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摩尔癌症治疗。作者手稿；PMC 2009年9月14日发布。
以最终编辑形式发布为：
摩尔癌症治疗。2008年7月；7（7）：1949年至1960年。
数字对象标识：10.1158/1535-7163.MCT-07-2046
预防性维修识别码：下午2743084
尼姆斯：美国国立卫生研究院58928
PMID：18645005

头颈癌细胞系中硼替佐米的差异敏感性与蛋白酶体、NF-κB和AP-1相关机制相对应*

钟晨，1 贾斯汀·里克尔，1 普拉米特·马尔霍特拉，2 利斯尔·诺丁汉，1 洛伦娜·巴根，1 Tin Lap Lee公司，1 Ning T Yeh公司，1和卡特·范·韦斯1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）表现出转录因子NF-κB和AP-1的结构性激活，这些转录因子受蛋白酶体调节，并促进对细胞死亡的抵抗。HNSCC对蛋白酶体抑制剂硼替佐米表现出不同的敏感性在体外，以及小鼠异种移植和患者肿瘤体内，其机制尚不清楚。为了解决这个问题，使用MTT法测定了九个HNSCC细胞系对硼替佐米的敏感性，并在硼替佐米特异性敏感的HNSCC株中检测了敏感性与硼替佐敏对生物过程的影响之间的潜在关系。最敏感的细胞系（UM-SCC-11B）在10岁时发生细胞死亡–9M（M）在体外在小鼠异种移植模型中，在最大耐受剂量硼替佐米下肿瘤消退。UM-SCC-11A和-11B细胞之间的敏感性差异对应于蛋白酶体活性抑制程度、泛素化蛋白降解以及NF-κB和AP-1活化的差异。低浓度硼替佐米瞬时增加UM-SCC-11A细胞中的NF-κB和持续AP-1活化。当硼替佐米与JNK和p38激酶途径抑制剂联合使用时，UM-SCC-11A的AP-1报告活性和细胞密度受到抑制。因此，硼替佐米的不同敏感性对应于蛋白酶体、NF-κB和AP-1活性的不同影响。抑制JNK和p38通路可阻断AP-1活性并增强抗肿瘤作用。这些发现揭示了硼替佐米敏感性和耐药性的分子机制，目前正在开发用于HNSCC患者临床试验的生物标志物。

关键词：硼替佐米（PS-341/VELCADE™）、蛋白酶体、NF-κB、AP-1、头颈癌

介绍

NF-kappaB（NF-κB）和激活蛋白-1（AP-1）信号转导通路的组成性激活已被确定为促进造血和实体恶性肿瘤进展的显著事件(1–4)包括头颈部鳞状细胞癌（HNSCC，5-7）。我们已经证明NF-κB经常与AP-1共同激活，并促进增殖、生存和促血管生成肿瘤表型(6，7). 通过基因或化学抑制剂靶向NF-κB和AP-1或上游信号转导途径，已被证明能有效抑制肿瘤表型在体外以及在临床前动物模型中抑制肿瘤生长体内(4–5，7–11). 随后的临床研究表明，NF-κB和AP-1通路及其靶向生物标记物与预后不良相关(12–15). 因此，NF-κB和AP-1的异常激活是促进HNSCC侵袭性肿瘤表型和生存的关键信号转导途径。

硼替佐米（VELCADE™/PS-341）近年来已被开发用于蛋白酶体的分子靶向和抑制，蛋白酶体是一种复合物，可调节许多细胞内蛋白质的周转，包括控制细胞信号、存活和细胞周期调节的蛋白质(16，17). 硼替佐米选择性抑制蛋白酶体活性，蛋白酶体活性是激活NF-κB和降解AP-1组分以及参与癌症发病机制的其他信号通路所必需的(16–18). 硼替佐米可以通过抑制泛素化抑制剂-κB（IκB）的降解来抑制NF-κB途径，IκB在细胞质中结合和隔离NFκB，抑制其核定位和与靶基因启动子的结合(11，16，17，19–21). AP-1家族成员的蛋白质成分也通过蛋白酶体系统降解(18，21). 硼替佐米对一系列培养的癌细胞具有抑制活性(19–29)在动物模型中(11，30–32)包括抑制NF-κB和其他信号转录途径(11，16，17，19–32)诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞(19，20，22–35). 硼替佐米的分子和临床作用以及可变活性的潜在机制在多发性骨髓瘤（MM）和某些其他造血恶性肿瘤中得到了最广泛的研究(20，22–25，33–35)但在实体癌中程度较低(8，11，19，26–32). 在癌和实体瘤的临床试验中，与MM相比，硼替佐米单药治疗的反应率更低，反应的异质性更大(36–38)，以及硼替佐米与其他抗癌药物的组合已被用于实现显著的抗癌效果体内(8，12，37，39).

硼替佐米在HNSCC细胞株和SCC动物模型中显示出抗肿瘤和放射增敏作用，这些动物模型表现出组成性活化的NF-κB(4–11，32)，并且这些反应与抑制NF-κB、其靶基因和预期的细胞病变效应有关（11和32）。硼替佐米在体外和小鼠模型中对HNSCC的抗肿瘤作用及其对辐射诱导NF-κB活化的抑制作用(39)，导致我们开展了一项I期临床试验，以研究硼替佐米和放疗联合治疗HNSCC患者的最佳剂量、方案、毒性和抗肿瘤效果。在这项试验中，还观察到了对联合治疗反应的异质性，迄今为止，接受治疗的17名可评估患者中有5名表现出客观反应（8，Van Waes C，未发表的数据）。需要确定这些敏感性差异的分子机制，以及选择硼替佐米和/或其他药物治疗的标记物。

在这项研究中，我们鉴定了一个硼替佐米敏感细胞系UM-SCC-11B和一个来自同一患者的等基因起源细胞系UM-SCC-11A，该细胞系对硼替佐米相对不敏感，类似于九个UM-SCC细胞系小组的其他成员。在这两种细胞系之间，我们观察到它们对治疗的反应在蛋白酶体抑制、泛素化蛋白的积累以及对转录因子NF-κB和AP-1激活的相应影响方面存在显著差异。JNK和p38拮抗剂抑制的AP-1激活使耐药株对硼替佐米的作用敏感。这些发现表明，蛋白酶体对NF-κB和AP-1的依赖性作用的差异可能导致HNSCC对硼替佐米的敏感性不同。了解硼替佐米细胞反应中的这种分子差异可以提供生物标记物，指导我们改进硼替佐米可用于治疗的选择和潜在组合。

