内源性多聚SUMO结合物的纯化与鉴定

内源性多聚SUMO结合物的纯化与鉴定

摘要

介绍

小的泛素样修饰物（SUMO）通过其羧基末端残基和目标蛋白质中赖氨酸侧链的ɛ-氨基之间的异肽键连接。SUMO修饰的功能后果主要由包含SUMO相互作用基序（SIM）的效应蛋白的招募介导。SIM由短段疏水残基组成，这些疏水残基直接与SUMO分子结合(Song等人，2004年;Hecker等人，2006年). 脊椎动物表达三个SUMO副序列（1-3），其中SUMO2和SUMO3都包含SUMO共有修饰基序（ψKxE/D），允许形成多SUMO链(Tatham等人，2001年). SUMO形成多SUMO结合物的能力在真核生物中是保守的，在酵母中的遗传学研究表明，polySUMO链在染色体分离、从检查点阻滞中恢复、DNA损伤反应和减数分裂中起作用(Bylebyl等人，2003年;Cheng等人，2006年;Schwartz等人，2007年). 最近，polySUMO链已被证明可被含有几种SIM的蛋白质识别，例如RING finger 4（RNF4或Snurf）泛素E3连接酶。RNF4包含四个氨基末端SIM和一个C末端RING结构域，共同促进多SUMO特异性泛素化(Tatham等人，2008年).

在这里，我们描述了一种使用RNF4的多聚SUMO结合功能促进从几乎任何生物材料中以纯度和产量特异性分离内源性多聚SUMA修饰蛋白质的程序，该程序适用于高分辨率质谱分析。我们通过测量300多个蛋白质在热休克反应中的多糖基化状态变化来证明这种方法。

结果

聚SUMO链的亲和纯化

亲和纯化策略使用RNF4片段（残基32–133），该片段包含四个SIM(图1A、C)对单个SUMO部分亲和力低，但对多SUMO链亲和力高(Tatham等人，2008年). 所有四个SIM均发生突变的RNF4形式（RNF4mt；图1A，C)用作阴性对照。通过与含SIM的肽竞争获得选择性洗脱(Song等人，2004年)源自活化STATS的蛋白抑制剂（PIASX；图1B).体外-生成的重组多聚SUMO2链可以有效地与RNF4基质结合，但不能与带有突变SIM的RNF4相连的基质结合。通过SIM肽处理，基质上保留的聚SUMO2链被有效释放，珠子上只剩下微量的聚SUMU2链(图1D). 亲和层析研究(补充图S1结果表明，与SUMO单体相比，野生型RNF4对SUMO聚合物具有SIM依赖性、优先结合性，而不管其连接如何，并且对泛素没有亲和力。这些在体外研究表明，该方法是特异性纯化聚SUMO共轭物的基础。

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图1

一种E3连接酶非活性RNF4片段，与多聚SUMO结合。(一个)SUMO依赖性泛素连接酶RNF4的结构域布局。显示了RING和SIM。下面是来自氨基酸32–133（RNF4wt）的RNF4片段和SIM突变片段（RNF4mut）。突变残基以粗体显示。(B类)用于洗脱包含PIASX蛋白SIM的聚SUMO结合物的SIM肽序列，在羧基末端添加三个氨基酸。(C)RNF4片段的纯度通过SDS-PAGE测定。(D类)用RNF4wt和RNF4mut分离重组SUMO2链，然后用SIM肽洗脱。用SUMO2抗体对样品进行免疫印迹。免疫印迹法；mut，突变体；RNF4，环形填料4；SDS-PAGE、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；SIM，小泛素样修饰语相互作用基序；SUMO，一种小型泛素样修饰物；wt，野生型。

