癌基因-肿瘤抑制级联通过协同激活Ras和NF-κB驱动转移性前列腺癌

损失DAB2IP（数字音频广播）促进前列腺肿瘤形成和广泛转移

当将永生化PrEC原位注射到小鼠前列腺中时，如前所述，前列腺中出现了界限清楚的良性生长²³病变表现出低增殖指数、显著的凋亡水平和退化（9/15完全退化）(图1g和补充图2a、b). 然而，注射表达致癌Ras的PrEC的动物^V12版本（15/15）或DAB2IP（数字音频广播）-特异性shRNAs（15/15），发生前列腺腺癌，表达细胞角蛋白8、PSA和少量p63，类似于高级人类肿瘤(图1g，h). Ras公司^V12版本和DAB2IP（数字音频广播）-缺陷肿瘤具有高度增殖性，几乎没有细胞凋亡，生长动力学相似，最大大小相似(图1g，i，j和补充图2b、c). 注射DAB2IP重组细胞的动物与对照组相似：大多数病变在45天内消退，并且或很小(图1g，补充图2c).

然而，鉴于H-Ras^V12版本-驱动肿瘤仍然是非侵袭性的，从未扩散DAB2IP（数字音频广播）-缺乏肿瘤具有侵袭性和转移性(图2，补充图2d). 肿瘤侵犯臀部、腰肌和膀胱(图2b)²⁴从45天开始，在肝脏、近端和远端淋巴结、精囊、睾丸和输精管中观察到转移(图2c和补充图2d). LgT免疫染色和基于序列的SNP基因分型证实转移酶来自PrEC(图2c、d和补充图3a)，并且从未从被救出的细胞中观察到DAB2IP（数字音频广播）肿瘤细胞可以很容易地在淋巴管和血管中检测到，这两个血管系统都参与了转移(图2d). 动物也出现血栓栓塞，这是一种在前列腺癌患者中观察到的危及生命的并发症(补充图3b)²⁵。这些肿瘤的转移潜能可以通过氙气成像得到最好的评价(图2e). 窝藏老鼠DAB2IP（数字音频广播）-与Ras患者相比，缺陷肿瘤患者的生存率降低^V12版本-表达肿瘤(图2f；P（P）=0.03 Mann-Whitney U试验）。因此，DAB2IP（数字音频广播）-抑制促进前列腺肿瘤的发生，并独特地触发转移。

在单独的窗口中打开

图2

DAB2IP缺失，但非H-Ras^V12版本促进侵袭和广泛转移

（a）注射H-Ras的小鼠原发性肿瘤的组织学显微照片^V12版本-表达PrEC细胞。比例尺=5mm。（b）注射DAB2IP（数字音频广播）-缺乏PrEC细胞。第二组显示了使用LgT抗体的免疫组织化学。比例尺=5mm，除腰肌和膀胱外，比例尺=1mm。（c）注射DAB2IP缺陷型PrEC细胞的小鼠转移瘤的组织学显微照片。在相邻切片上使用LgT抗体的免疫组织化学在每个转移瘤下方显示高倍，但淋巴结除外，淋巴结上显示H&E染色。比例尺（肝和SV）=5mM；（LN、睾丸、VD）=1nM。（d）血管（BV和箭头）和淋巴管（LV）内含有肿瘤细胞（T）的组织的H&E染色切片。当用线条指定时，会显示放大率更高的图像。两个面板显示LgT染色。比例尺（面板1、2、4）=1 mM；（面板3、5、6）=200μM。（e）小鼠原位注射荧光素酶表达控制、DAB2IP缺陷或H-Ras的异种基因图像^V12版本-表达细胞。（f）DAB2IP缺陷动物与H-Ras的存活曲线^V12版本-表达肿瘤。

RasGAP活性是DAB2IP部分但并非全部肿瘤/转移抑制功能的基础

因为DAB2IP是一种RasGAP，我们研究了Ras异常激活是否与这些表型有关。我们扩大了分析范围，将转移的人类前列腺癌细胞纳入其中DAB2IP（数字音频广播）表观遗传学沉默（PC-3细胞），以更直接地评估DAB2IP（数字音频广播）-人类癌症的损失²¹PC-3和DAB2IP（数字音频广播）-用野生型重组缺失的PrEC细胞DAB2IP（数字音频广播）或GAP缺失点突变。野生型DAB2IP对这些细胞系的增殖有细微影响在体外表明DAB2IP生理水平的重新引入本身不会导致生长停滞(补充图4). DAB2IP蛋白的表达与内源性水平相同(图3a、b、f). 野生型DAB2IP降低了Ras-GTP、pERK和pAKT水平，而RasGAP突变体（R289L）没有抑制这些效应器(图3b).