材料和方法

头颈部鳞癌细胞系

如前所述，人类UM-SCC细胞系来源于密歇根大学密歇根州安娜堡分校的SCC患者，经知情同意（40、41补充表1). 从每个患者标本建立的细胞系用数字命名，如果从同一患者的两个不同时间点或解剖部位获得的分离物，命名包括字母后缀（即“a”或“B”）。使用的细胞系保存在Eagle的基本培养基中，补充有10%胎牛血清和青霉素/链霉素。

试剂

蛋白酶体抑制剂硼替佐米是根据材料合作研发协议从Millennium Inc（马萨诸塞州波士顿）获得的(8，11). TNF-α购自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州）。兔抗β-微管蛋白（H-235，sc-9104）和泛素（FL-76，sc-9133）的多克隆抗体以及山羊抗兔IgG-HRP（sc-2004）购自圣克鲁斯生物技术公司（加州圣克鲁斯）。JNK的化学抑制剂SP600125来自Biomol（普利茅斯会议，PA）；p38抑制剂SB203580来自Calbiochem/EMD Biosciences（加利福尼亚州圣地亚哥）；MEK抑制剂UO126和PD98059分别来自Promega（威斯康星州麦迪逊）和Calbiochem/EMD Biosciences（加利福尼亚州圣地亚哥）。

用台盼蓝排斥法测定细胞增殖和活力

MTT法检测细胞增殖。5X10个三将细胞四次接种在96孔微管板中，次日用硼替佐米处理。在治疗后第1、3、5天添加MTT标记试剂（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN），并使用微孔板自动阅读器（Biotek，Winooski，VT）在570 nm处测量比色光密度（O.D.）。台盼蓝排除试验，2X105UM-SCC-11A电池和3X105UM-SCC-11B细胞在T-25烧瓶中培养，并在培养48小时后暴露于硼替佐米。收集细胞，用台盼蓝染色，并在不同时间点在显微镜下目测计数。

流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期

将UM-SCC-11A和-11B细胞置于T-25烧瓶中，并按指示使用不同浓度的硼替佐米处理。在治疗后12小时、24小时和96小时以及10小时收集细胞5使用cycleTEST Plus DNA试剂盒（加利福尼亚州圣何塞市Becton Dickinson）收集细胞进行DNA细胞周期和凋亡分析。用碘化丙啶标记细胞DNA，并用流式细胞仪（FACScan，Becton Dickinson，San Jose，CA）测量每个样本中10000个细胞的DNA含量。通过ModFit LT软件（缅因州托普沙姆市Verity software House）分析细胞周期各阶段凋亡细胞和存活细胞的百分比。

SCC异种移植物肿瘤模型

BALB/c SCID小鼠（4-6周龄）取自美国国家癌症研究所弗雷德里克癌症研究与发展中心（弗雷德里克，MD），饲养在无致病性动物设施中。1.5倍7将UM-SCC-11A或-11B细胞皮下注射到免疫缺陷BALB/c SCID小鼠的侧翼(11，32). 当约0.3厘米三出现可触及的肿瘤，每周周一/周三/周五腹膜内注射2.0mg/kg/剂量的硼替佐米（之前测试的最大耐受剂量），共3剂。由独立的动物护理人员每周用工程卡尺测量肿瘤大小，并将其表示为2（肿瘤宽度）X肿瘤长度产生的肿瘤体积。

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP地高辛镍端标记（TUNEL）

在硼替佐米治疗后的不同时间点采集SCC异种移植瘤标本，并由美国组织实验室（马里兰州盖瑟斯堡）处理薄冰冻切片。根据制造商的说明对样品进行TUNEL分析（Chemicon International，Inc.，Temecula，CA）。

蛋白酶体活性的测量

根据Elliott等人(42). 将10μg蛋白裂解物与合成肽底物LLVY-AMC（加利福尼亚州圣卡洛斯市巴切姆）在96孔板的每个孔中孵育三次，并由Wallac Victor测量荧光团AMC的释放21420多标签计数器位于37o个C（λex=380nm，λem=450nm）。在10秒摇晃和4分钟培养后，重复五次测量蛋白酶体抑制活性的动力学。

NF-κB结合活性

为了检测NF-κB p65结合活性，使用核提取试剂盒（Active Motif，Carlsbad，CA）获得细胞核提取物。每次反应中使用20μg核提取物，一式三份。根据制造商的方案（Active Motif），使用TransAM试剂盒评估NF-κB家族成员的结合活性。使用微孔板阅读器（Biotek、Winooski、VT）在450 nm波长下测量光密度。

报告基因检测试剂盒

5XNF-κB-和7XAP-1-核糖核酸酶报告基因构建物购自Stratagene（加利福尼亚州La Jolla）。小鼠显性阴性IκBαM质粒（pCMX IκB-αM）由Inder M Verma博士（加利福尼亚州拉霍亚Salk研究所，参考文献7). 在5X10处对细胞进行电镀4/按照制造商的建议，第二天在37°C下用0.3μg质粒DNA和效应基因转染试剂转染3小时（德国希尔顿市齐根）。转染后，细胞在EMEM加10%FBS中生长，并暴露于硼替佐米。收集细胞裂解物，并使用双光荧光素酶报告基因检测系统（Tropix，Bedford，MA）检测报告基因活性。化学发光活性由Monolight 2010光度计（加利福尼亚州圣地亚哥分析发光实验室）测量。

全细胞提取物的分离

将细胞置于100 mm的组织培养皿中，使其生长至80–90%的融合，并使用核提取试剂盒（加利福尼亚州卡尔斯巴德市Active Motif）分离全细胞裂解物。用冰镇PBS/磷酸酶抑制剂清洗培养细胞并刮除，然后在100μl裂解缓冲液中进行裂解，并上下移液数次。将裂解产物在冰上孵育10分钟，然后在4°C下在14000 g下离心20分钟，收集上清液并将其储存在−80°C下。使用Pierce BCA蛋白质分析法测定总蛋白质浓度。

Western Blot分析

将20μg全细胞裂解物与Laemmli加载缓冲液（含有β-巯基乙醇）混合，并在100°C下加热5分钟。将样品加载到10%的三甘氨酸预铸凝胶上，并在140V下电泳90分钟。将蛋白质转移到0.45μm硝化纤维素膜上（Invitrogen，Carlsbad，CA）使用Invitrogen凝胶印迹模块在室温下20V电压下保持2小时。根据制造商规范进行免疫印迹。一级抗体在由TBS-T制备的5%脱脂奶粉中稀释，并以1:500稀释，二级山羊抗兔IgG-HRP以1:1000稀释。将每个印迹与Pierce Super Signal West Pico底物孵育，并暴露于Kodak X-OMAT胶片。

结果

UM-SCC细胞系对硼替佐米敏感性的差异

我们通过MTT细胞增殖试验筛选了9种UM-SCC细胞系和正常人角质形成细胞对硼替佐米的敏感性，并确定UM-SCC-11B是最敏感的细胞系(图1A，补充表1). IC50UM-SCC-11B中硼替佐米的值为0.37nM，而在细胞系-1、5、-6、11A、-22A和-22B中观察到中度敏感性，其中IC50扫描约0.54–1.1 nM。鉴定出的抗性最强的细胞系是UM-SCC-9和-38，其中IC50数值分别为7.19和8.37 nM。虽然UM-SCC-11B和其他UM-SCC研究表明，与UM-SCC-9相比，UM-SCC-21B和UM-SCC对NF-κB活化的激活和依赖性更强，但细胞系对硼替佐米的敏感性程度与NFκB的活化并不严格成正比(图1B和参考6，7，43)，这表明其他因素可能有助于观察到的差异敏感性。培养的人类正常角质形成细胞也显示出相对较低的IC50（0.48 nM），与肿瘤细胞相当，但在培养物中NF-κB的活化最小(43).

