型

雌性无胸腺裸鼠（NCr-nu）购自美国国家癌症研究所弗雷德里克癌症研究与发展中心研究所（Frederick，MD）。全部小鼠被安置并维持在特定的无病原体条件下美国实验室认证协会批准的设施动物护理（Acuf#12-02-18233），并符合现行法规和美国农业部、美国卫生部和公共服务和NIH。所有研究均由德克萨斯大学M.D.安德森癌症中心机构动物护理和使用委员会。所有小鼠在8至12周龄时用于这些实验旧的。

注射前，用PBS清洗肿瘤细胞两次，分离0.1%冷EDTA，离心7分钟，并在HBSS（Invitrogen）中重组。单元格通过台盼蓝排斥试验证实其活性。肿瘤是由i.p.注射1.0×106CP20细胞。一旦成立，这个肿瘤模型反映了晚期卵巢癌的生长模式[42].

为了评估siRNA治疗对肿瘤生长的影响，开始治疗1腹腔注射肿瘤细胞后第周。小鼠被分为四组（n） = 每组10只小鼠）：（a）对照siRNA-DOPC（150µg/kg i.p.每周两次），（b）对照siRNA-DOPC+顺铂（160μg/小鼠i.p.周），（c）Bmi-1 siRNA-DOPC（150μg/kg i.p.两次每周），和（d）Bmi-1 siRNA-DOPC+顺铂（剂量与个人相同治疗）。治疗持续到肿瘤接种后4周。在牺牲时间、小鼠体重、肿瘤重量、结节数量以及记录肿瘤的分布。组织样本被快速冷冻以供溶解制备或固定在福尔马林中用于石蜡包埋。做过的人尸检、肿瘤采集和组织处理均不了解治疗组分配。

免疫组织化学

Ki67和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端采用福尔马林固定石蜡包埋法进行标记（TUNEL）染色肿瘤切片（8µm厚）如前所述[48]简单地说，在去亲和力和再水化后，使用微波中的柠檬酸缓冲液（0.1 mol/L；pH 6.0）。内源性过氧化物酶和用3%过氧化氢/甲醇封闭非特异性表位12分钟5%正常马血清和1%正常山羊血清维持20分钟。切片与初级抗Ki67在4°C下孵育过夜次级辣根过氧化物酶结合抗体（Serotec Bioproducts）在室温下保持1小时。辣根过氧化物酶用3,3′-二氨基联苯胺（Phoenix Biotechnologies）底物5分钟，清洗，并用吉尔的3号苏木精（Sigma-Aldrich）复染15秒并安装。

为了量化细胞凋亡，我们对8-µm厚的细胞进行了TUNEL染色如前所述的石蜡包埋肿瘤载玻片[48]简单地说，之后用蛋白酶K（1∶500）和阳性对照玻片用DNase处理。内源过氧化物酶活性在甲醇中用3%H2O2封闭。用TdT缓冲液冲洗后（30 mmol/L Trizma，140 mmol/L.二甲氨基甲酸钠，1 mmol/L-氯化钴），载玻片与末端转移酶孵育（1∶400；罗氏诊断公司）和生物素16-dUTP（1∶200；罗氏诊断），并用2%封闭牛血清白蛋白。然后将载玻片与过氧化物酶链霉亲和素孵育（1∶400）37°C下40分钟，用3,3′-二氨基联苯胺显色剂，并用Gill’s进行复染苏木精。凋亡和增殖指数由五个随机选择的高功率场中的阳性细胞数（不含）坏死区域。为了量化Ki67表达和凋亡细胞阳性细胞（3,3′-二氨基联苯胺染色）10个放大倍率为100倍时的随机0.159 mm2场。所有染色均被量化由两名调查人员盲目进行。

统计分析

所有值均表示为平均值±SD。统计显著性为使用双侧Student’s t检验确定，且P值<0.05（*）被认为是重要的。

对于动物实验，每个治疗组分配10只小鼠。判断对于建议的实验，我们考虑了双向方差分析模型。对于1.3的效果大小（固定效果和剩余SD的比率）样本大小足以为测试提供80%的功率显著性水平为0.05。小鼠和肿瘤重量以及肿瘤数量使用Student t检验（对于两组的比较）。使用统计分析进行统计分析Windows版社会科学12.0软件包（SPSS，Inc.）。双尾P≤0.05被认为具有统计学意义。

致谢

我们感谢Jim Tarara（光学形态学核心）在共焦方面的帮助成像。

工具书类

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文章来自PLOS ONE系列由以下人员提供多环芳烃