内源性多糖基化蛋白的鉴定

当暴露于蛋白质损伤应激时，HeLa细胞通过增强SUMO2/3结合来作出反应(Saitoh&Hinchey，2000年)以及聚SUMO链的形成(Golebiowski等人，2009年). 为了在制备细胞质和核真核细胞提取物的过程中保存SUMO修饰的蛋白质，使用碘乙酰胺抑制SUMO蛋白酶活性（见方法部分）。将核提取物中的SUMO修饰物种与变性条件下直接裂解的细胞进行比较，结果表明SUMO的修饰保留了下来，大多数SUMO改性物种存在于可溶性核提取物中(图2A，1-6车道；补充图S2A、B在线）。由热冲击引发的SUMO偶联物数量的增加也得到了保留。核提取物中的PolySUMO结合物与RNF4 SIMs结合，与Sepharose珠结合，并通过与SIM肽竞争从RNF4基质中洗脱(图2A，车道7–10）。重要的是，未分离出游离SUMO，这意味着单独修饰的蛋白质未通过该方法纯化(补充图S1在线）。隔离材料的银渍(图2B)与免疫印迹分析结果一致。为了评估通过该程序纯化和回收聚SUMO2链的程度，将同位素标记的重组Lys 11-连接的SUMO2二聚体“添加”到核提取物和RNF4纯化材料中。在胰蛋白酶消化和质谱分析后，参照同位素标记标准计算每个组分中Lys 11-连接的SUMO链的相对数量(补充图S2C在线）。这表明，经40000倍纯化后，聚SUMO链的回收率为80%。

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图2

在细胞核和细胞质分馏中保存SUMO结合物。(一个)悬浮液中的HeLa细胞在43℃下热应激1 h，或在37℃下进行对照处理。总的来说，10%的细胞被直接溶解到Laemmli的样品缓冲液中（通道1和4），剩余的细胞被分为细胞质和核提取物（通道2、3、5和6）。使用微管蛋白、层粘连蛋白A/C和SUMO2抗体（1-6道）分析分离和SUMO结合物保存的效率。核裂解产物用于纯化，RNF4wt或RNF4mut交联到小球。通过免疫印迹分析洗脱液（7-10道）。核裂解物占下拉实验输入的20%。(B类)银染SDS–对照和热应激HeLa细胞核裂解物RNF4依赖性下拉物的PAGE。循环。，细胞质；编号：。，核；RNF4，环形填料4；SDS–PAGE、SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳；SUMO，小的泛素样修饰语。

热应激后polySUMO结合物的蛋白质组学

为了证明蛋白质组学能力，RNF4介导的SUMO纯化通过在每次纯化中使用375 mg核提取物进行放大(图3A，左侧面板）。对分离物进行凝胶内消化，然后进行质谱分析。SUMO–SUMO分支肽的鉴定证实了polySUMO纯化的成功(补充图S3A–C在线）。去除污染物（如胰蛋白酶和角蛋白）后，在37°C RNF4mut洗脱液中仅鉴定出79个蛋白质，95个蛋白质从RNF4野生型（RNF4wt）等效物中鉴定出来。在这95个菌株中，76个要么在野生型条件下富集，要么在突变体纯化中不存在(补充数据文件1在线）。当细胞暴露于热休克时，从RNF4mut纯化中鉴定出的一些蛋白质从未应激细胞的蛋白质大约翻了一番，达到162个，而野生型的当量增加了10倍，达到979个，包括之前鉴定的所有76个。在979个已鉴定的蛋白质中，共有828个在RNF4mut纯化中没有强度，143个在RNF 4wt纯化中更丰富(补充数据文件1在线）。在两次纯化中，仅检测到八种蛋白质，其程度大致相同。这些数据的生物学相关性通过其与先前研究的一致性得到独立证实(Messner等人，2009年)结果表明，poly-ADP核糖聚合酶1（PARP1）是一种多聚SUMO结合物，其结合受热休克刺激(补充图S4A在线）。通过检测SUMO底物支链肽中先前鉴定的蛋白质HNRNPM，可以证明SUMO修饰的物种是通过该程序纯化的(补充图S3D和拓扑异构酶II（TOP2；补充图S3E在线；Vassileva&Matunis，2004年;Azuma等人，2005年).

