《美国病理学杂志》。2010年2月；176(2): 699–709.
肿瘤蛋白Bmi-1通过激活IKK-核因子-κB通路对胶质瘤细胞产生凋亡抵抗
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李军（Jun Li）
来自生物化学系*和微生物学，†中山医学院热带病防治重点实验室，‡中山大学教育部，广州，中国；华南肿瘤学国家重点实验室，§中山大学肿瘤中心，广州，中国；以及癌症研究所和病理学系，¶宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学
李云功
来自生物化学系*和微生物学，†中山医学院热带病控制重点实验室，‡中山大学教育部，广州，中国；华南肿瘤学国家重点实验室，§中山大学肿瘤中心，广州，中国；以及癌症研究所和病理学系，¶宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学
李炳松
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李丽江
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刘立平
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吴菊英
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Jie Yuan先生
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蔡俊超
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绵河
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王岚（Lan Wang）
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曾穆生（Musheng Zeng）
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史元成
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李梦峰
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摘要
恶性胶质瘤的特征之一是对细胞毒性试剂诱导的细胞凋亡产生异常抵抗。Bmi-1是一种癌蛋白，与包括胶质瘤在内的各种人类癌症的发生和癌症进展有关。然而，Bmi-1抗凋亡功能的机制仍不清楚。在本研究中，我们报道了Bmi-1通过核因子-κB（NF-κB）对胶质瘤细胞产生凋亡抵抗。在胶质瘤细胞中，Bmi-1的异位表达通过减少活化的caspase-3和PARP，以及诱导Bcl-X，显著抑制阿霉素、BCNU或紫外线照射诱导的凋亡L（左）Bmi-1的细胞耗竭增强了神经胶质瘤细胞对阿霉素、BCNU或紫外线照射诱导的细胞凋亡的敏感性。Bmi-1通过刺激IκB磷酸化、核转位、NF-κB转录活性以及NF-kb B下游基因（包括caspase-3、PARP、Bcl-X）的表达来激活NFκBL（左）和c-Myc。抑制IKK-NF-κB通路可消除Bmi-1对胶质瘤细胞的抗凋亡作用。在高级别胶质瘤中，Bmi-1和NF-κB在细胞核中共同表达。Bmi-1的上调也与胶质瘤患者的肿瘤进展和不良生存相关。总之，我们的数据表明Bmi-1通过IKK-NF-κB通路对胶质瘤细胞产生凋亡抵抗，并提示Bmi-1是胶质瘤预后的有用指标。
恶性胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发肿瘤。组织病理学上，高级别胶质瘤的特征是细胞密集、细胞和核形态多形，包括显著的多核、广泛的血管增殖和血管生成、瘤内坏死以及周围脑实质的弥漫性浸润。1此外，胶质瘤对放射和化疗等导致细胞死亡的治疗也有很高的抵抗力。尽管神经外科、放射治疗和旨在开发靶向和改进传统疗法的临床试验取得了技术进步，但由于其固有的侵袭性和对细胞凋亡的潜在抵抗力，这些恶性肿瘤几乎无法治愈，肿瘤复发率很高。患有这种致命疾病的患者的平均生存时间只有9至12个月。2此外，胶质瘤形成和发展过程中具有多个基因突变的复杂分子特征使得识别整合基本胶质瘤病理生理过程的关键靶点极具挑战性。三在临床上，迫切需要进一步了解神经胶质瘤细胞获得凋亡抗性的分子基础，并确定新的靶点，以开发治疗恶性神经胶质瘤的方法。
恶性胶质瘤细胞强烈的凋亡抵抗与多种信号通路的失调有关，包括受体酪氨酸激酶介导的信号通路和PTEN-PI3K-Akt-mTOR通路的激活。三最近的证据表明，核因子κB（NF-κB）介导的信号通路在很大比例的高级多形性胶质母细胞瘤（GBM）和胶质瘤细胞系中也被组成性激活。4，5已经证实，NF-κB是调节包括胶质瘤细胞在内的癌细胞抵抗基于凋亡的肿瘤监测和治疗能力的主要因素之一。6NF-κB是一种转录因子，由两个亚单位组成，通常为p65和p50，通常由其抑制剂IκB保存在细胞质中。IκB由其激酶IKK控制，IKK对细胞刺激作出反应，磷酸化IκBs，导致IκB-泛素介导的蛋白质降解。因此，NF-κB被释放并转位到细胞核，刺激其一系列靶向基因，促进细胞增殖、侵袭并阻止细胞凋亡。6在胶质瘤中，NF-κB介导的细胞增殖和侵袭已被充分记录。7然而，激活IKK-NF-κB通路以防止胶质瘤细胞死亡的机制仍不清楚。
多梳群和表观基因沉默子Bmi-1首次被描述为在淋巴瘤发生过程中与c-Myc协同作用的癌基因。8，9发现Bmi-1在各种人类癌症中高水平表达，包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、膀胱癌和急性髓细胞白血病。10此外，Bmi-1与人类癌症的发展和进展有关。11，12Bmi-1的致癌功能归因于通过直接靶向Ink4a-Arf位点抑制Ink4a和Arf肿瘤抑制因子。13相反，Ink4a/Arf的胚胎缺失挽救了由Bmi-1缺陷引起的几个遗传缺陷。14同时，在一组高级别人脑胶质瘤中发现Bmi-1基因拷贝数增加。15在神经胶质瘤小鼠模型中，Bmi-1不仅是将Ink4a/Arf缺失的原代星形胶质细胞转化为大脑中的神经胶质瘤所必需的，而且还以Ink4a/Arf独立的方式控制肿瘤的发展。14Bmi-1的这种多因素作用解释了在发育和肿瘤发生过程中，Bmi-1表达导致细胞增殖增加和细胞凋亡减少。16事实上，在Ink4a/Arf-null小鼠中，Bmi-1通过抑制Myc介导的Arf诱导和细胞凋亡，以Ink4a-Arf依赖性的方式与Myc合作促进原代胚胎成纤维细胞的增殖和转化。17其他研究表明，Bmi-1保护角质形成细胞免受应激诱导的凋亡18并消除MYCN诱导的SHEP1细胞敏化，提高细胞存活率。19然而，Bmi-1的表达是否通过向胶质瘤细胞提供凋亡辅助而促进胶质瘤发生和肿瘤进展尚未见报道。
