摩尔癌症治疗。作者手稿；PMC 2009年9月1日提供。
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美国国立卫生研究院：尼姆斯81590
口服生物可利用小分子Hedgehog信号抑制剂抑制胰腺癌的肿瘤发生和转移
,1,5 ,4 ,6 ,2 ,1,5 ,1,5 ,1,5 ,1,5 ,1,5 ,1,5 ,2 ,1 ,1,3和1,三，5
乔治·费尔德曼
1马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系
5马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院索尔·戈德曼胰腺癌研究中心
沃尔克·芬德里奇
4马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院外科
凯伦·麦戈文
6马萨诸塞州剑桥Infinity Pharmaceuticals
贾希达·贝贾
2马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院比较医学系
萨维塔·比什特
1马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系
5马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院索尔·戈德曼胰腺癌研究中心
赫克托·阿尔瓦雷斯
1马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学医学院病理学系
5马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院索尔·戈德曼胰腺癌研究中心
Jan Bart M.库尔斯特拉
1马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系
5马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院索尔·戈德曼胰腺癌研究中心
尼尔斯·哈布
1马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系
5马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院索尔·戈德曼胰腺癌研究中心
柯林斯·卡里卡里
1马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系
5马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院索尔·戈德曼胰腺癌研究中心
迈克尔·穆伦多尔
1马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系
5马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院索尔·戈德曼胰腺癌研究中心
凯瑟琳·加布里尔森
2马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院比较医学系
拉杰尼·夏尔马
1马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系
威廉·松井
1马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系
3马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院肿瘤系
阿尼尔班·迈特拉
1马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系
3马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院肿瘤系
5马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院索尔·戈德曼胰腺癌研究中心
1马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系
2马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院比较医学系
3马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯大学医学院肿瘤系
4马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院外科
5马里兰州巴尔的摩约翰斯·霍普金斯大学医学院索尔·戈德曼胰腺癌研究中心
6马萨诸塞州剑桥Infinity Pharmaceuticals
要求重印：Georg Feldmann，约翰·霍普金斯大学医学院病理学系，CRB2，马里兰州巴尔的摩奥尔良街1550号316室，邮编21231。电话：410-955-3511；传真：410-614-0671。电子邮件：ude.imhj@4amdlefg 注：V.Fendrich和N.Habbe的当前地址：德国马尔堡菲利普斯大学马尔堡外科
摘要
最近的证据表明，阻断异常的刺猬信号可以作为胰腺癌的治疗策略。我们之前使用Hedgehog小分子拮抗剂环胺原型进行的研究表明，在自发转移原位异种移植模型中，Hedgehog-blocking对全身转移具有显著的抑制作用。环磷酰胺是一种具有次优药代动力学的天然化合物，这阻碍了临床转化。在本研究中，使用在体外和体内模型系统。体外IPI-269609对胰腺癌细胞株的治疗与使用环胺观察到的类似效果（即，Gli-responsive reporter击倒，Hedgehog靶基因的下调Gli1公司和普奇以及消除软琼脂中的细胞迁移和菌落形成）。单药IPI-269609可显著抑制人胰腺癌细胞系原位异种移植物的全身转移，尽管Hedgehog阻断剂对原发肿瘤体积的影响最小。在治疗的原发性肿瘤中观察到的唯一可识别的表型是醛脱氢酶-亮细胞数量的显著减少，我们之前已将其确定为胰腺癌中的克隆原性肿瘤始发人群。选择性体外用IPI-269609去除乙醛脱氢酶-亮细胞，同时显著降低无胸腺小鼠的肿瘤植入率。药物阻断异常的Hedgehog信号可能被证明是抑制胰腺癌全身转移的有效治疗策略，可能通过靶向具有肿瘤启动特性（“癌症干细胞”）的癌细胞亚群。
介绍
胰腺导管腺癌占胰腺癌的90%以上，是美国女性和男性癌症相关死亡的第四大常见原因。2004年，共有31771人死于胰腺癌(1). 自诊断时起，总中位生存期<6个月，平均5年生存率<5%，是迄今为止已知的最致命的恶性肿瘤之一(1).
在晚期、转移期，胰腺癌几乎无法通过任何可用的治疗方案加以控制，5年生存率估计极低，<2%。在80%以上的病例中，在最初诊断时，局部淋巴结或远处器官部位已经出现转移(1)这通常被解释为缺乏特定的早期症状和缺乏适当的早期检测诊断工具(2).
即使是早期局限性疾病的患者（可以进行有疗效的手术切除），几乎所有的患者都会在以后发生局部复发或转移到远处的器官部位，最终屈服于转移生长的衰弱效应(3,4).