在单独的窗口中打开

图3

DAB2IP的RasGAP活性是其部分但非全部肿瘤/转移抑制功能的基础

（a）免疫印迹比较表达野生型DAB2IP或DAB2IP-R289L的PrEC、PC-3和PC-3细胞中DAB2IP的表达。（b）免疫印迹评估DAB2IP和DAB2IP-R289L对PC-3中Ras、ERK和AKT激活的影响，如方法中所述（c）小鼠注射a和b的PC-3细胞的异种基因图像。（d）通过Xenogen图像计算PC-3衍生肿瘤的体积。（e）描绘注射表达野生型DAB2IP或DAB2IP-R289L的PC-3细胞的动物中每只小鼠的转移数量的点图。（f）DAB2IP免疫印迹对应于e。（g）（左）显示PrEC肿瘤最终重量的条形图。（右）一个点图，描绘注射表达PrEC细胞的动物中每只小鼠的转移数量DAB2IP公司shRNA1或2单独或与野生型或DAB2IP-R289L一起使用。（Mann-Whitney U；P（P）= 0.0030)（h）（左面板顶行）表达慢病毒载体控制、DAB2IP特异性shRNA或活化Ras等位基因的永生化PrEC细胞的相图像。（中排，左面板）间充质标记物波形蛋白或（下排，左板）上皮标记物E-cadherin的免疫荧光染色。（中面板）免疫印迹检测DAB2IP、异位Ras、纤维连接蛋白、波形蛋白、E-cadherin的表达。（右面板）进行实时PCR以量化波形蛋白、E-cadherin和扭转表达，以响应DAB2IP缺失或激活的Ras等位基因。（i）DAB2IP缺陷或H-Ras中波形蛋白（绿色）和E-钙粘蛋白（红色）免疫荧光染色的共焦图像^V12版本-表达肿瘤。所有标尺=100μM。

注射PC-3细胞的小鼠发生转移性前列腺癌(图3c–e). 野生型DAB2IP显著抑制肿瘤发展(图3d，P（P）= 3 × 10⁻⁸Mann-Whitney U检验）和转移(图3c、e); 然而，DAB2IP-R289L不能抑制肿瘤生长，表明RasGAP活性对其抑瘤功能至关重要(图3c、d；P（P）= 0.71). 然而，这种突变部分抑制了转移：只有3/6只动物发生转移，观察到的转移较少(图3e；P（P）= 0.0083). 使用PrEC确认了这些发现(图3f，g)并提示DAB2IP的其他区域存在转移抑制活动。

DAB2IP是EMT的有力监管机构

有趣的是，DAB2IP（数字音频广播）-PrEC的消融还诱导了上皮细胞向间充质细胞的转化（EMT）：一种动态的细胞过程，被认为是通过促进侵袭、灌注和外渗而导致转移的基础^26–28EMT通过显示间充质标记物波形蛋白、扭曲和纤维连接蛋白的增加以及膜结合E-钙粘蛋白的伴随减少得到证实(图3h，补充图5)²⁹.DAB2IP（数字音频广播）抑制也增强了入侵(补充图5a). EMT在96小时内同步发生，并不是由于特定细胞亚群的生长(补充图6). 相比之下，Ras^V12版本是EMT的弱得多的监管机构(图3h).