在这项研究中，我们报告了Bmi-1的表达与恶性人脑胶质瘤的进展和胶质瘤患者的不良预后相关。体外，Bmi-1保护胶质瘤细胞免受细胞毒反应剂诱导的凋亡，而Bmi-1的细胞耗竭通过凋亡诱导剂加剧细胞死亡。我们发现Bmi-1激活IKK-NF-κB通路并诱导各种抗凋亡基因的表达。此外，在一组独立的原发性胶质瘤标本中，肿瘤细胞核中明显存在NF-κB亚单位Bmi-1和p65蛋白的共同表达。这些结果揭示了Bmi-1通过激活NF-κB信号使神经胶质瘤细胞逃避常规治疗的细胞毒性杀伤的机制，表明Bmi-1是人类恶性神经胶质瘤预后的重要指标。
材料和方法
细胞培养
胶质瘤细胞系U87MG和U251MG来自美国型培养物收藏中心（弗吉尼亚州马纳萨斯），SNB19来自加利福尼亚大学欧文分校的Y.H.Zhou博士，LN229、LN-235、LN-382、LN-464、SNB19、D247MG、LN229，LN443、LN428、LN319和LN340来自我们自己的收藏。20这些细胞生长在Dulbecco改良的Eagle's培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）中，补充有10%胎牛血清（HyClone，Logan，UT）和100单位青霉素-链霉素，37°C，5%CO2加湿培养箱中的空气。
细胞治疗
将阿霉素（西格玛，密苏里州圣路易斯市）、1，3-双（2-氯乙基）−1-亚硝基脲（BCNU；西格玛）、IKK抑制剂Wedelolactone或NF-κB活化抑制剂II JSH-23（EMD，La Jolla，CA）溶解于二甲基亚砜中，并用于在之前描述的不同时间长度内以指定浓度治疗胶质瘤细胞。21，22
载体与逆转录病毒感染
用pNF-κB-luc和对照质粒（Clontech，Mountain View，CA）定量检测NF-κ的B活性。pBabe-Puro-IκBα-mut（质粒15291）表达突变型IκBα，来自Addgene（马萨诸塞州剑桥）。如前所述构建过表达人Bmi-1的pMSCV/Bmi-1。23为了沉默内源性Bmi-1表达，两种RNA干扰（RNAi）寡核苷酸分别克隆到逆转录病毒转移载体pSuper-retro-puro中，并如前所述进行逆转录病毒生产和感染。24从感染后48小时开始，用0.5μg/ml嘌呤霉素处理10天，筛选出表达Bmi-1或Bmi-1短发夹RNA（shRNAs）的稳定细胞系。
表1
引物序列使用RT-PCR、实时PCR和RNA干扰（RNAi）
| 基因 | 正向底漆 | 反向底漆 |
|---|
| 逆转录聚合酶链反应 | | |
| B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1 | 5′-ATGCATCGAACAACGATATCAAGAGACACT-3′ | 5′-TCAACGAGAAGAGTTGCTGATGACCC-3′ |
| MYC公司 | 5′-TTCGGTAGTGGAAACCAG-3′ | 5′-CAGCAGCTCCGAATTTCCC-3′ |
| CCND1号机组 | 5′-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3′ | 5′-CCACTTTGAGCTTCACCA-3′ |
| Bcl-xL公司 | 5′-ATTGGTGAGTCGCAGC-3′ | 5′-AGAGAAGGGGGGTGGAGGTA-3′ |
| PTGS2型 | 5′-TGAGCATCTACGGTTGCTG-3′ | 5′-TGCTTTCTGGAACACTGC-3′ |
| IL1A级 | 5′-AATGACCCCTCAATCAAAG-3′ | 5′-TGGGTATCTCAGGCATCTCC-3′ |
| 血管内皮生长因子 | 5′-CCCACTGAGGAGTCCAACAT-3′ | 5′-TTTCTTGCGCTTTCGTTTTT-3′ |
| 比尔C3 | 5′-CTTTGCCTGTGGTGAAAAT-3′ | 5′-ACTTGCAGCTCAGGAT-3′ |
| GAPDH公司 | 5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′ | 5′-AGAGGCAGGATGTG-3′ |
| 顺序 |
|---|
| RNA干扰 | | |
| shBmi-1 1号 | 5′-ATGAAGAGAAGAGGATT-3′ |
| shBmi-1编号2 | 5′-AATGGACATACCTAATACT-3′ |
患者和组织标本
在2000年至2005年期间，共从神经胶质瘤患者中手术解剖了297个石蜡包埋的神经胶质瘤样本和40个石蜡包埋的神经胶质瘤样本的独立队列，并由中山大学第一附属医院经验丰富的病理学家进行了组织病理学诊断和验证。从死于交通事故且经组织病理学证实无先前存在的病理损伤的个体中获取了四个正常脑组织。样本的临床信息详见补充表S1（见http://ajp.amjpathol.org). 在常规组织病理学分析中，评估RNA提取区域附近切片的肿瘤纯度百分比。对于这些人体材料的使用，事先获得了机构研究伦理委员会的同意和批准。
逆转录聚合酶链反应
根据制造商的说明，使用Trizol试剂（Invitrogen）提取细胞和原发肿瘤材料的总RNA。提取的RNA用无RNase DNA酶预处理，每个样品中的2μg RNA用于用随机六聚体引物的cDNA合成。对于cDNA的PCR扩增，使用引物进行初始扩增，在95℃下变性10分钟，然后在95℃变性28个周期60秒，在58℃下退火引物30秒，在72℃下延伸引物30秒钟。循环步骤完成后，在终止反应并在4°C下储存之前，在72°C下进行5分钟的最终延长。将各种基因的表达水平归一化为看家基因GAPDH公司作为控件。使用Primer Express 2.0版软件（加利福尼亚州福斯特市Applied Biosystems）设计的PCR引物列于.
