RhoGDI家族在调节Rho GTPases中通常被降级为次要角色1为了探讨RhoGDI1的功能，我们分析了耗尽RhoGDI 1对哺乳动物细胞的影响。当siRNA去除RhoGDI1后，主要Rho GTPase的蛋白质水平，包括RhoA、RhoC、Rac1和Cdc42显著降低(). 这发生在多种细胞类型中，包括HeLa、成纤维细胞、乳腺上皮、黑色素瘤和内皮细胞(，补充图S1a–d). 不绑定RhoGDI1的RhoB不受RhoGDI沉默的影响(和补充图S2a，b). RhoA、Rac1和Cdc42的mRNA水平保持不变，表明转录后机制是Rho蛋白减少的原因(). 事实上，蛋白酶体抑制剂，如LLnL，但不是钙蛋白酶或组织蛋白酶抑制剂，部分地挽救了Rho蛋白的降解，这表明没有RhoGDI1，GTPase被蛋白酶体清除(和数据未显示）。通过表达siRNA-resistant RhoGDI1实现了对降解的拯救(和补充图S2d). 第二个独立的RhoGDI1 siRNA产生了类似的效应（数据未显示）。Rho-GTP酶和RhoGDI之间的相互作用对于防止GTPase降解至关重要，因为siRNA-resistance突变体不能结合Rho-GTPase2未能挽救RhoGDI1耗竭的影响(). 野生型RhoGDI1而非GTPase结合缺陷突变体的过度表达增加了RhoA和Rac1的总水平(). 这些结果表明RhoGDI1稳定Rho蛋白，保护它们不被降解。
RhoGDI1缺失触发真核细胞中Rho蛋白的降解和激活(一)对照组或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞的裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(b条)从对照细胞或RhoGDI1 siRNA转染细胞中纯化总RNA。用特异性引物对DNAse I处理的RNA进行RT-PCR。RT-PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行解析。(c（c）)用LLnL处理8小时的对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞的裂解液通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(d日)HeLa细胞与对照或RhoGDI1 siRNA和HA-标记的RhoGDI 1 RNAi抗性突变体共同转染。通过SDS-PAGE解析细胞裂解物，并通过蛋白质印迹进行分析。所有结果均代表至少3个独立实验。请注意，RhoGDI1缺失细胞中RhoA的降解可通过表达对siRNA耐药的RhoGDI 1而不是通过不结合Rho GTPases的Rho GDI1突变体来挽救。(e（电子）)转染HA标记的wt RhoGDI1或RhoGDI 1 D45/185A的HeLa细胞的裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。所有siRNA实验在转染后72小时进行分析。对于过表达实验，在siRNA转染48小时后，用所示cDNA转染细胞，并再培养24小时(（f）)用对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞72小时。用GST-RBD或GST-PBD珠从细胞裂解液中提取活性Rho GTPases。结合蛋白和总细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(克)定量RhoGDI1-缺失细胞（黑条）相对于对照细胞（白条）中RhoA、Rac1和Cdc42的激活。*RhoA、Rac1和Cdc42在双尾非配对学生t检验中分别为p=0.0108、p=0.0146和p=0.0229，误差条表示三个独立实验的平均值标准误差。(小时)对照细胞或RhoGDI1 siRNA转染细胞被分为胞浆和膜组分，通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。