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UM-SCC细胞系和培养的正常人角质形成细胞对硼替佐米的敏感性在体外

（A） 9个UM-SCC细胞系和人类正常角质形成细胞在5X10处进行电镀三96孔微孔板中每孔四倍的细胞数。第二天，细胞暴露于不同浓度的硼替佐米（第0天）。在处理后的第一天、第二天和第三天用MTT试剂标记细胞四小时，第二天测量标记细胞的光密度。这些数据是重复实验的一个代表，显示了由四倍计算的平均值+标准偏差。IC50显示的是使用第2天的数据计算得出的。（B） 从培养的UM-SCC细胞中获取核提取物，并使用TransAM NF-κB结合试剂盒（每个孔中含有10μg核提取物）测量NF-kb p65结合活性。数据表示三倍的平均值加标准偏差。（C） 采用台盼蓝法检测硼替佐米对UM-SCC-11A和-11B细胞的细胞毒性作用。将UM-SCC-11A（左面板）和-11B细胞（右面板）分三次置于T-25烧瓶中，并于10时用硼替佐米处理–9和10–8M 48小时后。在每个时间点，收集附着和分离的细胞，用台盼蓝染色并计数。计算并呈现活细胞总数。

为了进一步研究UM-SCC细胞系对硼替佐米的差异敏感性的潜在机制，我们选择研究同一原发性下咽HNSCC的分离株，有趣的是，这些分离株在（UM-SCC-11A）之前对硼替佐米和其他药物的敏感性表现出不同的变化顺铂（UM-SCC-11B，补充表1，参考。40，41). 顺铂化疗后，-11B细胞表现出结构和EGF诱导的NF-κB和STAT3水平升高，并且对EGFR抑制剂吉非替尼耐药(7，44，45)，但对硼替佐米更敏感在体外和小鼠异种移植物(11). 当我们使用硼替佐米治疗后，通过台盼蓝排斥试验比较两种细胞系的细胞活力时，我们证实了我们之前的观察结果，即UM-SCC-11B细胞对硼替佐米比-11A细胞更敏感，在诱导细胞毒性和减少活细胞方面(图1C).

硼替佐米的体内抗肿瘤活性

在SCID小鼠异种移植瘤模型中进一步评估了UM-SCC-11A和-11B中硼替佐米的抗肿瘤活性(11，32). 本研究使用了通过皮下注射肿瘤细胞建立的HNSCC异种移植物肿瘤模型，以研究对硼替佐米反应的潜在差异，因为当直接植入时，肿瘤的生长速度会导致吞咽或呼吸障碍导致的过早死亡。然而，该模型表现出许多与植入原位小鼠模型中的其他HNSCC异种移植物相似的分子特征(46). 在最大耐受剂量下，我们观察到三次注射后UM-SCC-11B肿瘤的消退(图2A，右图），但对-11A肿瘤没有影响(图2A，左侧面板）。硼替佐米治疗后也采集肿瘤标本。硼替佐米治疗诱导-11B肿瘤细胞核浓缩和组织降解(图2B，右上方面板），以及与凋亡一致的TUNEL标记(图2B，右下面板），与车辆控制装置相比(图2B左侧面板）。然而，治疗后-11A肿瘤的形态与载体对照组相同，在用硼替佐米治疗的11A肿瘤样本中未观察到TUNEL标记（数据未显示）。

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硼替佐米在人UM-SCC肿瘤异种移植模型中的抗肿瘤活性

（A） 以1.5x10的剂量皮下注射UM-SCC-11A和-11B细胞7免疫缺陷BALB/c SCID小鼠侧翼的细胞/小鼠。当平均肿瘤体积达到~0.3 cm时三在每个荷瘤组中，在星期一、星期三和星期五的日程表上腹腔注射硼替佐米（2.0 mg/kg/剂量），每个剂量的时间用箭头表示。测量肿瘤，计算肿瘤体积，并将其表示为平均值+SE。用于复合递送的载体为无菌PBS中的DMSO。（B）在硼替佐米治疗24小时后采集UM-SCC-11B异种移植模型的肿瘤，并在冰冻切片上进行H&E和TUNEL染色。对照组（左侧）和硼替佐米治疗的肿瘤（右侧）的照片在放大200倍的光学显微镜下拍摄。

硼替佐米诱导UM-SCC-11A细胞周期阻滞及细胞凋亡

为了进一步确定硼替佐米是否对UM-SCC-11A和-11B细胞的细胞周期和/或凋亡产生差异影响，采用流式细胞术进行DNA细胞周期分析。用10–8硼替佐米在治疗后12至24小时内表现出明显的G2/M期细胞周期阻滞(图3A). 相比之下，用相同浓度的硼替佐米处理的UM-SCC-11B细胞，在12小时时细胞周期分布略有改变，并且在处理后24小时内G0/G1以下DNA断裂峰显著增加，这与细胞凋亡相一致(图3B). 在较低浓度（10–9M） ，在UM-SCC-11A细胞中未观察到明显的细胞周期改变或凋亡(图3A)，但在-11B细胞中观察到明显的细胞周期变化(图3B).