免疫印迹和免疫荧光分析
如前所述，使用以下抗体进行免疫印迹（IB）23：抗Bmi-1和抗EF-1α抗体（Upstate、Temecula、CA）；抗NF-κB p65、抗IκBα和抗IKKβ抗体（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）；和抗p-IκBα、抗p-IKKβ、抗细胞周期蛋白D1、抗caspase-3、抗PARP和抗Bcl-XL（左）抗体（细胞信号传导，丹佛，MA）。使用抗人p65单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology；1:200稀释）和异硫氰酸荧光素结合山羊抗鼠二级抗体（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch）对盖玻片上生长的细胞进行各种细胞的免疫荧光染色。灰度图像是在激光扫描显微镜下采集的（Axioskop 2 plus，德国耶拿卡尔蔡司有限公司）。
免疫组织化学
采用免疫组织化学方法研究297例人脑胶质瘤组织中蛋白表达的变化。该程序与之前描述的方法类似。24简而言之，将石蜡包埋标本切割成4μm的切片，并在65°C下烘焙30分钟。用二甲苯将切片脱蜡，并重新水化。将切片浸入EDTA抗原回收缓冲液中，并用微波进行抗原回收。切片在甲醇中用3%过氧化氢处理以淬灭内源性过氧化物酶活性，然后用1%牛血清白蛋白孵育以阻断非特异性结合。将兔抗Bmi-1抗体（1:500；上游）与切片在4°C下孵育过夜。对于阴性对照，用正常山羊血清替换兔抗Bmi-1抗体，或在免疫组织化学染色程序之前，在4°C下共同孵育过夜，用重组Bmi-1多肽封闭兔抗Bmic-1抗体。清洗后，用生物素化抗兔二级抗体（佐米德，加利福尼亚州旧金山）处理组织切片，然后用链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物（佐米得）进一步培养。将组织切片浸泡在3-氨基-9-乙基咔唑中，用10%的迈尔苏木精复染，脱水，然后安装在水晶架上。
三名观察员根据阳性染色肿瘤细胞的比例和染色强度，对福尔马林固定石蜡包埋切片的免疫染色程度进行了审查和独立评分。肿瘤细胞比例评分如下：0（无阳性肿瘤细胞）；1个（<10%阳性肿瘤细胞）；2个（10～50%阳性肿瘤细胞）；3例（>50%阳性肿瘤细胞）。染色强度按以下标准分级：0（无染色）；1（弱染色=淡黄色）；2（中度染色=黄棕色）；和3（强染色=棕色）。染色指数（SI）计算为染色强度得分×阳性肿瘤细胞比例。使用这种评估方法，我们通过测定染色指数（得分为0、1、2、3、4、6和9）来评估Bmi-1在良性乳腺上皮和恶性病变中的表达。Bmi-1的截止值是根据对总体生存率的log-rank检验统计分析的异质性度量选择的。确定了一个最佳截止值：染色指数得分≥4用于定义肿瘤为Bmi-1高表达，≤3用于定义Bmi-1低表达。
采用AxioVision 4.6计算机图像分析系统，结合自动测量程序（Carl Zeiss），对肿瘤和正常组织中蛋白质表达的免疫组织化学（IHC）染色进行定量分析。使用平均光密度（MOD）方法确定每个测试样本的免疫染色强度，并按照之前的报告进行。25简单地说，在放大×200倍的条件下对染色切片进行评估，并分析每个切片的10个代表性染色场，以验证MOD，它表示每阳性像素测量的染色信号强度。使用t吨测试以比较不同组织组之间的平均MOD差异，以及对<0.05被认为是显著的。
细胞存活
电池（1×10三细胞/孔）置于六孔板中并孵育24小时，然后进行阿霉素治疗或紫外线照射245纳米再孵育24小时。通过台盼蓝排除法测定存活细胞的数量。使用死端荧光末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP镍端标记（TUNEL）系统（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）和ApopNexinTM荧光素异硫氰酸盐凋亡检测试剂盒（纽约州普莱西德湖Millipore）检测细胞凋亡。荧光显微镜设备和数码相机通过在滤光片中使用适当的荧光捕捉各种图像。
荧光素酶报告法检测NF-κB转录活性
每孔五万个细胞分三次接种在六孔板中，并静置12小时。使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）将100毫微克的pNF-κB-荧光素酶质粒或控制荧光素酶质粒加上10 ng的pRL-TK肾素质粒（Promega）转染到胶质瘤细胞中。6小时后更换培养基，根据制造商提供的方案，使用双荧光素酶报告试剂盒（Promega）在转染48小时后测量荧光素酶和肾素信号。
统计分析
所有统计分析均使用SPSS 10.0（SPSS Inc，Chicago，IL）统计软件包进行。χ2检测Bmi-1表达与胶质瘤临床病理特征的关系，以及Bmi-1与NF-κB p65表达的关系。使用Spearman秩相关系数计算每对研究变量之间的双变量相关性。使用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线，并使用对数秩检验进行比较。生存数据通过单变量和多变量Cox回归分析进行评估。对<0.05被认为具有统计学意义。
结果
肿瘤蛋白Bmi-1上调与胶质瘤进展及预后不良相关
我们首先确定Bmi-1的表达是否与不同级别的世界卫生组织胶质瘤相关。用抗人Bmi-1抗体对297例石蜡包埋胶质瘤标本进行IHC染色，其中包括37例政策性星形细胞瘤（世界卫生组织一级）、112例弥漫性星形细胞癌（二级）、93例间变性星形细胞瘤和55例GBM（四级）。如补充表S1所述（参见http://ajp.amjpathol.org)我们发现，与正常脑组织相比，Bmi-1在所有四级胶质瘤中均上调。总的来说，在297例胶质瘤标本中有279例（93.9%）检测到Bmi-1蛋白的表达。显示了四个世界卫生组织级别胶质瘤中每一个的IHC染色肿瘤标本。特别是，在这些原发性胶质瘤组织的肿瘤细胞中，Bmi-1蛋白的核染色从中度到强相反，在对照正常脑组织中检测到Bmi-1的最低免疫活性定量IHC分析显示，I级至IV级原发性胶质瘤中Bmi-1染色的MOD高于正常脑组织(对<0.05）并随肿瘤分级增加为了证实我们观察到的与正常大脑相比，胶质瘤组织中Bmi-1上调，我们对来自高级别GBM患者的四对冷冻脑组织进行了IB分析。与取自相同个体的配对相邻非癌脑组织相比，所有肿瘤组织中的Bmi-1蛋白表达增加（补充图S1，参见http://ajp.amjpathol.org).