TfR代表转铁蛋白受体。(我)用RhoA-miR-shRNA-expressing腺病毒感染HeLa细胞或用RhoGDI1 siRNA转染HeLa淋巴细胞72小时。用GST-RBD将活性RhoA去除。通过SDS-PAGE解析总细胞裂解物和GST-RBD结合蛋白，并通过蛋白质印迹进行分析。(j个)使用GTP-RBD或GST-PBD珠将野生型或Rdi1d酵母菌株中的活性Rho GTPase拉下。结合蛋白和总细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。Sso蛋白用作负荷控制。(k个)对照野生型Cdc42和Rho1的免疫荧光染色(无线电数据接口1)和rdi1型Δ应变。比例尺为8µm。(我)对照野生型偏振光芽染色强度的定量(无线电数据接口1)和rdi1型Δ应变。数据通过双尾学生t检验（p＜0.005）进行分析，误差条代表三个实验的标准偏差。
尽管RhoGDI1缺失后RhoA、Rac1和Cdc42水平显著降低，但活性Rho蛋白的数量要么显著增加（Rac1与Cdc42），要么保持不变（RhoA）()，这表明GTPase剩余池中有很大一部分处于活性GTP结合状态。虽然活性增加了2倍，但由于GTPase蛋白水平的降低，活性GTPase与总GTPase的比率增加了10倍(). 在稳定状态下，活性GTPase占总RhoA的1%，而在没有RhoGDI1的情况下，其峰值为10%(). RhoGDI1耗竭后，大多数RhoA位于膜部分，表明大部分降解的蛋白质来自细胞溶质池()并且活性部分与膜相关联。相反，当单个GTPase沉默时，蛋白质水平和活性都会相应降低(). 这些结果突出了GDI蛋白在调节Rho GTPases的蛋白水平和激活状态方面的重要性。其他细胞类型（WM2664和HUVEC）中RhoGDI缺失导致Rho蛋白水平类似下降(补充图S1a–d)而其余部分的活性要么升高要么不变(和图S1d). Gorovoy等人在研究HUVEC时还发现，RhoGDI敲除促进了RhoA的激活，尽管Rho蛋白的表达没有这里观察到的那么低，可能是因为敲除只允许进行30小时三。在更长的时间间隔内实现更完整的RhoGDI1敲除和Rho GTPase降解(补充图S1e).
RhoGDI1缺失损害细胞迁移(一)对照组或RhoGDI1 siRNA转染的HeLa细胞融合单层产生的伤口闭合的时间过程分析。该图用代表标准偏差（n=10）的误差条描述了伤口区域。(b条)对照或RhoGDI1 siRNA转染的WM2664黑色素瘤细胞的融合单层上产生的伤口闭合的时间过程分析。该图用代表标准偏差（n=6）的误差条描述了伤口区域。(c（c）)对照组或RhoGDI1 siRNA转染的WM2664黑色素瘤细胞的速度分析。数据通过双尾非配对学生t检验进行分析（p=1.72×10−14)误差条分别表示n=28和n=56个单元格的平均值（s.e.m.）的标准误差。对照组和RhoGDI1敲除细胞的平均速度分别为12.74μm/min和5.64μm/min。(d日)用对照或RhoGDI1 siRNA转染WM2664黑色素瘤细胞72小时。分别用GST-PBD或GST-RBD珠从细胞裂解液中提取活性Rac1和活性RhoA。结合蛋白和总细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(e（电子）)通过SDS-PAGE解析对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞的细胞裂解物，并通过Western blotting进行分析。请注意，尽管RhoA和Rac强烈激活，但Rho蛋白效应器并未激活。(（f）)从补充信息电影1中提取的图像描绘了一个用荧光标记的RhoGDI1 siRNA（红色箭头）转染的WM2664黑色素瘤细胞和两个用未标记的对照siRNA（白色和黑色箭头）转导的WM2644细胞随时间迁移。右边的面板显示了在t0处拍摄的图像，用于识别用荧光标记的siRNA转染的细胞。比例尺为40µm。(克)对照组（左）或RhoGDI1（右）siRNA转染的WM2664黑色素瘤细胞的典型XY迁移轨迹。在2小时内每5分钟记录一次细胞的位置（n=10）。(小时)用对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞72小时后，将其分为细胞溶质或膜部分。膜组分通过在碘克沙醇密度梯度上离心进一步分离为质膜（PM）和ER膜（ER）。通过SDS-PAGE和Western blotting分析每个组分。(我)每个组分中RhoA、Rac1和Cdc42谱带相对强度的密度分析。注意，RhoGDI1沉默后，GTPase基本上从质膜部分消失。