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硼替佐米诱导UM-SCC-11A和-11B细胞周期阻滞和凋亡

用不同浓度的硼替佐米处理UM-SCC-11A（A）和-11B细胞（B），并在处理后12、24和96小时收获。105收集细胞并用碘化丙啶染色，用cycleTEST-Plus DNA试剂盒进行细胞凋亡和细胞周期分析。用流式细胞仪测定每个样品中10000个细胞的荧光强度。

硼替佐米对UM-SCC-11A和-11B细胞蛋白酶体活性的差异抑制作用

接下来，我们探讨了UM-SCC-11A和-11B中观察到的对硼替佐米的不同敏感性是否可能是由于蛋白酶体抑制的内在差异所致。我们测试了硼替佐米治疗后不同时间点两种细胞系的蛋白酶体活性，发现硼替佐米治疗后4小时内观察到强烈的抑制作用。如所示图4，在较低剂量的硼替佐米（10–9M） ，UM-SCC-11A细胞中蛋白酶体活性受到轻微但显著的刺激，但-11B细胞中蛋白酶体活性受到抑制(图4A). 与-11A细胞相比，在较高浓度下，我们发现UM-SCC-11B细胞的蛋白酶体活性受到更强的抑制(图4A). 此外，我们检测了10–8在不同的时间点服用M硼替佐米。与-11A细胞相比，UM-SCC-11B细胞中泛素化蛋白的积累更显著(图4B)与更强的蛋白酶体抑制相一致。因此，UM-SCC-11A和-11B细胞似乎在硼替佐米对蛋白酶体抑制和泛素化蛋白积累的作用上表现出差异。

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硼替佐米对UM-SCC-11A和-11B细胞NF-κB和AP-1报告活性的影响

UM-SCC-11A和-11B瞬时转染NF-κB（A-D）或AP-1（E，F）荧光素酶报告载体。转染后，细胞在10–8M代表不同的时间点。收集细胞裂解物并使用Tropix Dual-Light报告分析系统分析荧光素酶活性。将每个值调整为对照值，并表示为平均荧光素酶活性±三倍标准偏差。对于阳性对照组，细胞还与带有NF-κB荧光素酶报告子结构的DN IκBα突变质粒共转染，并用2000U/ml人重组TNF-α处理24小时（C和D）。

硼替佐米对NF-κB和AP-1活性的影响

为了探讨敏感性差异是否能够反映先前在HNSCC中检测到的NF-κB和/或AP-1活化的差异，我们检测了基础和硼替佐米诱导的活性。如NF-κB p65结合所示，UM-SCC-11A和-11B细胞表现出高基础水平的组成性活化NFκB(图1B)和记者活动（陈Z，数据未显示）。UM-SCC-11A细胞比-11B细胞表现出更高的转染效率和绝对荧光素酶活性，然而，在归一化为β-gal活性后，UM-SCC.11B的报告活性比-11A细胞高两倍（Chen Z，数据未显示），这与结合活性的差异一致。为了检查UM-SCC-11A和-11B细胞对硼替佐米的不同敏感性是否与其NF-κB活性有关，在细胞暴露于10–8不同时间点的M硼替佐米(图5). 硼替佐米在早期时间点（治疗后4小时和8小时）瞬时增加-11A细胞的NF-κB活性，然后在治疗后16小时和24小时，NF-κ的B抑制相对较弱(图5A). 硼替佐米降低-11B细胞NF-κB报告活性4小时，治疗后16-24小时达到统计学意义，几乎完全抑制(图5B). 接下来，我们询问细胞中的NF-κB活性是否可以通过经典机制刺激和抑制，如TNF-α，或通过瞬时转染过度表达显性阴性IκBαM。在这两种细胞系中，TNF-α都能刺激NF-κB报告活性，显性阴性IκBαM的表达能够完全抑制NF-κ的B报告活性(图5C和D).

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硼替佐米对UM-SCC 11A和11B细胞蛋白酶体活性和蛋白质泛素化的抑制作用不同

用不同浓度的硼替佐米处理UM-SCC-11A（A）和-11B（B）细胞，处理后4h收集细胞裂解液。测定蛋白酶体活性，计算数据，并将其表示为三倍体的平均值+标准偏差。用硼替佐米在10–8M，并且在不同的时间点收获细胞裂解物。蛋白泛素化用抗泛素抗体（C）进行Western blot分析。

我们的实验室之前发现了另一种转录因子AP-1，该转录因子构成性共同激活，促进HNSCC的增殖和促血管生成细胞因子的产生(6，7). 由于AP-1的诱导是响应许多类型的细胞应激而发生的，并且包括AP-1的蛋白质如cJun的降解是通过蛋白酶体发生的(18)，我们测试了硼替佐米是否影响这些细胞中的AP-1活性。如所示图5E早在治疗后4小时，硼替佐米显著增加UM-SCC-11A细胞的AP-1活性，但在UM-SCC.11B细胞中没有(图5F).

阻断激活AP-1的上游信号通路增强UM-SCC-11A细胞硼替佐米效应

接下来我们研究了硼替佐米的组成性和硼替佐米b诱导的AP-1活性是否有助于UM-SCC-11A细胞的相对耐药性。由于AP-1上游的多个信号转导途径可能有助于AP-1激活，因此对这些途径的几种化学抑制剂进行了测试，包括特异性JNK抑制剂SP600125、p38抑制剂SB203580以及MEK/ERK抑制剂UO126和PD98059(27). 我们将这些化学抑制剂滴定到亚最佳剂量，以抑制-11A细胞中的MTT，并在10–8M（M）(图6A). 我们发现硼替佐米与JNK抑制剂SP600125联合使用对-11A细胞的细胞增殖具有显著的协同抑制作用(图6A，左侧面板）。其他抑制剂，如用于p38通路的SB203580(图6A右面板），ERK途径的UO126和PD98059的组合活性较小（数据未显示）。与此相一致，硼替佐米和JNK抑制剂SP600125联合使用对-11A细胞AP-1报告活性的抑制作用比单独使用两种药物更显著(图6B). 我们的数据支持JNK和AP-1通路激活可能导致UM-SCC-11A细胞对硼替佐米耐药的假设。

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化学JNK抑制剂SP600125显著抑制AP-1报告活性，并与硼替佐米协同抑制UM-SCC-11A细胞增殖

（A） 将UM-SCC-11A细胞置于24孔板中过夜，并转染AP-1和LacZ报告体。转染后，用10μM的SP600125或SB203580处理细胞4小时，然后用10–8M硼替佐米24小时。如前所述，采集细胞并测量报告活性。（B） 将UM-SCC-11A细胞放置在96孔板中过夜，并在硼替佐米治疗前4小时添加化学抑制剂。然后在处理后的第一天、第三天和第五天用MTT试剂标记细胞4小时，第二天测量标记细胞的光密度。