Bmi-1上调与胶质瘤进展和胶质瘤患者预后不良相关。答：不同级别的正常脑组织和胶质瘤标本中Bmi-1表达的代表性IHC分析。NB，正常脑组织；PA，政策性星形细胞瘤，WHO I级；DA，弥漫性星形细胞瘤，Ⅱ级；AA，间变性星形细胞瘤，III级；和GBM等级IV如图所示。数据代表了总共297个神经胶质瘤标本和4个NB组织中的所有4个WHO级肿瘤。每个肿瘤标本至少进行两次IHC染色，染色模式相似。B类：与NB肿瘤相比，胶质瘤标本中的Bmi-1染色明显增加，并且Bmi-1表达随着肿瘤进展而增加。显示了NB组织（4例）中IHC染色MOD的统计量化，以及随机选取的每个不同WHO级别胶质瘤的30例肿瘤病例。随着胶质瘤进展到更高级别，Bmi-1染色的MOD增加*对< 0.05.抄送：WHO I～IV级患者Bmi-1表达水平与恶性胶质瘤患者生存率的Kaplan-Meier分析(对<0.001，log-rank检验）。
接下来，我们确定随着胶质瘤进展和胶质瘤患者预后，Bmi-1上调是否与组织病理学分级相关。如补充表S2所示（参见http://ajp.amjpathol.org)，297个肿瘤标本中Bmi-1的表达水平与其世界卫生组织的等级密切相关(对=0.000）和胶质瘤患者的生存时间(对= 0.005). 斯皮尔曼相关分析进一步验证了这些结果（补充表S3，见http://ajp.amjpathol.org). Kaplan-Meier分析和log-rank检验表明，原发性胶质瘤标本中Bmi-1的表达水平与患者的生存时间呈负相关，具有高度的统计学意义(对<0.001）和相关系数−0.533(对< 0.001,). 此外，多变量生存分析进一步表明，Bmi-1表达水平越高，生存时间越短，表明Bmi-1可能是一个独立的预后因素（补充表S4，见http://ajp.amjpathol.org). 总之，原发性胶质瘤中Bmi-1的上调与胶质瘤的进展相关，并与疾病的不良预后相关。
Bmi-1异位表达抑制阿霉素和紫外线诱导的胶质瘤细胞凋亡
研究表明，Bmi-1通过抑制Ink4a/Arf功能促进细胞增殖并保护细胞免受凋亡。13，17我们试图通过一种替代机制来检测Bmi-1的上调是否在神经胶质瘤细胞对凋亡的抵抗中发挥作用。我们首先检测了一组人脑胶质瘤细胞中Bmi-1蛋白的表达水平。如补充图S2所示（参见http://ajp.amjpathol.org)与正常人星形胶质细胞相比，所有16个胶质瘤细胞系中Bmi-1的表达均在不同水平上上调。为了排除Ink4a/Arf和p53通路对Bmi-1抗凋亡作用的可能影响，我们选择了两种Ink4a/Arf缺失的胶质瘤细胞系，即野生型p53的U87MG细胞和突变型p53基因的U251MG细胞，进行我们的研究。26异位Bmi-1在这两种胶质瘤细胞系中稳定表达通过将这些细胞暴露于抗癌药物阿霉素和紫外线照射下，评估Bmi-1上调对细胞毒性反应诱导的细胞凋亡的影响。如所示与载体控制细胞相比，这两种细胞系中Bmi-1的过度表达表明，在不同浓度的药物或不同剂量的紫外线照射下，对阿霉素和紫外线诱导的细胞死亡具有更高的抵抗力。为了验证Bmi-1表达细胞的存活率增加是由于抑制细胞凋亡，进行了TUNEL和Annexin-V结合分析。如所示和补充图S3A（参见http://ajp.amjpathol.org)1.0μmol/L阿霉素处理后，凋亡载体控制细胞的数量显著高于凋亡Bmi-1表达细胞。
Bmi-1的异位表达抑制阿霉素和紫外线诱导的神经胶质瘤细胞凋亡。答：Bmi-1在胶质瘤细胞系中的异位表达。使用抗Bmi-1抗体通过IB分析U251MG载体、U251MG-Bmi-1、U87MG载体和U87MG-Bmi-1细胞的总细胞裂解物。α-微管蛋白作为负荷对照。B类：Bmi-1的表达可防止阿霉素或紫外线照射诱导的细胞死亡。左侧面板，培养的U251MG-vector、U251MG-Bmi-1、U87MG-vetor和U87MG-Bmi-1细胞经紫外线照射（40 J/m）处理后的代表性显微照片2)然后进行12小时培养或阿霉素（1.0μmol/L）12小时。中部和右侧面板紫外线照射后各种胶质瘤细胞的细胞存活率（20 J/m2，40焦耳/米2，和60焦耳/米2)然后进行12小时培养或阿霉素（0.5μmol/L、1.0μmol/L和2.0μmol/L）12小时。存活细胞通过台盼蓝排除法计数。条形图表示存活细胞与未处理对照细胞相比的平均百分比。数据代表三个具有类似结果的独立实验。抄送：TUNEL检测发现Bmi-1异位表达抑制阿霉素诱导的细胞凋亡。左侧面板用1.0μmol/L阿霉素处理24小时后，U251MG载体、U251MG-Bmi-1、U87MG载体和U87MG-Bmi-1细胞的TUNEL染色细胞的免疫荧光图像。右侧面板TUNEL染色细胞的定量。用阿霉素（1.0μmol/L）处理指示细胞24小时后，从10个随机区域中计数TUNEL染色阳性细胞。医生：Annexin V的定量+/PI公司−用阿霉素（1.0μmol/L）处理所示细胞株后的细胞12小时。数字是从10个随机字段中计数的单元格。条形图，膜联蛋白V的SD代表图像+/PI公司−电池如补充图S3A所示（参见http://ajp.amjpathol.org).电子：Bmi-1表达抑制阿霉素诱导的前caspase-3和PARP蛋白水解并诱导Bcl-XL（左）表达式。用阿霉素（1.0μmol/L）处理各种U87MG和U251MG细胞12小时，并分析细胞总裂解物对前caspase-3、PARP的蛋白水解裂解(左边)和Bcl-X的表达L（左）水平(正确的)由IB提供。箭头显示裂解的caspase-3和裂解的PARP。α-微管蛋白作为负载对照。在A类和E类，IB分析至少进行了两次独立的分析，结果相似。异硫氰酸荧光素*对< 0.05.