为了确定RhoGDI功能的这一方面是否在进化上是保守的，我们分析了在酿酒酵母（RDI1）。令人惊讶的是，Rdi1蛋白的丢失还导致Cdc42和Rho1（RhoA正交）降解，同时保持高水平的活化(). 当通过免疫荧光分析时，Cdc42和Rho1在芽中的极化蛋白增加，这以前与这些蛋白活化形式的定位有关4，5(). 鉴于Rho1和Cdc42蛋白水平在rdi1型Δ应变。
RhoGDI1基因敲除小鼠是可行的，但表现出进行性肾脏缺陷，最终导致死亡6有趣的是，这些缺陷被归因于Rac1激活增加和肾脏Rho-GTPase水平降低7RhoGDI基因敲除小鼠的肾系膜细胞显示出生长和存活的改变8然而，RhoGDI1缺失的小鼠成纤维细胞在生长因子刺激下肌动蛋白细胞骨架的重组或在伤口愈合试验中测量的细胞迁移方面没有缺陷6.缺乏酵母细胞rdi1型，具有非常轻微的表型9尽管Rho蛋白水平和活性发生了显著变化，但对相对温和的表型感到惊讶，我们对此进行了进一步的探索。与之前的工作一致，当HeLa细胞中RhoGDI1被敲除时，伤口闭合率不受影响(). 然而，在伤口愈合试验中，RhoGDI敲除后，高度活动的黑色素瘤细胞的迁移速度显著降低()当分析单个细胞迁移时(和补充信息电影1）。考虑到Rac1活性增加，迁移速度的下降是意料之外的(). 然而，RhoA活性也成比例增加，可能抵消高Rac1活性的影响().
尽管RhoGDI1敲低影响了细胞迁移，但考虑到RhoGDI1缺失后Rho蛋白激活的惊人水平，我们对出乎意料的温和表型感到惊讶。研究RhoGDI2是否可以补偿RhoGDI 1的丢失，我们发现，在表达RhoGDI2的细胞（HeLa和HUVEC）中，RhoGDl2水平在RhoGD1KD后没有变化(补充图S1d和图S3c). 在WM2664和牙龈成纤维细胞中，RhoGDI2的表达无法检测到，并且不受RhoGDI 1沉默的影响(补充图S3c). 在HeLa细胞中，沉默GDI-1和GDI-2对伤口闭合速度没有影响(补充图S3a)，表明缺乏表型不是由于GDI-2补偿效应。
我们假设在RhoGDI1缺失时，Rho蛋白可能无法正确定位到质膜（PM），并可能留在内质网（ER）中，Rho-GTPase成熟的最后步骤发生在内质网的细胞质表面。这里，它们在胞浆中被戊基化后进行翻译后处理10亚细胞分馏实验表明，在对照细胞RhoA、Rac1和Cdc42中，PM和ER组分呈双相分布(). 然而，在RhoGDI1耗竭后，发现与PM相关的Rho GTPase的数量大大减少，大多数剩余的GTPase与ER共分馏(). 这些结果表明，如果没有RhoGDI1，没有被降解的Rho蛋白就不能正确地传递到PM。相反，它们在ER处积累，这表明RhoGDI的一个功能是将Rho GTPase从ER穿梭到PM的作用位点。支持这些结果的是，我们没有检测到GDI-1 KD后效应器激活的增加，尽管有高水平的活性GTP酶(). 这些结果可能解释了尽管Rho蛋白活性高，但RhoGDI1缺失导致的轻度表型。
Rho蛋白在细菌毒素CNF1不可逆激活后，通过蛋白酶体进行泛素化和降解11由于RhoGDI1敲除促进了Rho蛋白的大量激活，我们研究了在激活后是否发生类似的降解。为了抑制RhoA的激活，我们要么过度表达RhoA-特异性GAP，p190-RhoGAP，要么用C3-转移酶培养细胞，使RhoA失活，然后在GDI1沉默后监测其降解。两种处理都将RhoA活性降低到可以忽略不计的程度(). 然而，GDI1耗尽后RhoA的降解仍然发生，这表明这与RhoA活化无关().