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图3

热休克后339个假定聚SUMO结合物的鉴定。(一个)左图：考马斯染色SDS-PAGE凝胶，显示从正常条件（37°C）或热应激（43°C）下生长30分钟的HeLa细胞中RNF4wt洗脱的蛋白质和RNF4mt纯化的多聚SUMO结合物。显示MW标记，右侧显示九个切片的明显MW边界。右：九个切片中每个切片中发现的所有蛋白质的预测分子量的频率直方图。粉红色阴影区域显示切片的明显MW区域。(B类)与RNF4wt结合但不与RNF4mut结合的971种蛋白质的表观分子量和预测分子量之间的分子量差异（ΔMW）的频率直方图。直方图的彩色区域表示ΔMW值与未修饰蛋白质一致（灰色），与SUMO分子的单个或多个副本一致（红色）。(C)比较所示数据集中已知SUMO底物和ψKxE/D SUMO共轭共有基序的频率。该比较显示了从粗HeLa提取物中鉴定出的2663个蛋白质的数据，以及本研究中鉴定的全部蛋白质列表（971个蛋白质），以及SUMO化学计量比为0和1（“0+1”；632个蛋白质）或2或更多（“2+”；339）的亚群。星号表示筛选冗余列表。(D类)RNF4纯化物的Western blot分析，无论是模拟的还是经SENP1处理的，带有指示的抗体。mut，突变体；MW，分子量；PML，多粒细胞白血病；RNF4，环形填料4；SDS-PAGE、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；SUMO，小泛素样修饰物；wt，野生型。

聚SUMO底物的生物学作用

这里获得的polySUMO数据的本体分析(图4A)表明本研究结果与串联亲和纯化（TAP）-SUMO2热休克蛋白质组相一致(Golebiowski等人，2009年)许多蛋白质参与信使RNA（mRNA）代谢以及DNA结构、复制和修复。由于TAP–SUMO2方法纯化了所有化学计量学的SUMO结合物，因此表明具有这些功能的蛋白质不仅在热休克反应中经历了增加的总SUMO化，而且还针对多SUMO酸化。有趣的是，发现具有不同功能的蛋白质在特定的SUMO化化学计量中主要发生了修饰(图4B). 例如，涉及染色质结构和转录的蛋白质几乎完全被五个或更多SUMO分子修饰。参与DNA复制和修复的蛋白质也被聚SUMO化，尽管它们在三个、四个和五个以上的化学计量组中有代表性(图4B-D)而mRNA剪接蛋白在所有SUMO化化学计量中都过度表达(图4B). 由于该方法专门纯化多SUMO结合物，因此建议这些蛋白质中的许多是mRNA剪接因子大复合体的成员，其不同成分在不同的化学计量学中与SUMO偶联。

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图4

参与DNA复制和修复的蛋白质在热应激反应中发生多糖基化。(一个)对整个数据集和“2+”集进行Panther生物过程基因本体分析，并与TAP–SUMO2底物和来自Golebiowski等人（2009年). (B类)与中的相同一个，除RNF4纯化数据集被分为六组，代表所示的不同SUMO化化学计量学，并且仅考虑所示的基因本体术语。(C,D类)DNA修复和检查点控制相关蛋白质的网络分析。标签是基因名称；节点形状表示蛋白质功能：菱形、酶；椭圆，转录调控因子；三角形，激酶；圆形，其他功能。线条表示直接交互。节点根据SUMO化化学计量比着色。使用“创新路径分析”创建网络(网址：www.intenuity.com). 信使核糖核酸；SUMO，小的泛素样修饰语。

讨论

自发现多SUMO化以来的9年中，几乎没有底物被鉴定出来。在这里，我们利用RNF4的聚SUMO结合能力和含SIM的肽的特异洗脱，从细胞提取物中纯化内源性聚SUMOylated蛋白。这就产生了一种高纯度的材料，适用于高分辨率质谱分析。

到目前为止，低氧诱导因子1α（HIF1α；Matic等人，2008年)，第1部分(Martin等人，2009年)，排名前2(Takahashi&Strunnikov，2008年)增殖细胞核抗原（PCNA）；Windecker&Ulrich，2008年)和PML蛋白(Tatham等人，2008年)已被鉴定为多SUMO共轭物。在我们的分析中，除HIF1α外，发现了所有这些蛋白质，并且PCNA被鉴定为聚SUMO底物，但未被归类为聚SUMA底物。这些发现并不意外，因为在缺氧条件下检测到多聚磺胺酰化HIF1α(Matic等人，2008年)PCNA的SUMO化似乎依赖于DNA损伤(Parker等人，2008年). 有趣的是，并非所有的多糖基化蛋白对热休克的反应都是相同的。尽管热冲击增加了PARP1的改性(补充图S4A在线；补充数据集2在线），PML的共轭状态没有改变(补充图S4B在线；补充数据集2在线）。因为PARP1是目前已知的唯一在热休克时发生多糖基化的蛋白质(Messner等人，2009年); 这些发现表明，这种方法可以准确地表征多糖基化蛋白的修饰状态体内.