为了进一步支持我们的观察，我们通过评估Bcl-X表达的影响来表征Bmi-1对凋亡保护的作用L（左）以及对细胞凋亡至关重要的caspase-3和PARP蛋白的裂解。27如所示，U87MG和U251MG细胞中Bmi-1的异位表达抑制了前胱天蛋白酶3和PARP的裂解，并诱导Bcl-XL（左）表达式。综上所述，这些结果表明，上调Bmi-1通过调节Ink4a/Arf阴性胶质瘤细胞中的抗凋亡蛋白，增强了胶质瘤细胞对细胞毒性反应诱导的细胞凋亡的抵抗力，而这种抗凋亡蛋白与p53状态无关。
Bmi-1细胞耗竭增强阿霉素或紫外线诱导的胶质瘤细胞凋亡
为了进一步表征Bmi-1对胶质瘤细胞凋亡的影响，我们使用特异性小干扰RNA（siRNAs）敲除U87MG和U251MG细胞中的内源性Bmi-1，并检测修饰细胞对凋亡的敏感性。如所示，两个靶向Bmi-1的siRNA在两个胶质瘤细胞系中特异性地敲除内源性Bmi-1蛋白。随后的研究选择了效率较高的2号siRNA。当用1.0μmol/L阿霉素或40 J/M处理这些修饰的胶质瘤细胞时2紫外线照射后，与载体控制细胞相比，Bmi-1缺失的细胞对这些凋亡诱导物的敏感性增强通过对Bmi-1敲除细胞和1.0μmol/L阿霉素处理的对照细胞进行TUNEL和Annexin-V结合试验，证实了诱导细胞死亡的凋亡性质(，以及补充图S3B，参见http://ajp.amjpathol.org). 此外，抑制Bmi-1可显著诱导PARP和caspase-3的裂解，并减弱Bcl-X的表达L（左） 此外，我们评估了Bmi-1上调对烷基化剂BCNU诱导的细胞凋亡的影响，BCNU是临床上广泛使用的一种化疗药物。TUNEL和Annexin-V结合分析显示，Bmi-1过表达细胞系对BCNU诱导的凋亡表现出更强的抵抗力，而当用BCNU处理时，Bmi-1-敲除细胞中的凋亡细胞数量明显高于载体控制细胞中的数量（补充图S4见http://ajp.amjpathol.org). 综上所述，我们的数据表明，Bmi-1的细胞耗竭损害了胶质瘤细胞抵抗细胞毒性反应诱导的细胞死亡和抗凋亡蛋白表达的能力。
siRNA对Bmi-1的缺失增强了阿霉素和紫外线诱导的胶质瘤细胞凋亡。答：shRNA-稳定转导胶质瘤细胞系中Bmi-1的敲除。使用抗Bmi-1抗体通过IB分析U251MG-vector、U251MG-Bmi-1-RNAi（s）、U87MG-vetor和U87MG-Bmi-1-RNA Ai（s）细胞的总细胞裂解物。α-微管蛋白作为负荷对照。B类：siRNA对Bmi-1的敲除增强了阿霉素和紫外线辐射诱导的细胞死亡。右侧面板U251MG-vector、U251MG-Bmi-1-RNAi、U87MG-vetor和U87MG-Bmi-1-RNA Ai细胞经紫外线照射（40 J/m）处理后的代表性显微照片2)然后进行12小时培养或阿霉素12小时（1.0μmol/L）。中部和左侧面板紫外线照射后各种胶质瘤细胞的细胞存活率（20 J/m2，40焦耳/米2和60焦耳/米2)然后进行12小时培养或阿霉素（0.5μmol/L、1.0μmol/L和2.0μmol/L）12小时。存活细胞通过台盼蓝排除法计数。条形图表示存活细胞与未处理对照细胞相比的平均百分比。数据代表三个具有类似结果的独立实验。抄送：Bmi-1的敲除使胶质瘤细胞对阿霉素诱导的凋亡敏感。左侧面板用1.0μmol/L阿霉素处理各种胶质瘤细胞24小时，TUNEL染色。右侧面板TUNEL染色细胞的定量。用阿霉素（1.0μmol/L）处理指示细胞24小时后，在10个随机区域中计数TUNEL染色阳性细胞。医生：膜联蛋白V的定量+/PI公司−用阿霉素（1.0μmol/L）处理所示细胞株后的细胞12小时。数字是从10个随机字段中计数的单元格。棒材，标准偏差。Annexin V的代表性图像+/PI公司−电池如补充图S3B所示（参见http://ajp.amjpathol.org).电子：Bmi-1的缺失促进阿霉素诱导的前caspase-3和PARP蛋白水解并抑制Bcl-XL（左）表达式。用阿霉素（1.0μmol/L）处理各种U87MG和U251MG细胞12小时，并分析总细胞裂解物对前半胱氨酸蛋白酶-3、PARP的蛋白水解裂解(左边)和Bcl-X的表达L（左）水平(正确的)由IB提供。箭头显示裂解的caspase-3和裂解的PARP。α-管蛋白被用作负荷控制。在A类和E类，IB分析至少进行了两次独立的分析，结果相似。异硫氰酸荧光素*对< 0.05.