还观察到EMT体内，正如波形蛋白表达所示，波形蛋白在这些高转移病灶边缘的细胞中观察到(图3i). 在每一个检查的肿瘤中都观察到了这种表达模式(n个=12），检测到的波形蛋白存在于肿瘤细胞中，而不是基质中，因为抗体只识别人类蛋白质。在转移性乳腺癌模型中也描述了类似的发现，并支持环境因素有助于EMT和转移的假设^28，30Ras表达的肿瘤从未出现EMT的证据(图3i)支持以下假设：DAB2IP（数字音频广播）-EMT缺失是转移的基础。

DAB2IP缺失通过NF-κB促进转移

虽然Ras可以促进EMT，但过多的信号调节着这种转变²⁷有趣的是，除了其RasGAP活性外，DAB2IP还可以通过与TRAF2的直接相互作用，通过与RasGAP结构域不同的区域，抑制内皮细胞中的NF-κB³¹值得注意的是，NF-κB在EMT中起着关键作用，许多EMT相关基因，包括twist，都是NF-κ³²在其他模型系统中，NF-κB也促进肿瘤进展和转移³³因此，我们询问DAB2IP（数字音频广播）-缺失通过激活NF-κB触发EMT和转移。

异位DAB2IP抑制内皮细胞中的NF-κB，但是否DAB2IP（数字音频广播）-这种缺失会激活前列腺细胞中的NF-κB。DAB2IP清除激活的NF-κB(图4a)PrEC中转录目标的表达增加(图4b)³⁴相反，DAB2IP重组抑制PC-3中的NF-κB和靶基因(图4a、c). DAB2IP周期性结构域中阻止TRAF2结合的点突变（S604A）在抑制内皮细胞NF-κB活性方面有缺陷³¹DAB2IP-S604A不能有效抑制NF-κB，但仍能抑制Ras(补充图7a、b). 该突变体在抑制侵袭和EMT方面也有缺陷，这表明NF-κB介导这些表型以响应DAB2IP（数字音频广播）-损失(补充图7). 这一点通过引入一种显性阴性IKBα蛋白得到证实，该蛋白在两种模型系统中抑制NF-κB活性、侵袭和EMT(补充图5和数据未显示）。然而，与Ras进入NF-κB途径的概念一致³⁵DAB2IP双突变体（R289L和S604A）在抑制侵袭、EMT和NF-κB方面缺陷更大，说明了这两个域/信号之间的协同作用(补充图7).

在单独的窗口中打开

图4

DAB2IP（数字音频广播）-缺失通过对Ras和NF-κB的协同作用促进肿瘤发生和转移

（a）（左）在PrEC细胞中，NF-κB活性被报道为相对荧光素酶单位（RLU），以响应DAB2IP抑制。（中）NF-κB活性对PC-3细胞中DAB2IP重建的反应。（右）DAB2IP免疫印迹。（b）Q-PCR测定在不含TNF-α的情况下，在含有和不含DAB2IP shRNA的PrEC细胞中NF-κB靶点的表达，（c）在TNF-α存在的情况下，通过Q-PCR在具有和不具有DAB2IP cDNA的PC-3细胞中测定NF-κB靶标的表达。（d）重组PC-3细胞的DAB2IP免疫印迹。IκB超表达，如补充图7b.（e）根据异种图像计算PC-3细胞的肿瘤体积。（f）描述注射PC-3细胞的每只小鼠中检测到的转移瘤数量的点图。（g）小鼠注射来自d-f的PC-3细胞的异种基因图像。上述Ras和NF-κB状态总结了表达突变体的生化效应。图像下方的数字表示发生转移的动物数量/注射的动物数量。（h）来自对照PrEC细胞、带有3′UTR shRNA（3′UTRs）的PrEC电池、用DAB2IP（cDNA）或S604A突变体重建的3′UTR-细胞的肿瘤最终重量。表达式被确定为等效（未显示）。（i）描绘每只小鼠注射PrEC细胞后h内检测到的转移瘤数量的点图。（j）使用识别DAB2IP缺陷和H-Ras中NF-κB、pERK和pAKT的抗体进行免疫组织化学^V12版本-表达肿瘤。比例尺=200μM。

值得注意的是，有效抑制Ras而非NF-κB的DAB2IP突变体（S604）抑制了原发性肿瘤的生长，支持了Ras对肿瘤起始很重要的结论(图4e，h；P（P）=1.65×10-7，Mann-Whitney U）。然而，当肿瘤较小时，5/10的小鼠发生了转移，这表明异常的NF-κB活性促进了肿瘤的扩散(图4f–i). 因此，显性负性IKBα对原发性肿瘤的发展没有影响(图4e，g)，但显著抑制了转移(图4f，g；P（P）= 0.005). DAB2IP双突变体（R289L/S604A）没有抑制原发性肿瘤的发展(P（P）=0.48）或转移(P（P）= 0.31) (图4ei).