讨论

在本研究中，在九个UM-SCC细胞系和培养的正常人角质形成细胞中测定了硼替佐米敏感性，并检测了NF-κB的作用和其他潜在机制在硼替佐米敏感性中的作用。IC的药理浓度50范围在0.37至8.37nM之间(图1)与其他实体和造血恶性肿瘤的敏感性范围一致(11，19–28，30–35)，而不是更高的IC50之前报告的HNSCC线路(29). 虽然与UM-SCC-9和非恶性角质形成细胞相比，UM-SCC-11B和大多数其他研究的UM-SCC细胞系表现出更强的NF-κB活化和硼替佐米敏感性，但本研究中细胞系对硼替佐米特异性的差异与NFκB激活的基线差异并不严格成正比(图1B，参考6，8，43)表明蛋白酶体抑制可能影响的其他NF-κB非依赖机制可能有助于区分敏感性(16–18). 同一患者用顺铂化疗前后分离的UM-SCC-11A和-11B细胞系的敏感性和反应性不同在体外和体内(图1，补充表1)这表明，这些细胞株内在机制的差异可能导致其对硼替佐米的敏感性不同。基线和治疗后BCL-2/BCL-xL和HSP27水平的比较，先前与MM敏感性的内在差异有关(25，33)，行之间没有实质性差异（未显示数据）。虽然UM-SCC-11A和B都显示出同样高水平的NF-κB活化，但它们在蛋白酶体抑制、泛素化和AP-1活化的动力学和程度上表现出较大差异(图4，​,5).5). JNK和p38抑制剂抑制AP-1活化和硼替佐米致敏细胞(图6)表明硼替佐米诱导的这些激酶途径的信号激活都有助于这些敏感性差异，并可能成为HNSCC联合治疗的潜在靶点。

IC的差异50用于UM-SCC-11A和-11B细胞之间的硼替佐米在体外在浓度范围内小于1 log，但这种差异对应于-11A或-11B异种移植瘤生长的药物活性显著改变体内(图2A). 在该临床前异种移植瘤模型中，在最大耐受剂量下，硼替佐米诱导-11B肿瘤消退(图2A)TUNEL染色检测细胞凋亡(图2B)，但在最大耐受剂量下对-11A肿瘤没有抑制作用(图2A数据未显示），表明这种剂量的硼替佐米未达到足够的瘤内浓度，无法诱导UM-SCC-11A肿瘤消退体内试验。两种细胞系对硼替佐米反应的差异在体外和体内与我们正在进行的硼替佐米联合再放射治疗复发性HNSCC患者的I期临床反应差异一致(8，47)其中，在17名接受0.6 mg/m剂量治疗的可评估患者中，有5名患者出现了客观反应2具有不同的再辐照计划(8，47). 在我们的临床试验中观察到的有限反应可以部分解释为相对低剂量硼替佐米（0.6mg/m）的预期活性2)，到目前为止，使用不同的再辐照计划进行了研究(8，47)根据先前的药代动力学研究估计的硼替佐米血清浓度将在较低的浓度范围内(47–49). 当存在极限浓度时，与造血系统恶性肿瘤相比，间质压力增加意味着生物利用度较差，实体恶性肿瘤的反应率相对较低(48，49). 此外，尽管IC50对于与角质形成细胞重叠的UM-SCC系，我们的研究中未观察到硼替佐米除轻度皮疹或粘膜炎外的具有临床意义的皮肤或粘膜毒性，甚至在主要II期临床试验中使用更高剂量时也未观察到(8，16，17，36–38，47–49).

接下来，我们研究了硼替佐米在配对UMSCC-11A和-11B细胞系中的蛋白酶体依赖性效应，以检验蛋白酶体抑制和/或泛素化动力学差异可能有助于差异反应并可能作为敏感性指标的假设。我们的研究表明，与-11B细胞相比，硼替佐米在-11A细胞中抑制蛋白酶体的程度较小，动力学较慢(图4A)与这样的假设相一致。此前，据报道，硼替佐米诱导的蛋白酶体活性抑制在外周血细胞或肿瘤标本中在给药一小时后达到峰值(8，28). 然而，我们发现硼替佐米诱导的蛋白酶体抑制在分娩后约4小时在HNSCC达到峰值在体外，峰值效应持续约8小时（Chen Z，未发表的观察结果），与小鼠SCC移植模型中的观察结果类似(50). 与这些差异一致的是，泛素化蛋白的积累和NF-κB的抑制程度（依赖于IκB泛素化和降解(16，17)与-11B细胞相比，硼替佐米治疗后-11A细胞中的硼替佐米特显著降低(图4B). 此外，我们观察到，在低剂量硼替佐米（10–9M） ，-11A中的蛋白酶体活性受到刺激而不是抑制(图4A)这表明蛋白酶体活性可能被硼替佐米诱导的机制所修饰，这些机制尚待确定。在-11A和-11B细胞中观察到的硼替佐米的这些差异效应和对蛋白酶体活性的低剂量刺激可能发生在蛋白酶体水平的上游或蛋白酶体水平，这可能是由于细胞药物摄取或代谢的差异、影响稳定性的泛素酶或伴侣蛋白，或蛋白酶体成分的基础和诱导水平(16–18)这需要在未来的研究中进行调查。

过去，已经进行了研究，以确定不同癌症对硼替佐米敏感性的分子机制，特别是在MM中。基于这些研究，硼替佐米的抗癌作用是否以及在多大程度上取决于NF-κB活性，仍存在争议。在MM中，骨髓基质和内皮细胞对IL-6、ICAM和VEGF的NF-κB依赖性表达与硼替佐米的反应和耐药性有关(51，52)但这种微环境与骨髓外发生的HNSCC或其他实体癌的微环境不同。此外，我们没有检测到与MM内在耐药相关的其他NF-κB相关基因的差异，如BCL-2或HSP27（数据未显示）。我们在UM-SCC细胞以及其他一些实体肿瘤中的数据表明，NF-κB活性是重要的，但不是决定硼替佐米抗癌作用的唯一因素(19–29，32–35). 此前，我们的实验室表明，小鼠和人类HNSCC表现出增加了构成性NF-κB的活化，并且NF-κ的特异性抑制增加了细胞死亡(5–11). 在抑制NF-κB活化的浓度下，硼替佐米能够阻止皮肤和空气消化道的一组小鼠和人SCC细胞的细胞增殖并诱导细胞死亡，以及在小鼠HNSCC异种移植动物模型中的肿瘤发生(11). 此外，诱导型IκBα信号磷酸化突变体和硼替佐米对NF-κB的特异性抑制与显著降低促炎症和促血管生成细胞因子、Gro-1和VEGF的生成有关在体外和抑制血管生成体内(10，11). 此外，在本研究筛选的9个UM-SCC细胞系中，UM-SCC-9和-38是对硼替佐米最耐药的细胞系，表现出相对较低的组成性NF-κB活性(图1B)而UM-SCC-11B是最敏感的细胞系，表现出高基础NF-κB结合和报告活性（6、43和本研究，Chen Z，数据未显示）。通过报告基因检测，硼替佐米的抑制作用与抑制NF-κB活性的程度不同相对应(图5). 在UM-SCC-11B细胞中，硼替佐米诱导了更强和更早的NF-κB报告活性抑制(图5B); 相比之下，在UM-SCC-11A细胞中，NF-κB活性在早期受到刺激，而药物对其抑制较少(图5A). 总之，我们现在和以前的数据与NF-κB重要但不是硼替佐米活性在HNSCC中的唯一决定因素的假设一致。