Bmi-1激活NF-κB并诱导其靶向基因的表达
我们的数据表明，Bmi-1的表达调控Bcl-XL（左）在胶质瘤细胞中表达。自Bcl-XL（左）是核因子-κB的靶基因，是核因子κB介导的信号通路和Bcl-XL（左）对癌细胞生存至关重要，28我们被要求确定Bmi-1的表达是否影响NF-κB信号传导。我们首先通过NF-κB报告荧光素酶活性测定评估了Bmi-1调控对胶质瘤细胞中NF-kb B转录活性的影响。如所示与载体控制细胞相比，在U87MG和U251MG细胞中，Bmi-1的异位表达使NF-κB的转录活性分别增加了15%至40%，而Bmi-1缺失的siRNA使NF-kb B的活性分别降低了22%至35%。由于NF-κB转录活性与核因子κB的核累积密切相关，我们进一步研究了Bmi-1的表达是否改变了NF-κ的核移位。我们将细胞裂解物分离为细胞质和核酸组分，并通过IB分析检测了NF-κB催化单元p65蛋白的亚细胞定位。如所示Bmi-1的表达增加了核组分中NF-κB p65蛋白的数量，而siRNA敲除Bmi-1则减少了NF-κ）B p65蛋白质的核积累。在Bmi-1过度表达或被敲除的细胞中，通过免疫荧光染色进一步检测Bmi-1表达对p65细胞核移位的影响。我们发现Bmi-1表达细胞的核p65显著增加，而Bmi-1敲除细胞的核p65显著降低(，这两个小组），表明Bmi-1通过促进核转位增强NF-κB的转录活性。
Bmi-1激活胶质瘤细胞中的NF-κB通路。答：Bmi-1表达调节胶质瘤细胞中NF-κB的转录活性。用pNF-κB-荧光素酶和pRL-TK肾素的质粒共同转染各种胶质瘤细胞，并通过荧光素素酶报告活性分析进行分析。误差条表示三个独立实验的平均值±SD，结果相似。B类：κB的亚细胞组分。通过IB分析分析所示细胞的细胞质和细胞核部分。核蛋白p84用作核蛋白标记物，EF-1用作负荷对照。抄送：NF-κB（p65亚单位）在胶质瘤细胞中亚细胞定位的免疫荧光染色。用抗p65抗体和DAPI对U87MG-vector、U87MG-Bmi-1、U87MG-Bmi-1-RNAi、U251MG-vetor、U251MG-Bmi-1和U251MG-Bmi-1-RNA Ai细胞进行免疫染色。用荧光显微镜分析各种染色细胞。数据来自两个具有类似结果的独立实验。医生：Bmi-1表达的调节改变了NF-κB靶向基因的表达。通过RT-PCR分析来自U87MG-vector、U87MG-Bmi-1、U87MG-Bmi-1-RNAi、U251MG-vetor、U251MG-Bmi-1和U251MG-Bmi-1-RNA Ai细胞的总RNA，以检测七个NF-κB靶向基因的表达。的表达式GAPDH公司用作基因表达的控制。数据是从两个独立的实验中获得的，结果相似。
由于NF-κB的激活除了调节Bcl-X外，还调节其对细胞凋亡至关重要的靶基因的转录L（左），我们进行了半定量PCR分析，并检测了其他六个NF-κB靶基因的表达水平，包括IL1A、MYC、CCND1、PTGS2、BIRC3和血管内皮生长因子在表达Bmi-1、Bmi-1敲除和载体控制胶质瘤细胞中的表达水平。如所示与载体控制细胞相比，上调Bmi-1可诱导所有7个基因的转录，而这些细胞中Bmi-1的缺失可显著抑制其mRNA水平。综上所述，我们的结果表明，Bmi-1的表达调节了胶质瘤细胞中NF-κB的活性和NFκB靶基因的表达。
抑制IκB、IκB-激酶或NF-κB抵消Bmi-1对胶质瘤细胞凋亡的保护作用
NF-κB活性受其抑制剂（IκBs）和IκB激酶（IKK）的控制，以响应各种细胞刺激，导致IκB-泛素介导的蛋白降解和随后的NF-κ的B移位到细胞核。6为了研究Bmi-1如何调节NF-κB活性，我们评估了Bmi-1表达对IκB和IKKβ磷酸化的影响。如所示在肿瘤坏死因子-α治疗中，Bmi-1表达细胞中IKKβ和IκB的磷酸化水平显著诱导，而Bmi-1敲除细胞中IKβ和我κB磷酸化水平明显降低，而IKK总β和I k B蛋白水平保持不变。
Bmi-1通过激活IKK-IκB调节NF-κB途径。答：Bmi-1调节IκB和IKK磷酸化。左侧面板Bmi-1的异位表达激活了IκB/IKK通路。U251MG载体、U251MG-Bmi-1、U87MG载体和U87MG-Bmi-1细胞用1nmol/L肿瘤坏死因子-α处理24小时，并通过IB.分析磷酸化IKKβ（p-IKKβ）、总IKKβ、磷酸化IκBα（S32/36）（p-IκBα）和总IκBα水平。右侧面板Bmi-1的敲除抑制IκB和IKK的磷酸化。用1 nmol/L肿瘤坏死因子-α处理U251MG-vector、U251MG-RNAi、U87MG-vetor和U87MG-RNAi细胞24小时，并通过IB分析磷酸化IKKβ（p-IKK。B类：抑制IκBα、NF-κB和IKK可抑制Bmi-1刺激的神经胶质瘤细胞中NFκB的转录活性。将NF-κB荧光素酶报告质粒单独转染U87MG-Bmi-1和U251MG-Bmi-2细胞（对照），与IκB突变体（IκBmu。48小时后，对细胞进行荧光素酶活性测定*对< 0.05.抄送：抑制IκBα、NF-κB和IKK可减弱Bmi-1对前caspase-3、PARP和Bcl-X蛋白水解裂解的影响L（左）表达式。U251MG-Bmi-1细胞B类用IB分析caspase-3、PARP和Bcl-X的裂解L（左）表达。箭头显示裂解的caspase-3和裂解的PARP。α-管蛋白被用作负荷控制。中的数据A类–C类来自两个具有类似结果的独立实验。