我们的结论是DAB2IP（数字音频广播）-前列腺癌中缺失诱导Ras和NF-κB的激活。Ras在原发性肿瘤生长中起重要作用，而NF-κB则驱动转移。有趣的是，我们发现^V12版本和DAB2IP（数字音频广播）-前列腺肿瘤中ERK和AKT丢失激活，NF-κB仅在DAB2IP（数字音频广播）-核转录因子-κB的核质染色证明了肿瘤的缺陷，支持DAB2IP对核转录因子κB有明显影响的结论(图4j和补充图8a). 因此，我们还观察到DAB2IP（数字音频广播）-缺陷性肿瘤(补充图8b). 这些观察结果挑战了Ras和NF-κB在该肿瘤类型中以简单线性途径存在的概念。

DAB2IP是一个重要的EZH2目标

这些研究确定了驱动转移性疾病的信号级联，并提供了一个易于处理的模型系统来研究其他基因参与转移。另一个与转移性前列腺癌有关的基因是EZH2型编码多梳抑制复合物2（PRC2）的组蛋白甲基转移酶成分并调节表观遗传基因沉默³⁶.EZH2型在许多肿瘤类型中过度表达，其表达与肿瘤分级相关³⁶.EZH2型也被确定为转移性前列腺癌中差异最大的上调基因³⁷; 然而，EZH2从未被证明能驱动转移，因此EZH2-在这一过程中的因果作用尚待确定。

已确定250多个PRC2/EZH2目标，包括DAB2IP（数字音频广播） ^22，38–39因此，我们询问EZH2是否会诱发转移性前列腺癌，并调查了EZH2-DAB2IP（数字音频广播）-EZH2驱动表型的沉默。特别是异位EZH2型促进侵袭性前列腺癌向近端和远端淋巴结、肝脏和脾脏转移(图5a，补充表1). 像DAB2IP缺陷肿瘤一样，EZH2型-淋巴管和血管中检测到驱动肿瘤，小鼠出现血栓栓塞(图5a).

在单独的窗口中打开

图5

EZH2通过抑制DAB2IP（数字音频广播）

（a）原位注射表达EZH2的PrEC细胞的肿瘤和转移的组织学图像。在淋巴管（LV）和血管（BV）内观察到肿瘤细胞，呈圆形。所有动物的转移数据都在补充表1.（b）（左）表达载体控制或EZH2的永生化PrEC细胞的DAB2IP免疫印迹。顶级乐队是EZH2。（右）用异位DAB2IP-V5重建的b细胞的免疫印迹。（c）通过实时PCR测定响应EZH2的内源性DAB2IP mRNA表达的抑制。（d）结合DAB2IP启动子的EZH2染色质免疫沉淀。（e）根据注射有表达EZH2或EZH2和DAB2IP的细胞的动物的异种移植物图像计算的肿瘤体积。（f）描述注射EZH2-表达或EZH2/DAB2IP表达的PrEC细胞的每只小鼠中检测到的转移瘤数量的点图。（g）注射有原位注射的表达EZH2或表达EZH2/DAB2IP的PrEC细胞的小鼠的存活曲线。（h）使用p-ERK、p-AKT和NF-κb（p50）抗体对EZH2-表达或EZH2/DAB2IP表达的PrEC衍生肿瘤进行免疫组化。（右侧面板）。使用人类波形蛋白（绿色）e-cadherin（红色）抗体对EZH2-表达或EZH2/DAB2IP表达的PrEC衍生肿瘤进行共焦免疫荧光成像。（i）免疫印迹评估EZH2和DAB2IP重建对PrEC细胞Ras、ERK和AKT激活的影响，如方法所述（j）注射i所示细胞的小鼠中检测到的肿瘤最终重量和转移数量。所有标尺=200μM，共焦图像除外，其中标尺=100μM。