RhoGDI1缺失后Rho家族GTPase的降解不需要Rho蛋白的激活，但取决于它们的香叶基香叶酰化，并涉及分子伴侣机制(一)用对照或RhoGDI1 siRNA和p190RhoGAP cDNA共同转染HeLa细胞。用GST-RBD或GST-PBD珠从细胞裂解液中提取活性Rho-GTP酶。结合蛋白和总细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(b条)用对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞，并用细胞渗透性C3毒素处理。用GST-RBD或GST-PBD珠从细胞裂解液中提取活性Rho-GTP酶。结合蛋白和总细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(c（c）)用对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞，并用香叶基香叶基转移酶抑制剂GGTI 2417处理。通过SDS-PAGE解析细胞裂解物，并通过蛋白质印迹进行分析。(d日)HeLa细胞与对照或RhoGDI1 siRNA和编码细菌蛋白酶YopT的cDNA共同转染。通过SDS-PAGE解析细胞裂解物，并通过蛋白质印迹进行分析。(e（电子）)用对照或RhoGDI siRNA转染HeLa细胞，并从细胞裂解物中免疫沉淀RhoA。免疫沉淀蛋白通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(（f）)转染对照组或RhoGDI1 siRNA的HeLa细胞，无论是否含有蛋白酶体抑制剂LLnL，都被分为细胞溶质或膜组分，RhoA从细胞溶质和膜组分中免疫沉淀。为了确保相似数量的RhoA被免疫沉淀，用限制数量的抗体和饱和数量的细胞裂解物进行免疫沉淀。免疫沉淀蛋白和细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(克)用对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞，并用格尔德霉素处理12小时。通过SDS-PAGE解析细胞裂解物，并通过蛋白质印迹进行分析。所有结果均代表至少3个独立实验。显示RhoA印迹的短期和长期暴露。所有siRNA实验在转染后72小时进行分析。对于过表达实验，在siRNA转染48小时后，用所示cDNA转染细胞，并再培养24小时。
我们的结果表明，与RhoGDI1结合可以稳定并保护Rho GTPase免受降解，并且不与GDI蛋白结合或与膜相关的GTPase会迅速降解。大多数Rho蛋白（RhoA、Rac1和Cdc42）在C末端用香叶基香叶基进行翻译后修饰12他汀类药物家族的通用丙酰化抑制剂，如洛伐他汀，或香叶基香叶酰基转移酶特异性抑制剂，如GGTI2417，在缺乏GDI的情况下挽救了GTPase的降解(和数据未显示）。类似地，使用细菌蛋白酶YopT切割香叶基香叶酰化的C末端尾部13也恢复了RhoA水平，这表明新合成的Rho蛋白在被降解之前已被戊二醛化并完全成熟，消除戊二醛基化足以稳定Rho GTPases(). GGTI2417治疗在缺乏RhoGDI1的情况下恢复RhoA的细胞溶质池，这表明Rho GTPase只能存在于细胞溶质中，如果它与RhoGDI结合或没有戊二醛化(补充图S4).