除了硼替佐米对NF-κB活性的不同影响外，UM-SCC-11A细胞相对于-11B还表现出AP-1报告活性的显著增强(图5 E、F)，另一种促增殖和促生存因子通常在HNSCC中共同激活(6，7). 与UM-SCC细胞系中鉴定的AP-1组成性激活的发现一致(6，7)，我们已经表明，与其他基因启动子的结合频率相比，包括UM-SCC-11A和-11B在内的肿瘤细胞系的子集过度表达基因簇，其启动子区域预测的AP-1结合基序的流行率增加(41). 因为AP-1包括JUN/FOS家族蛋白复合物(2，三)和蛋白酶体抑制剂可以通过JUN/FOS的转换减少潜在地激活AP-1，一种可能导致HNSCC中AP-1诱导差异的机制可能是由于JUN/FOS可用于接受上游信号通路信号的更多积累(18). 此前，我们的实验室获得了AP-1上游信号通路异常激活的证据，包括中间激酶途径MEK/MAPK(7)和膜生长因子受体，如IL-1R(5)、表皮生长因子受体(7，44，45)和肝细胞生长因子（HGF）/c-Met(53). 我们的实验使用MAPK途径激酶抑制剂JNK、p38或MEK/ERK(图6，参考7)支持JNK和p38是硼替佐米治疗后激活AP-1和促进UM-SCC-11A增殖的主要途径的假设。我们的第一阶段临床研究支持了这一观察结果，在患者肿瘤标本中，硼替佐米单独显著抑制NF-κB p65亚单位磷酸化活性形式的核定位，而不是ERK、JUN或STAT3磷酸化(48). 我们的数据也与最近的报道一致，即阻断MAPK通路可以显著增强造血恶性肿瘤的细胞毒性和凋亡(23–25，34). 研究了MM中p38、JNK和c-JUN的激活，以及p38通路对MM中硼替佐米敏感性的影响(23–25，34)与本研究中描述的HNSCC类似。然而，c-Jun和JNK活化的增加与硼替佐米诱导的细胞凋亡有关(22，27)在MM中，这与我们在HNSCC中观察到的和本文中介绍的相反。这种c-JUN和JNK功能的差异可能是组织特异性的，正如Podar等人(22). 在HNSCC细胞中，JNK和AP-1通路的激活一直与促增殖、抗凋亡和血管生成功能相关(7，44，45)，这与MM的观察结果不同。

基于这项研究和以前的研究，我们在硼替佐米联合放射治疗的临床试验中致力于开发生物标志物，包括参与NF-κB和AP-1通路的分子(8，11，48). 我们对一组接受硼替佐米初始治疗24小时后但在放射治疗开始前接受活检的HNSCC患者进行了治疗前后的活检。通过免疫组织化学定量基线NF-κB/REL、ERK、STAT3核染色、凋亡（TUNEL）和增殖（Ki-67）的强度，并评估硼替佐米对磷酸化-RelA、RelB、c-REL、p105/p50、p100/p52、磷酸化-ERK1/2和磷酸化-STAT3的影响。与正常粘膜相比，HNSCC肿瘤标本显示所有五个NF-κB亚单位、p-ERK1/2和p-STAT3的基线核染色增强。在这些患者硼替佐米治疗24小时后获得的活检肿瘤标本中，3/4的患者通过TUNEL染色检测到凋亡与NF-κB的核磷酸化-RELA亚单位的抑制相关，但在随后进展的这些患者中，核磷酸化-ERK1/2和/或cJUN染色没有抑制或增加，以及一名核磷酸化-ERK1/2和cJUN活化且NF-κB不存在的患者，该患者没有出现凋亡或临床反应(8，48). 我们的结论是，本试验中测试的硼替佐米剂量抑制了典型NF-κB通路亚单位的激活，然而，它并没有阻断非典型NFκB或其他生前信号通路的核激活，如ERK或JUN，这可能导致硼替佐米治疗后HNSCC患者出现部分反应后早期或延迟进展。临床研究的数据与我们在本研究中的发现一致，并将在其他地方介绍(48).

总之，UM-SCC-11A和-11B细胞（包括异种移植模型）对硼替佐米的敏感性存在明显差异(图1–三). 我们的数据表明，从蛋白酶体抑制程度的差异到NF-κB和AP-1转录因子活性的可变影响，这些差异背后的机制可能存在于不同的调节水平(图4和​和5）。5). 我们发现，与-11B细胞相比，硼替佐米对UM-SCC-11A细胞蛋白酶体和NF-κB活性的抑制程度较小(图4和​和5），5)经硼替佐米治疗后，UM-SCC-11A细胞AP-1活性增加(图5). 阻断JNK和其他MAPK活性可降低UM-SCC-11A细胞AP-1活性并与硼替佐米抗肿瘤活性协同作用(图6). 这项临床前研究表明，比较治疗前后活检中硼替佐米对蛋白酶体活性、NF-κB和AP-1信号激活、增殖和凋亡的影响的分析，可能有助于开发癌症临床试验的生物标记物，其中观察到硼替佐米布的异质反应。这些生物标记物可能与确定更有效治疗的最佳方案有关。抑制JNK和其他MAPK通路，阻断AP-1活性并增强硼替佐米抗肿瘤作用，可能是值得进一步研究的一种组合。

补充材料

表1

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致谢

我们感谢Millennium Pharmaceuticals，Inc.（马萨诸塞州波士顿）为本研究提供硼替佐米，感谢Mark Rolfe博士和William Riordan博士提供蛋白酶体活性测定方案。

缩写列表

HNSCC公司
头颈部鳞状细胞癌
核转录因子
核因子κB
AP-1型
激活蛋白-1
MTT公司
3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴
JNK公司
c-Jun氨基末端激酶
IκB
抑制剂kappaB，TNF-α：肿瘤坏死因子α
隧道
末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP-地高辛镍标记
MM（毫米）
多发性骨髓瘤，MEK:MAP/ERK激酶，MAPK/ERK：丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶
第1组
Gro1癌基因/CXCL1/KC
PI3K系列
磷脂酰肌醇3-激酶
血管内皮生长因子
血管内皮生长因子