为了进一步证实Bmi-1对IKK/IκB/NF-κB通路的调节，我们检测了特定抑制剂对IKK、IκB和NF-κ）B的抑制对Bmi-1表达细胞中NFκB活性的影响。如所示，在表达IκB显性阴性突变体（IκBmu）或用30μmol/L JSH-23处理的U251MG Bmi-1表达细胞中，NF-κB的转录活性显著降低，JSH-23是一种NF-kb B抑制剂，可选择性地阻断NF-kB的核转位及其转录活性，而不影响IκB的降解，21或使用100μmol/L Wedelolactone，这是一种特异性IKK抑制剂，可选择性和不可逆地抑制IKK激酶活性，而不影响p38 MAPK或AKT。20同时，用1.0μmol/L阿霉素处理U251MG Bmi-1表达细胞，并分别用IκBmu（通过表达）、30μmol/L JSH-23或100μmol/L韦得内酯处理。如所示caspase-3或PARP的蛋白水解裂解，以及Bcl-XL（左）阿霉素治疗后表达增加。正如预期的那样，抑制Bmi-1-表达细胞中的IκB、IKK或NF-κB可逆转这些效应，即增加caspase-3和PARP降解，降低Bcl-XL（左）与未经处理的U251MG Bmi-1表达细胞相比，处理细胞中的表达总之，这些结果表明，IKK/IκB/NF-κB通路在介导Bmi-1在胶质瘤细胞中的抗凋亡功能中很重要。
Bmi-1与NF-κB在原发性人脑胶质瘤细胞核中共表达
为了确定Bmi-1上调和NF-κB活性增加是否与人脑胶质瘤生物学相关，我们通过IHC染色检测了40例人脑胶质细胞瘤标本中Bmi-1的表达和NF-kb的细胞定位。显示了在我们的IHC研究中分析的两个胶质瘤标本的示例。我们发现40例病例中有37例（92.5%）Bmi-1染色呈阳性，这与我们在第一组神经胶质瘤标本中的观察结果一致，如图所示在总共分析的40个样本中，发现23例（57.5%）Bmi-1高表达，而其余17例（42.5%）表现为Bmi-1低表达或无表达。值得注意的是，在23例（78.3%）Bmi-1高表达的胶质瘤标本中，有18例表现出核NF-κB p65蛋白增加相反，17例低水平或缺乏Bmi-1表达的胶质瘤标本中有13例（76.5%）发现了细胞质NF-κB p65Bmi-1表达与NF-κB核定位之间的相关性具有统计学意义(，对=0.04），Spearman相关分析进一步验证了这一点(对< 0.001). 综上所述，第二批原发性胶质瘤标本的IHC分析进一步支持了Bmi-1促进NF-κB核移位并激活NFκB通路使胶质瘤细胞抗凋亡的观点。
在原发性人脑胶质瘤标本中，Bmi-1和NF-κB在肿瘤细胞核中共同表达。答：原发性胶质瘤活检中Bmi-1和核NF-κB p65亚单位的IHC染色。在弥漫性星形细胞瘤（DA；世界卫生组织（WHO）II级）中，Bmi-1的表达较低，NF-κB p65的表达仅限于胶质瘤细胞的细胞质。在高级别GBM（IV级）中，观察到Bmi-1和NF-κB p65的强核染色。数据来自总共40个神经胶质瘤标本的阳性染色样本。B类：Bmi-1表达与核NF-κB p65染色的相关性(对= 0.04). 低表达评分：0=无染色；1=低表达。高表达评分：2=中度表达；3=高表达。每个点代表一个胶质瘤标本。
讨论
目前的研究提供了证据表明，Bmi-1是一种致癌多梳组蛋白，通过激活NF-κB介导的通路对胶质瘤细胞产生凋亡抵抗。我们的数据表明，除了PTEN和PI3K-Akt-mTOR通路的结构性激活外，三恶性胶质瘤细胞在胶质瘤进展过程中通过上调癌蛋白Bmi-1对细胞毒治疗诱导的细胞死亡产生强烈抵抗。我们从临床样本中获得的数据不仅证实了先前的报告，即Bmi-1在原发性人脑胶质瘤中上调，14，15，29但也表明Bmi-1的表达与胶质瘤进展和胶质瘤患者预后不良相关。Bmi-1与H-Ras或c-Myc协同作用，作为一种癌基因促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。17，30我们的结果进一步证实，Bmi-1可以保护胶质瘤细胞免受细胞毒性反应诱导的细胞死亡。我们发现，异位表达Bmi-1使胶质瘤细胞对阿霉素和紫外线照射诱导的细胞死亡具有抵抗力，而当胶质瘤细胞暴露于这些试剂时，内源性Bmi-1的敲除会加速细胞死亡。此外，Bmi-1对细胞死亡的保护作用与其激活NF-κB介导的抗凋亡途径有关。Bmi-1的表达通过诱导IKKβ和IκBα的磷酸化激活NF-κB及其对凋亡至关重要的靶向基因产物。抑制NF-κB、IKKβ或IκBα可减弱Bmi-1介导的对细胞毒性试剂诱导的细胞死亡的保护作用。最后，通过单独收集原发性胶质瘤标本，我们发现Bmi-1与NF-κB催化亚单位在这些肿瘤的细胞核中共定位。总之，我们的结果揭示了胶质瘤细胞通过激活IKK-NF-κB介导的抗凋亡途径上调Bmi-1从而获得对细胞死亡的迂回抵抗的机制。