我们推测，如果没有RhoGDI1来保护戊基，这种暴露的疏水性修饰可能会干扰Rho蛋白的正确折叠，使其降解。在细胞中，分子伴侣确保蛋白质正确折叠14不能正确折叠的蛋白质通常聚集在不溶性聚集体中，以降解为目标14我们发现，在生理条件下，RhoA与分子伴侣Hsp70结合(). 在没有RhoGDI1的情况下，细胞中Hsp70的水平增加，表明细胞受到了应激，但实际上没有Hsp70与RhoA结合，这表明剩余的膜结合RhoA是适当折叠和稳定的(). 事实上，Hsp70主要与细胞溶质RhoA结合(). 当我们抑制RhoGDI1缺失细胞中的蛋白酶体时，RhoA和Rac1以氚不溶性部分积聚（数据未显示）。与细胞溶质RhoA结合的Hsp70的数量也增加了，这表明游离的戊烯基RhoA池被错误折叠或部分展开，并招募了蛋白质质量控制机制(). 这些结果表明，如果RhoGDI1不能容纳脂质部分，并且分子伴侣不能正确折叠，则丙酰化会导致Rho蛋白的错误折叠或去折叠，从而导致其降解。有趣的是，尽管RhoA与Hsp70和RhoGDI1共同沉淀()，RhoGDI1的免疫沉淀表明有两个相互排斥的RhoA池与Hsp70或RhoGDI 1相关(补充图S2a). 最后，在RhoGDI1存在或不存在的情况下，用格尔德霉素抑制分子伴侣降低了RhoA水平，认为需要分子伴侣来帮助稳定戊基RhoA().
在哺乳动物细胞中，RhoGDI1的水平大致相当于RhoA、Rac1和Cdc42的总水平15因此，Rho蛋白与RhoGDI1结合存在竞争平衡，任何改变GTPase水平的情况都会破坏这种平衡并影响Rho蛋白质的体内平衡。表明沉默RhoA会导致RhoA水平降低，Rac1和Cdc42水平成比例增加，这表明减少一个GTPase会生成可由其他人共享的自由GDI。相反，myc标记的RhoA、Rac1或Cdc42的过度表达取代了RhoGDI1的内源性RhoA(). 不能结合RhoGDI的Myctaged Cdc42突变体（R66E）的过度表达不会影响内源性RhoA的水平(). 内源性Rho蛋白的置换导致其以剂量依赖的方式降解(). 引人注目的是，积极主动的表达()或显性负Rho蛋白()还将内源性Rho蛋白从RhoGDI1中置换出来并导致其降解。RhoGDI1的联合表达可以阻止Cdc42过度表达引起的RhoA降解(). Rho家族其他成员（包括RhoA、Rac1和Cdc42）从RhoGDI1中置换Rho蛋白，导致其降解和灭活(). 如果过度表达的Rho蛋白是无法结合RhoGDI1的突变型（RhoAR68E、Rac1R66E或Cdc42R66E），则不会发生这种降解和失活(). RhoGDI1取代的Rho GTPase活性的下降与RNAi沉默GTPase时观察到的类似()与RhoGDI1缺失引起的Rho GTPases激活形成对比。
与RhoGDI1的竞争性相互作用调节Rho蛋白的水平和活性(一)用RhoA miR shRNA腺病毒感染HeLa细胞72 h。细胞裂解物用SDS-PAGE溶解并用Western blotting分析。注意RhoA耗尽的细胞中Rac1和Cdc42的水平增加。(b条)用myc标记的Rho-GTP酶转染HeLa细胞，免疫沉淀内源性RhoGDI1。免疫沉淀蛋白和细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。HeLa细胞(c（c）和d日)或HEK 293细胞(e（电子），（f），克，小时，我，j个，k个和我)通过增加所示myc标记Rho GTPase的质粒编码量进行转染。24h后，用SDS-PAGE溶解细胞裂解产物，并用Western blotting进行分析。(米)用myc-tagged Cdc42表达质粒转染HEK 293细胞，转染后24 h内分别加入或不加入HA标记的RhoGDI1表达质粒。细胞裂解产物用SDS-PAGE进行解析，并用Western blotting进行分析。(n、 o和p)如图所示，用5µg myc标记的Rho GTPase表达质粒转染HEK 293细胞。24小时后，分别用GST-RBD或GST-PBD珠从细胞裂解液中提取活性RhoA或活性Rac1。结合蛋白和总细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。所有结果均代表至少3个独立实验。注意，一个Rho家族成员的过度表达会降低其他Rho蛋白的表达和活性。