EZH2过度表达现象的观察DAB2IP（数字音频广播）-损失表明DAB2IP（数字音频广播）可能是转移性前列腺癌EZH2的关键靶点。EZH2抑制PrEC中DAB2IP蛋白和mRNA的表达(图5b、c)在其他细胞系中观察到²¹染色质免疫沉淀表明EZH2与DAB2IP（数字音频广播）启动子，显示直接转录抑制DAB2IP（数字音频广播）由EZH2提供(图5d). 当用内源性DAB2IP水平重建EZH2表达细胞时，肿瘤生长受到抑制，2/14例肿瘤最终消退(图5e，P（P）= 4 × 10⁻¹²). 此外，虽然EZH2衍生肿瘤的动物在8-12周内检测到转移，但DAB2IP阻止了转移，即使是存活一年的动物(图5f). 因此，注射DAB2IP表达细胞的动物比注射单独表达EZH2细胞的动物存活时间更长(图5g；P（P）= 2.3 ×10⁻⁴，Yates修正）。

EZH2还激活了Ras、ERK、AKT和NF-κB，而DAB2IP重组显著抑制了激活(图5h，5i). 此外，比如DAB2IP（数字音频广播）-缺乏肿瘤、转移性EZH2表达病灶也在侵袭边缘进行EMT，DAB2IP重组阻止了EMT(图5h). 还观察到EMT在体外(补充图9). 最后，GAP-结构域（R289L）和周期样结构域（S604A）突变体在EZH2表达细胞中对Ras信号的影响与DAB2IP缺陷的PrEC和PC-3细胞相同(图5i)，原发性肿瘤生长和转移(图5j). 因此，EZH2通过表观遗传抑制DAB2IP来激活Ras和NF-κB，提供了表观遗传调节剂激活这两个主要信号通路的分子机制(图6a).

在单独的窗口中打开

图6

DAB2IP在人类前列腺癌中被抑制

（a）EZH2如何调节DAB2IP、Ras和NF-κB促进肿瘤发展和转移的模型。（b）正常小鼠前列腺、DAB2IP缺陷的PrEC衍生肿瘤或Ras-driven肿瘤的DAB2IP免疫组织化学染色。（c）（Top）用DAB2IP抗体对正常人前列腺上皮进行免疫组织化学染色。（底部）同一活检组织中正常人体组织和邻近肿瘤组织（T）的免疫组织化学DAB2IP染色。（d）人前列腺癌组织中DAB2IP抗体的免疫组织化学染色。（右）图像的高倍放大。箭头表示基质细胞。（e）前列腺上皮内瘤变（PIN）和前列腺癌（PCa）与良性前列腺组织中DAB2IP蛋白表达的直方图(P（P）= 1.8 × 10⁻²⁷).（f）比较DAB2IP表达和Gleason等级（非分数）的直方图，评估为每个核心上最普遍的模式(P（P）= 0.001). 由于阵列上的组织切片相对较小，因此他们被指定为Gleason分级（1-5），而不是Gleason评分（1-10），后者代表整个肿瘤中两个最常见分级的总和。因此，4级和5级肿瘤是高级肿瘤。（g）前列腺癌与正常组织中DAB2IP mRNA表达数据的方框图(P（P）= 2.0 × 10⁻⁷)在高级别肿瘤中，而不是低级别良性组织中(P（P）= 0.003).（h，i）的表达式DAB2IP（数字音频广播）单个肿瘤和转移病灶中EZH2水平的对比。所有标尺=400μM。

质粒、逆转录病毒和慢病毒感染

识别DAB2IP2IP、NF1和p120RasGAP的慢病毒pLKO shRNAs来自Broad Institute RNAi联盟。NF1 shRNA#1：正义5′-CAACAACTTCAATGTCT-3′，反义5′-AAGACTGCATTG-3′；NF1 shRNA#2：感觉5′-TTATAAATAGCTCTGAAAGG-3′，反义5′-CCTTTCCAGCTATTATAA。p120RasGAP shRNA#1:1顺义5′-GCTGCCTAACTACTATCTT-3′，反义5′-AAAAA GCTGCCTACTACTCC-3′；p120RasGAP shRNA#2：意义5′-CCCCTACATGGAAGGTGTCAAT-3′；反义5′-TAAAACCTACATGAGGTG-3′。EZH2 shRNA#1：有义5′-CGAAATCTTAAACCAAGAAT-3′，反义5′-CAAAAACGGAAATCTTAAAC-3′；shRNA#2：感觉5′-TATGCCTCACCACTGC-3′；反义5′-CAAAATATTGCCTTCACC-3′。如前所述，通过蛋白质印迹或Q-PCR评估敲除。逆转录病毒和慢病毒感染按说明进行^16，23通过RT-PCR扩增出全长DAB2IP cDNA，克隆到pLenti4/V5-DEST载体（Invitrogen）中，并对其序列进行了验证。将EZH2 cDNA克隆到pBabe-myc逆转录病毒载体中。使用PMMP-luc-neo逆转录病毒荧光素酶构建物⁴⁸.