Bmi-1的致癌特性将Bmi-1表达与几种人类癌症的肿瘤进展和临床预后联系起来。在胃癌、鼻咽癌、前列腺癌、乳腺癌和肝癌以及髓系白血病中发现Bmi-1表达升高与癌症患者预后不良相关，23，31，32，33提示Bmi-1是预测预后的有用分子标志物。最近有报道称，在胶质瘤细胞中，Bmi-1在原发性胶质瘤标本中高表达。15，29我们的临床样本中Bmi-1表达的数据扩展了这些发现，表明上调的Bmi-1与恶性胶质瘤分级进展密切相关，并预测胶质瘤患者的生存率较差。重要的是，在一组独立的高级GBM样本中，Bmi-1与NF-κB（p65 submit）在细胞核中的共表达总体增加，这不仅验证了我们的观察结果，而且支持了我们的机制数据，表明上调的Bmi-1激活了NF-κB途径，使神经胶质瘤细胞对凋亡具有抵抗力。
Bmi-1在肿瘤发生过程中通过直接靶向Ink4a/Arf抑制c-Myc介导的抗凋亡途径，从而保护细胞免受死亡。17我们的结果提供了另一种分子机制，通过这种机制，Bmi-1表达有助于保护胶质瘤细胞免受凋亡。我们发现，Bmi-1的异位表达增加了胶质瘤细胞抵抗阿霉素或紫外线照射诱导的凋亡的能力，而Bmi-1细胞的缺失显著增强了胶质瘤对这些凋亡诱导剂的细胞毒性反应。我们的数据还表明，Bmi-1通过调节抗凋亡蛋白Bcl-X的表达来保护细胞免受死亡L（左）以及caspase-3和PARP的蛋白水解裂解。这些结果表明，Bmi-1在促进胶质瘤细胞抵抗凋亡诱导剂损伤的存活方面发挥着重要作用。
Bmi-1促进细胞存活主要是通过抑制Ink4a/Arf介导的凋亡途径。13，17有趣的是，在胶质瘤小鼠模型中，Bmi-1被证明可以控制涉及Ink4a/Arf以外基因的多个过程。34我们的结果不仅为支持这一假设提供了证据，而且还将Bmi-1的功能与IKK-NF-κB介导通路的激活联系起来。我们发现Bmi-1的异位表达通过IκBα的磷酸化和IKKβ复合物的激活促进了细胞质NF-κB的核转位并增加了其转录活性。相反，IκB突变体、特异性NF-κB抑制剂或特异性IKK抑制剂选择性抑制NFκB活性可消除Bmi-1在胶质瘤细胞中的抗凋亡作用。此外，胶质瘤细胞中异位表达或siRNA敲除对Bmi-1表达的调节也会影响一些NF-κB靶向基因的表达，如c-Myc、CCND1、Bcl-XL（左），和血管内皮生长因子，证明了Bmi-1激活NF-κB通路的能力。最后，我们在一组独立的高级别GBM标本中发现了细胞核定位的Bmi-1和NF-κB上调的密切相关性。考虑到NF-κB信号的主要功能之一是保护细胞免受死亡6这种途径在胶质瘤中被组成性激活，4，5这些结果不仅提供了Bmi-1刺激NF-κB通路保护胶质瘤细胞凋亡的机制，而且还表明Bmi-1可能是改善胶质瘤细胞毒治疗肿瘤反应的重要靶点。
总之，本研究首次揭示了上调Bmi-1保护胶质瘤细胞免受抗癌药物和紫外线辐射诱导的凋亡的机制。脑胶质瘤细胞中Bmi-1的表达和NF-κB通路的激活以及原发性人脑胶质瘤标本中肿瘤细胞核中Bmi-1和NFκB的共同表达之间的机制联系表明，Bmi-1表达与恶性胶质瘤细胞的凋亡抵抗密切相关。这些结果为研究胶质瘤对细胞毒治疗方式产生的细胞死亡的迂回抵抗机制提供了新的见解。了解Bmi-1在胶质瘤进展中的作用不仅可以提高我们对胶质瘤对细胞毒治疗的潜在耐药性的认识，而且可以确定Bmi-1是治疗这些致命脑癌的潜在治疗靶点。
致谢
我们感谢周一红博士提供的SNB19细胞和娜玛·巴拉斯女士对本文的校对。
脚注
请将转载请求发送至中国广东省广州市中山二路74号中山大学中山医学院医学博士李梦峰，邮编510080。电子邮件：nc.ude.usys.liam@fmil公司; 或Shi-Yuan Cheng，博士，匹兹堡大学癌症研究所和病理学系，希尔曼癌症研究所研究馆，宾夕法尼亚州匹兹堡中心大道5117号2.26f室，邮编：15213-1863。电子邮件：ude.cmpu@sgnehc.
科技部资助项目（973）2005CB724605；国家自然科学基金项目（编号：30670803、30770836、30771110、30870963、30872930、30831160517）；新世纪高校优秀人才计划（No.NCET-07-0877）；广东省科学技术厅（No.07001503，8251008901000006）；教育部〔2008〕890号、200805580047号〕；广东省珠海市科学技术厅（No.PC20071076）；广东省自然科学基金（No.2006Z3-E4081），以及985-II项目（致J.L.、M.L.和L.B.S.）的关键资助，并向美国NIH CA102011、CA130966和美国癌症学会（ACS）RSG CSM-107111（致S.-Y.C.）提供资助。
J.L.、L.-Y.G.和L.-B.S.对这项工作做出了同等贡献。
本文的补充材料可以在上找到http://ajp.amjpathol.org.
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