有人可能认为，RhoGDI1的耗竭和Rho GTPases从RhoGDI 1中的竞争性置换对Rho蛋白活性具有相同的影响，因为两者都会导致Rho GTPases的降解。然而，在外源性Rho GTPase过度表达的情况下，RhoGDI1仍然存在，随着时间的推移，将从细胞膜中提取并灭活剩余的内源性GTPase。通过过度表达的Rho-GTP酶竞争性地将内源性Rho蛋白从RhoGDI1中置换出来，将内源性的Rho蛋白质释放到胞浆中，然后在没有活化机会的情况下降解。相反，在RhoGDI1缺失期间，与膜相关的Rho蛋白不能被RhoGDI主动提取。这些膜结合Rho GTPase可能被膜结合GEF激活。因为，RhoGDI1可以抑制Rho GTPases的激活以及GTP的水解16，17，RhoGDI1的耗竭应该会减轻这种抑制，从而促进GTPases的激活。相反，从GDI中置换Rho蛋白不会改变RhoGDI1的细胞含量，从而维持了对内源性GTPase的抑制机制。事实上，我们表明，在RhoGDI1耗尽后，剩余的未被降解的RhoA与GDI无关(). 此外，我们的结果表明，通过直接沉默或过度表达外源性GTPase导致RhoA总量和活性降低，而RhoGDI沉默降低了RhoA水平，但使RhoA活性升高(和).
我们已经证明，RhoGDI1调节细胞溶质内Rho GTPase的稳定性，保护它们不被降解。我们的结果还揭示了Rho GTP酶之间通过与RhoGDI1竞争性结合而产生的意外串扰，如图所示虽然已经描述了Rho家族成员表达的情况，例如转移中RhoC的增加，但对RhoGDI1或Rho GTPases在发育和疾病期间表达水平的变化知之甚少18在前期工作中，我们发现不同乳腺癌细胞系中RhoGDI1的表达与其侵袭性以及RhoA和Rac1的水平和活性相关(补充图S5). 然而，在RhoGDI水平保持不变的情况下，我们的结果预测，不仅一个GTPase的过度表达会取代其他GTPase，并将其作为降解目标，而且还会影响其活性。发生极端变化的一种情况是野生型或突变型Rho GTPases的实验表达，这是研究Rho蛋白在不同途径中功能的标准工具。在许多情况下，从这些研究中得出的结论不仅可能来自过度表达的Rho蛋白的活性，还可能来自替代RhoGDI的其他家族成员导致其降解和失活的意外影响。
RhoGDI调节Rho蛋白稳态新合成的RhoGTPases在ER中进行香叶基香叶酰化和翻译后修饰。香叶基香叶酰化后，Rho蛋白直接与RhoGDI结合，后者将其作为可溶的戊基化物隔离，形成胞浆并保护其免受降解。当RhoGDI1耗竭或Rho蛋白过度表达时，内源性RhoGTPase释放到胞浆中，作为短期不稳定中间产物存在，部分折叠或错误折叠（红色箭头）。如果它们不能正确折叠，它们可以与伴侣复合物结合，或者成为降解的靶点。在没有GDI的情况下，新合成的Rho蛋白无法传递到质膜并在内质网中积累。在稳定状态下，这种不稳定的中间产物未被检测到，RhoGTPases大部分与细胞膜相关或与GDI结合，只有一小部分与伴侣系统相关。
使用的缩写：ER，内质网；PM，质膜；GGTase，香叶基香叶酰基转移酶；Rce1，戊基蛋白特异性蛋白酶；lcmt，异戊烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶。
方法
试剂
除非另有说明，否则所有化学品均从Axxora（美国加利福尼亚州圣地亚哥）购买。细胞可渗透的C3毒素来自Cytoskeley（Denver，CO，USA）。香叶基香叶酰基转移酶抑制剂GGTI2417是a.Cox（美国北卡罗来纳大学教堂山分校放射肿瘤学系）赠送的礼物。