脚注

*Bortzomib是根据与Millennium Pharmaceuticals，Inc.签订的材料合作研发协议提供的研究药物。

*由NIDCD内部项目Z01-DC-00016支持

工具书类

1阿加瓦尔BB。核因子-κB：内在的敌人。癌细胞。2004;6：203–8。[公共医学][谷歌学者]
2Shaulian Karin M.AP-1是细胞生命和死亡的调节器。自然细胞生物学。2002年；4：E131–6。[公共医学][谷歌学者]
三。Eferl R、Wagner EF。AP-1：肿瘤发生中的一把双刃剑。Nature Rev癌症。2003;三:859–68.[公共医学][谷歌学者]
4Van Waes C.核因子-κB在癌症的发展、预防和治疗中的作用。临床癌症研究。2007;13:1076–82.[公共医学][谷歌学者]
5Allen CT，Ricker JL，Chen Z，Van Waes C.活化核因子-kappaB在头颈部鳞癌发病机制和治疗中的作用。头颈。2007;29:959–71.[公共医学][谷歌学者]
6Ondrey FG，Dong G，Sunwoo J，等。表达促炎和促血管生成细胞因子的人头颈部鳞癌细胞系中转录因子NF-（kappa）B、AP-1和NF-IL6的组成性激活。霉菌致癌。1999;26:119–29.[公共医学][谷歌学者]
7Bancroft CC，Chen Z，Yeh J，等。表皮生长因子受体、PI3K和MEK信号激酶的药物拮抗剂对人头颈鳞癌细胞系NF-kappaB和AP-1活化以及IL-8和VEGF表达的影响。国际癌症杂志。2002年；99:538–48.[公共医学][谷歌学者]
8Van Waes C，Chang AA，Lebowitz PF，等。蛋白酶体抑制剂硼替佐米联合治疗复发性头颈部鳞癌患者时抑制核因子-κB和靶基因。国际放射肿瘤生物学杂志。2005;63:1400–12.[公共医学][谷歌学者]
9Duffey DC，Chen Z，Dong G，等。核因子-kappaB的显性-阴性突变抑制剂kappaBalpha在人头颈部鳞状细胞癌中的表达抑制生存、促炎性细胞因子表达和体内肿瘤生长。癌症研究。1999;59:3468–74.[公共医学][谷歌学者]
10Loercher A，Lee TL，Ricker JL，等。核因子-kB是鳞癌基因表达谱和恶性表型改变的重要调节因子。癌症研究。2004;64:6511–23.[公共医学][谷歌学者]
11Sunwoo JB，Chen Z，Dong G，等。新型蛋白酶体抑制剂PS-341抑制鳞癌中核因子-κB的激活、细胞存活、肿瘤生长和血管生成。临床癌症研究。2001;7:1419–28.[公共医学][谷歌学者]
12Druzgal CH，Chen Z，Yeh NT，等。作为头颈部鳞癌患者治疗反应和生存标志物的纵向血清细胞因子和血管生成因子水平的初步研究。头颈。2005;27:771–84.[公共医学][谷歌学者]
13Allen C，Duffy S，Teknos T，Islam M，Chen Z，Albert PS，Wolf G，Van Waes C.核因子-kappaB-相关血清因子作为晚期口咽癌反应和生存的纵向生物标记物。临床癌症研究。2007;13:3182–3190.[公共医学][谷歌学者]
14Zhang PL，Peldliti PK，Law A等。磷酸化核因子-κB在扁桃体鳞癌和高度发育不良中的过度表达与预后不良相关。中度病理学。2005;18:924–32.[公共医学][谷歌学者]
15Chung CH、Parker JS、Ely K等。基因表达谱识别上皮-间充质转化和核因子激活-{kappa}B高危头颈鳞癌的信号特征。癌症研究。2006;66:8210–8.[公共医学][谷歌学者]
16Adams J.蛋白酶体抑制剂作为抗癌药物的发展。癌细胞。2004;5:417–21.[公共医学][谷歌学者]
17Adams J、Palombella VJ、Sausville EA等。蛋白酶体抑制剂：一类新型高效抗肿瘤药物。癌症研究。1999;59：2615–22。[公共医学][谷歌学者]
18Treier M，Staszewski LM，Bohmann D.体内泛素依赖性c-Jun降解由δ结构域介导。单元格。1994;78：787–98。[公共医学][谷歌学者]
19An J、Sun Y、Fisher M、Rettig MB。蛋白酶体抑制剂硼替佐米对肾癌的最大凋亡是核因子KB依赖性的。摩尔癌症治疗。2004;三：727–36。[公共医学][谷歌学者]
20Dai Y，Rahmani M，Grant S.蛋白酶体抑制剂通过SAPK/JNK和NF-κB依赖过程增强细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂黄哌啶醇诱导的白血病细胞凋亡。致癌物。2003;22:7108–22.[公共医学][谷歌学者]
21Hipp MS、Urbich C、Mayer P等。蛋白酶体抑制通过诱导AP-1在人内皮细胞中导致NF-kappaB非依赖性IL-8转录激活。欧洲免疫学杂志。2002年；32:2208–2.[公共医学][谷歌学者]
22Podar K，Raab MS，Tonon G，等。c-Jun上调通过Caspase触发的c-Abl裂解抑制人类多发性骨髓瘤的增殖并诱导细胞凋亡。癌症研究。2007;67:1680–1688.[公共医学][谷歌学者]
23Tai YT、Fulciniti M、Hideshima T等。靶向MEK可诱导骨髓瘤细胞的细胞毒性并抑制破骨细胞生成。鲜血。2007;110:1656–63. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
24Kojima K、Konopleva M、Samudio IJ、Ruvolo V、Andreeff M。有丝分裂原激活的蛋白激酶抑制增强急性髓性白血病细胞中p53的核促凋亡功能。癌症研究。2007;67:3210–9.[公共医学][谷歌学者]
25Navas TA、Nguyen AN、Hideshima T等。抑制p38a MAPK通过调节体外Hsp27、Bcl-XL、Mcl-1和p53水平，增强蛋白酶体抑制剂诱导的骨髓瘤细胞凋亡，并抑制体内肿瘤生长。白血病。2006;20:1017–1027.[公共医学][谷歌学者]
26Johnson TR、Stone K、Nikrad M等。蛋白酶体抑制剂PS-341克服Bax和caspase 9阴性或Bcl-xL过度表达细胞中的TRAIL抵抗。致癌物。2003;22:4953–63.[公共医学][谷歌学者]
27Yang Y、Ikezoe T、Saito T、Kobayashi M、Koefler HP、Taguchi H。蛋白酶体抑制剂PS-341通过JNK/c-JUN/AP-1信号诱导非小细胞肺癌细胞的生长停滞和凋亡。癌症科学。2004;95:176–80.[公共医学][谷歌学者]
28Yu J，Tiwari S，Steiner P，Zhang L.蛋白酶体抑制剂Bortezomib[VELCADE，PS-341]在Bax缺乏和p21缺乏结肠癌细胞中的差异凋亡反应。癌症生物治疗。2003;2:694–9.[公共医学][谷歌学者]