软琼脂试验

如前所述，使用MEF或PrEC细胞进行Sof琼脂分析¹⁶用ImageJ分析菌落大小。

NF-κB报告子分析

2×10⁴将细胞接种在24孔板中，一式三份。18小时后，使用Fugene6（Roche）将100ng的pNF-κB-荧光素酶（BD Bioscience）或pISRE-荧光素酶（Stratagene）加上25ng肾素编码质粒（pRL-TK）在三个孔中转染。转染后36 h，使用双荧光素酶报告试剂盒（Promega）测量荧光素瘤酶活性和Renilla活性。所有数据均归一化为相对荧光素酶光/Renilla单位。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析

如前所述进行ChIP分析⁵⁰使用ChIP分析试剂盒（上游）。

免疫印迹和免疫荧光

针对最后120个C末端氨基酸WF17.1（DFCI核心设施）生成DAB2IP单克隆抗体。杂交瘤上清液的稀释度为1:6。NF1抗体（Santa Cruz，SC-67D），p120RasGAP（转导实验室）；微管蛋白（Sigma）；磷酸化ERK（Ser473）、磷酸化AKT、总ERK和总AKT（细胞信号技术）；E-cadherin（圣克鲁斯），人类波形蛋白（DakoCytomation，Glostrup，丹麦）；和单克隆EZH2（BD）或多克隆EZH2（Invitrogen）。用Alexa fluor 488与小鼠或兔二级抗体（分子探针）结合进行免疫荧光。使用蔡司LSM410共焦显微镜系统进行共焦成像。

定量实时PCR

使用Trizol（Invitrogen）分离总RNA。特定基因的探针是从应用生物系统公司获得的。使用iscript（Applied Biosystems）进行定量实时PCR。每一反应均进行三次，并将数值归一化为GAPDH。

原位移植

从Jackson实验室获得狂犬病雄性裸鼠（nu/nu；6周龄）。动物处理和实验程序由哈佛医学院动物和比较医学中心根据NIH实验动物护理和使用协会和动物福利法案批准。如前所述进行了原位植入²³简单地说，细胞悬浮液5 10⁵/将10μL溶于50μL 1:1 PBS∶基质凝胶（BD Biosciences）中的溶液注射到前列腺中。

免疫组织化学和组织芯片

从5个不同的区域计数500个细胞，并对Ki67阳性细胞/DAPI阳性细胞的百分比进行评分。人类前列腺组织样本是在布莱根妇女医院IRB批准后采集的，用于构建组织微阵列（TMA）。重新评估每个岩芯的Gleason等级，以确保这些小组织切片的准确性。使用标准的亲和素-生物素复合物免疫组织化学方案来评估DAB2IP蛋白的表达（4°C下，1:6过夜）。使用自动成像系统Ariol SL-50（应用成像）扫描TMA幻灯片，并将图像导入TMAJ，TMA数据管理的基于web的软件。免疫染色在不考虑临床病理信息的情况下进行评估，评分为阴性（0）、弱（1）、中度（2）或强（3）。复制核心的平均值用于与临床结果的相关性。采用单变量Cox回归分析评估DAB2IP预测PSA失败时间的能力，定义为前列腺癌根治术后血清中PSA水平大于0.2 ng/mL。

统计分析

如果数据是正态分布的，我们使用学生的t吨测试。否则采用Mann-Whitney U检验。所有分析均使用SYSTAT 12软件包进行。文本和图例中注明了具体测试。

基因表达分析

本研究中讨论的基因表达数据来自Oncomine癌症微阵列数据库。

PMMP-luc-neo逆转录病毒荧光素酶构建物由Andrew L.Kung和M.Chheda慷慨提供。pRL-TK是J.Boehm送的礼物。我们感谢D.Barbie、J.Boehm和R.Chen提供的NF-κB试剂，以及G.Evan提供的有益讨论。这项拨款得到了国防部（PC074048）和达纳-法伯/哈佛癌症中心路德维希中心的部分支持。