细胞培养
HeLa和293FT细胞在添加了10%胎牛血清的低血糖Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）中生长。牙龈成纤维细胞（由UNC-Chapel Hill的Carol Otey博士捐赠）在补充了15%FBS（Sigma）的MEMα（Invitrogen）中生长。WM2664细胞（由UNC-Chapel Hill的Jim Bear博士捐赠）在补充了10%FBS（Sigma）的DMEM（Invitrogen）中生长。HUVEC在EGM-2（美国加利福尼亚州圣地亚哥的克隆技术公司）生长到第4代。
酵母培养与免疫荧光
酵母生长和细胞渗透的标准方法如Guthrie和Fink中所述19。针对Cdc42和Rho1的免疫荧光染色如前所述20使用Metamorph软件在每个菌株至少20个细胞中测量与极化Cdc42/Rho1相关的荧光强度。
抗体
小鼠单克隆抗RhoA抗体（26C4）、兔多克隆抗RhosB（119）、抗Rac2（C11）和抗RhoGDI1（A20）抗体以及山羊多克隆抗RooC抗体（K12）均来自圣克鲁斯生物科技公司（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。小鼠单克隆抗Rac1（23A8）和抗肌动蛋白（C4）抗体来自Millipore（Billerica，MA，USA）。小鼠单克隆抗Cdc42抗体来自BD Biosciences（美国加利福尼亚州圣何塞）。小鼠单克隆抗转铁蛋白受体、抗微管蛋白和抗PDI抗体来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。小鼠单克隆抗HA抗体（克隆16B12）来自Covance（美国新泽西州普林斯顿）。小鼠单克隆anit-RhoGDI2抗体来自BD Pharmingen（BD Bioscience，San Jose，CA，USA）。小鼠单克隆抗myc抗体（克隆9E10）是Thomas Samson博士（UNC，Chapel Hill，USA）赠送的。小鼠单克隆抗Hsp70和抗Hsp90抗体是Doug Cyr博士（UNC，Chapel Hill，USA）赠送的。之前描述过针对酵母Cdc42的亲和纯化抗体20，与UNC免疫学核心设施合作分离出抗酵母Rho1的单克隆抗体（UNC3-106.5.1）。
DNA构建、RNA干扰、siRNA和siRNA转染
先前描述了野生型和突变型myc标记的RhoA、Rac1和Cdc42真核表达结构21，22Cdc42 R66E、RhoGDI1救援wt、D45A、D185A和D45/185A突变体是使用Quickchange II XL定点突变试剂盒（Stratagene）通过定点突变产生的。RhoGDI1拯救结构是通过在siRNA双链靶向序列中引入沉默突变而产生的。pCMV-HA-p190 RhoGAP哺乳动物表达结构如前所述23pGEX-YopT原核表达构建物和pCMV-HA-RhoGDI1哺乳动物表达构建物是S.Ellerbroek（美国爱荷华州沃特堡学院）赠送的。通过PCR将YopT cDNA亚克隆到ProteoTuner系统的pPTuner IRES2载体中（Clontech，Mountain View，CA，USA）。pAd-EmGFP-RhoA miR shRNA结构如前所述24使用BIOPREDsi算法设计短干扰RNA（siRNA）www.bioredsi.org
25SiRNAs购自UNC核酸核心设施/Siga-Genosys（美国密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich）。本研究中使用了以下siRNAs（仅限导向链）：ARHGDIA#1/RhoGDI1#1 UCAAUCUUGACGCUUCCTT，阴性对照UCACGUGCCGCAUUCCTT。如前所述，使用改良的磷酸钙方案转染SiRNAs26.