除了与其他蛋白质无特殊关联的蛋白质外(图4C、D)，有许多完整的蛋白质复合物被RNF4纯化的例子，其中许多成员似乎没有被氨酰化（参见补充图S6在线）。这加强了在非变性条件下研究SUMO蛋白质组时对稳健数据过滤策略的要求，尽管它允许研究蛋白质复合物的组成。

参与信使核糖核酸转录或转录调控的蛋白质在热休克时似乎不会变得聚SUMO化，而参与检查点反应和DNA修复的蛋白质会(图4). 这与酵母的基因研究一致，在酵母中ulp 2号机组编码负责polySUMO链编辑的蛋白酶的基因导致表型包括DNA损伤-检查点诱导的细胞周期阻滞恢复缺陷(Schwartz等人，2007年).

由于SUMO-SIM相互作用在酵母和脊椎动物中是保守的，该方法应适用于从任何细胞系或生物体中分离内源性SUMO修饰物种。

方法

克隆、蛋白质表达和纯化。RNF4氨基酸32-132的野生型（RNF4wt）或SIM突变体（RNF4mut）(Tatham等人，2008年)被克隆到pHis–TEV–30a中。蛋白质表达于大肠杆菌Rosetta（DE3）细胞，使用Ni-NTA琼脂糖纯化，然后进行His-tag裂解和Superdex 75色谱。将碎片与NHS活化的Sepharose珠偶联。

重组多聚SUMO和多泛素下拉。将聚合物与RNF4珠在50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、1%NP40和0.5%脱氧胆酸盐中在4°C下孵育1.5 h。然后用相同的缓冲液用250 mM NaCl洗涤珠五次，并按指示洗脱。

细胞分离。HeLa细胞在Eagle含有2 mM的最小基本培养基中悬浮培养L（左）-谷氨酰胺、10%胎牛血清、50 U/ml青霉素和50μg/ml链霉素，37°C，密度为8–10×10⁵每毫升细胞数。

通过离心法收集细胞（500克，4°C，15分钟），并在含有200 mM碘乙酰胺的冰镇磷酸盐缓冲盐水中清洗四次。接下来，在缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.9，1.5 mM MgCl）中的冰上培养细胞₂，10 mM氯化钾₂0.07%NP40，完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（罗氏）和200 mM碘乙酰胺）15分钟。细胞被冰块上的豆浆均质（40 ml豆浆和紧杵）破坏。通过离心法收集细胞核（2000年克，4°C，5分钟）。在冰上超声处理之前（6×20 s，振幅18%，大尖端Branson数字声波发生器），将细胞核颗粒再次悬浮在50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、1%NP40、0.5%脱氧胆酸盐、200 mM碘乙酰胺和蛋白酶抑制剂片中。对核提取物进行离心分离（100000克，4°C，1小时）。

SUMO-结合隔离。将375 mg体积的核裂解物与800 ml RNF4珠在4°C的转子上孵育1.5 h。用50 mM Tris（pH 7.5）、250 mM NaCl、1%NP40和0.5%脱氧胆酸盐对珠进行五次洗涤，与之前一样在洗涤缓冲液中与1μg/μl SIM肽孵育，并回收上清液。洗脱后的蛋白质经三氯乙酸沉淀。在进行凝胶内胰蛋白酶消化和质谱分析之前，将含有RNF4下拉菜单的通道切成九个部分（有关质谱和数据分析的详细信息，请参阅补充信息在线）。

补充信息EMBO提供报告联机(http://www.emboreports.org).

补充材料

致谢

脚注

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