29Fribley A，Zeng Q，Wang CY。蛋白酶体抑制剂PS-341通过诱导头颈鳞癌细胞内质网应激反应性氧物种诱导细胞凋亡。分子细胞生物学。2004;24:9695–704. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30Williams S、Pettaway C、Song R、Papandreou C、Logothetis C、McConkey DJ。蛋白酶体抑制剂Bortezomib对人前列腺癌异种移植物凋亡和血管生成的差异作用。摩尔癌症治疗。2003;2:835–43.[公共医学][谷歌学者]
31Nawrocki ST、Bruns CJ、Harbison MT等。蛋白酶体抑制剂PS-341对原位人胰腺癌异种移植瘤细胞凋亡和血管生成的影响。摩尔癌症治疗。2002年；1:1243–53.[公共医学][谷歌学者]
32Duan J，Friedman J，Nottingham L，Chen Z，Ara G，Van Waes C.核因子-kappaB p65小干扰RNA或蛋白酶体抑制剂硼替佐米使头颈部鳞状细胞癌对经典组蛋白脱乙酰酶抑制剂和新型组蛋白脱羧酶抑制剂PXD101敏感。摩尔癌症治疗。2007;61:37–50.[公共医学][谷歌学者]
33Chauhan D，Li G，Shringarpure R，等。阻断Hsp27可克服淋巴瘤细胞对硼替佐米/蛋白酶体抑制剂PS-341的耐药性。癌症研究。2003;63:6174–7.[公共医学][谷歌学者]
34Hideshima T、Podar K、Chauhan D等。p38 MAPK抑制增强PS-341（硼替佐米）诱导的对多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性。致癌物。2004;23:8766–76.[公共医学][谷歌学者]
35Minderman H，Zhou Y，O'loughlin KL，Baer MR。硼替佐米活性以及在急性髓系白血病细胞中与蒽环类和阿糖胞苷的体外相互作用与多药耐药机制和p53状态无关。癌症化疗药理学。2007;60:245–55.[公共医学][谷歌学者]
36Kondagunta GV，Drucker B，Schwartz L等。硼替佐米治疗晚期肾细胞癌患者的II期试验。临床肿瘤学杂志。2004;22:3720–25.[公共医学][谷歌学者]
37Fanucchi MP、Fossella FV、Belt R等。单独使用硼替佐米和硼替佐米联合多西他赛治疗既往治疗的晚期非小细胞肺癌的随机II期研究。临床肿瘤学杂志。2006;24:5025–33.[公共医学][谷歌学者]
38Alberts SR、Foster NR、Morton RF等。PS-341和吉西他滨治疗转移性胰腺癌：一项中北部癌症治疗组（NCCTG）的随机II期研究。安·昂科尔（Ann Oncol）。2005;16：1654–61。[公共医学][谷歌学者]
39Van Waes C、Sunwoo JB、DeGraff W、Mitchell JB。放射增敏和蛋白酶体抑制。摘自：亚当斯·J，编辑。癌症药物的发现和发展：蛋白酶体抑制剂在癌症治疗中的应用。Humana出版社；新泽西州托托瓦：2004年。第123-31页。[谷歌学者]
40Krause C、Carey T、Ott R、Hurbis C、McClatchy K、Regezi J.人类鳞状细胞癌。新的永久性细胞系的建立和鉴定。耳鼻咽喉弓。1982;107:703–10.[公共医学][谷歌学者]
41Yan B，Yang X，Lee TL，等。新表达特征的全基因组鉴定揭示了头颈部鳞癌中p53、NF-kappaB和其他信号转录因子的结合基序的独特模式和流行率。基因组生物学。2007;8（5） ：R78。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
42Elliott PJ、Soucy TA、Pien CS、Adams J、Lightcap ES。蛋白酶体抑制试验。方法分子医学。2003;85:163–72.[公共医学][谷歌学者]
43Yu M，Yeh J，Van Waes C.蛋白激酶酪蛋白激酶2通过血清因子介导头颈部鳞癌细胞中的抑制剂-kappaB激酶和异常核因子-kappa B活化。癌症研究。2006;66:6722–31. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
44Lee TL，Yeh J，Van Waes C，Chen Z。SOCS-1的表观遗传修饰通过JAK和/或MEK在头颈部鳞癌中对白细胞介素-6受体和表皮生长因子受体信号转导的反应，差异调节STAT3激活。摩尔癌症治疗。2006;5(1):8–19.[公共医学][谷歌学者]
45Pernas FG、Allen CT、Winters ME等。表皮生长因子受体和生存信号通路的蛋白质组特征对应于头颈癌对吉非替尼的敏感性。美国癌症研究协会第99届年会；加利福尼亚州圣地亚哥，2008年4月12日至16日。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
46Zhang X，Liu Y，Gilcrese MZ，et al.淋巴结转移小鼠模型揭示了从转移不良的亲代细胞系中选择的转移性人类口腔癌亚系中转移相关基因表达的改变。癌症。2002年；95:1663–1672.[公共医学][谷歌学者]
47Allen CT、Chang AA、Chen Z等。硼替佐米诱导的细胞凋亡具有有限的临床反应，同时伴有典型但非替代性NF-κB亚基或其他激活的前生存信号通路的抑制。临床癌症研究（已接受）2008[公共医学][谷歌学者]
48Russo A、Fratto ME、Bazan V等，以实体肿瘤中的凋亡为靶点：硼替佐米从临床前到临床证据的作用。专家操作目标。2007;11(12):1571–1586.[公共医学][谷歌学者]
49Hamilton AL、Eder JP、Pavlick AC等。硼替佐米蛋白酶体抑制（PS-341）：一项具有药效学终点的I期研究，采用14天周期的第1天和第4天时间表。临床肿瘤学杂志。2005;23:6107–16.[公共医学][谷歌学者]
50Poff JA、Traughber B、Allen C等。脉冲高强度聚焦超声通过蛋白酶体抑制剂硼替佐米增强鳞癌异种移植物的凋亡和生长抑制。放射科。2008（印刷中）[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
51Hideshima，Anderson关于新型靶向治疗的临床前研究。北美血液诊所。2007;21:1071–91.2007[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
52Hideshima T、Akiyama M、Hayashi T等。靶向p38 MAPK抑制骨髓环境中多发性骨髓瘤细胞的生长。鲜血。2003;101（2） ：703–5。[公共医学][谷歌学者]
53Dong G，Chen Z，Li ZY，Yeh NT，Bancroft CC，Van Waes C.肝细胞生长因子/分散因子诱导的MEK和PI3K信号通路激活有助于促进血管生成细胞因子白介素-8和血管内皮生长因子在头颈部鳞癌中的表达。癌症研究。2001;61：5911–8。[公共医学][谷歌学者]