逆转录聚合酶链反应
使用Trizol（Invitrogen，CA，USA）从HeLa细胞中纯化总RNA，并使用DNAse I（NEB，Ipswich，MA，USA。使用iScript cDNA合成试剂盒（Biorad，Hercules，CA，USA）对1µg总RNA进行反转录。使用Taq PCR Master Mix试剂盒（Qiagen，Valencia，CA，US）和以下几组寡核苷酸对等量的cDNA进行PCR：RhoGDI1 GGAGAGCTTCAAGAGAGAGAT和TCAGTCCTCAGTCTTT，RhoA，ATGGCGCCATCCGGAAG和TCACAAGACAGCACCAG、Rac1 ATGCAGGCCATCAAGTGTGT和TTACAAGCAGGCATTTCTCT、Cdc42 ATGCAGACAATTAAGTGTTT和TCATAGCACACCTGC、β2微球蛋白CTCGCTCTCTCTTTCTGG和GCTCTCAATCCCATAA。
GST-RBD/PBD下拉
如前所述，在GST-RBD或GST-PBD下拉测定中分别测量RhoA或Rac1/Cdc42的激活27，28简单地说，细胞在25 mM Hepes（pH 7.3）、150 mM NaCl、5 mM MgCl中溶解2、0.5%Triton X-100、4%甘油、10 mM NaF、5 mM DTT和蛋白酶抑制剂在4°C下保持10分钟。通过在9500 g下离心10分钟去除Triton-X-100不溶物，并在4°C下用50µg固定化GST-RBD或GST-PBD孵育40分钟，以分别测量RhoA或Rac1/Cdc42活性。
亚细胞分离
用冰镇低渗裂解缓冲液（10 mM Hepes pH 7.3，1.5 mM MgCl）清洗细胞并培养2，5 mM KCl，1 mM DTT和蛋白酶抑制剂）10分钟。用Dounce匀浆器刮取细胞并匀浆20次。将匀浆液在700 g下离心3分钟，以使细胞核和完整细胞颗粒化。将上清液以40000 g在4°C下旋转30分钟，并用低渗裂解缓冲液轻轻清洗一次微丸。通常，用SDS-PAGE和Western blot分析2%至5%的细胞溶质部分和30%至40%的膜部分。或者，根据制造商的说明，使用碘xanol（OptiPrep，Axis Shield）不连续梯度对膜进行分馏。简单地说，在均质缓冲液（0.25 M蔗糖、20 mM Tris/HCl pH 7.4、25 mM KCl、5 mM MgCl）中彻底重新悬浮膜芯2)并在5%至30%的不连续碘克沙醇梯度的顶部分层。将样品在100000 g下离心2 h。然后收集分数并通过western blot进行分析。
免疫沉淀
如GST下拉部分所述，在冰镇裂解缓冲液（无DTT）中裂解细胞。将裂解液以10000 rpm离心10分钟。用2µg兔多克隆抗RhoGDI1抗体免疫沉淀RhoGDI 1 1小时。用0.4µg小鼠单克隆抗RhoA抗体（26C4）免疫沉淀RhoA过夜。然后将裂解液与蛋白A-琼脂糖珠培养45分钟，并用裂解缓冲液洗涤3次。
单细胞迁移
使用siQuest转染试剂（Mirus）将CTRL siRNA或GDI-1特异性siRNA转染WM2664细胞。将GDI-1 siRNA与1:10荧光标记的非靶向siRNA混合，以鉴定转染细胞。在对照实验中，所有细胞均转染荧光siRNA（未显示）。转染CTRL和GDI-1 KD细胞48小时后，将其胰蛋白酶化，1:1混合，并将其置于35 mm玻璃底皿（MatTek）中，该皿涂有层粘连蛋白（Sigma）。使用尼康生物站IM活细胞成像显微镜获取时间推移图像，并使用ImageJ（NIH）进行分析。每5分钟拍摄一次图像，共持续2小时。通常在一次实验中拍摄20个不同的区域（约60个细胞）。
伤口愈合
用CTRL-siRNA或GDI-1 siRNA转染HeLa细胞。48小时后，将细胞胰蛋白酶化并置于24孔板中。在每个孔中使用移液管尖端制造划痕/伤口。然后使用配备有哈马松ORCA-ERAG数码相机的蔡司Axiover 200 M显微镜在指定时间对细胞成像。使用Metamorph软件（分子设备）在每个时间点测量伤口面积。
统计分析
采用双尾非配对Student t检验分析两组数据之间的统计差异。