因此，近年来，人们越来越多地致力于开发直接针对转移性肿瘤扩散的治疗策略，因为这种方案很可能具有巨大的临床影响。
最近，Hedgehog信号通路的异常再激活在包括胰腺癌在内的几种胃肠道癌症中被描述(5,6). 用环胺药物阻断Hedgehog信号传导抑制皮下胰腺癌异种移植瘤的生长(5,6)并且减少了在体外原位异种移植模型中的侵袭/迁移和集落形成以及转移的发展(7).
此外，最近的证据表明，声波刺猬配体（SHH）可能在CD24亚群中特异性过表达+/CD44细胞+/欧洲航天局+具有致瘤潜能增强和其他干细胞样特性的胰腺癌细胞(8). 我们自己的研究小组最近的另一份报告指出，在SSC低/醛脱氢酶（ALDH）亚群中观察到Gli1（主要的激活Hedgehog转录因子）的mRNA水平过表达，即具有增加的克隆潜能的“明亮”细胞(7). 总之，这些研究表明，一部分胰腺癌细胞（也称为“癌症干细胞”）对刺猬有依赖性。
尽管有这些令人鼓舞的临床前数据，但从未在临床环境中系统评估过药理学Hedgehog抑制的效果，到目前为止，还没有可用于临床的途径抑制剂。这可能是由于环丙胺（原型小分子Hedgehog抑制剂）相对较差的口服生物利用度和较短的全身半衰期造成的，使得维持足以持续抑制通路的全身药物水平存在问题(9). 在本研究中，我们描述了在体外和体内Hedgehog信号通路的新型水溶性小分子抑制剂IPI-269609的数据，该抑制剂旨在进行潜在的后续临床评估。
与之前使用环胺获得的结果一致，IPI-269609对Hedgehog信号的抑制可显著抑制人胰腺癌小鼠异种移植模型的转移扩散和肿瘤起始。正如观察到的那样，这些效应伴随着具有高ALDH活性的细胞亚群的减少在体外流式细胞术和体内通过免疫组织化学，表明所观察到的阻止转移和肿瘤发生可能是通过靶向具有肿瘤发生特性的胰腺癌细胞亚群来介导的。
材料和方法
单元格行
所有使用的胰腺癌细胞系都是在补充有10%（v/v）胎牛血清（FBS；Invitrogen）、1×Pen-Strep（Biofuids）、1 x MEM维生素溶液（Sigma-Aldrich）、1倍非必需氨基酸溶液和1%丙酮酸钠溶液（均来自Biofuides）的DMEM（Invitrogen）或RPMI（Invit罗gen）中生长的补充10%FBS和1×Pen-Strep。
Shh-LightII（ATCC登录号CRL-2795）细胞保存在含有4 mmol/L的DMEM中我-谷氨酰胺、1.5 g/L碳酸氢钠、4.5 g/L葡萄糖、10%小牛血清（Biomeda Corp.）、0.4 mg/mL基因抑素和0.15 mg/mL玉米素（均来自Invitrogen）。
293-ShhN-pIND细胞，稳定转染以分泌棕榈酰化的截短Hedgehog-配体ShhN(10)在DMEM、10%FBS、1×Pen-Strep和0.4 mg/mL基因工程素中生长，直至达到~80%的融合率。接下来，用含有2%FBS的培养基替换全生长培养基1天。然后收集条件培养基并过滤（孔径0.22µm），然后用于报告人分析。
对细胞系进行常规测试支原体使用MycoSensor PCR检测试剂盒（Stratagene）感染。
刺猬抑制剂
环帕明和IPI-269609由Infinity Pharmaceuticals提供(11,12). IPI-269609的化学结构如所示。
IPI-269609抑制Hedgehog信号在体外在Gli-responsive报告分析中，IPI-269609阻断了含有ShhN的条件培养基刺激的LightII细胞的通路活性(一个). (**,P（P）与对照组相比，<0.01。）在LightII报告分析中，IPI-269609显示出与环胺类似的剂量-反应曲线(B类). 刺猬通路的抑制导致广泛的在体外3-（4,5-二甲基噻唑基-2）-2,5-二苯基四唑溴的生长抑制作用(MTT公司)一组人胰腺癌细胞系的检测(C类). IPI-269609是植物衍生天然产物环胺的半合成类似物。IPI-269609的分子量为423 Da，与环胺的不同之处在于它有一个7米的D环和一个共轭的a环酮。这些结构修饰的结合使其相对于环胺具有更高的药物性能(D类).
细胞生长测定
如前所述，使用3-（4,5-二甲基噻唑基-2）-2,5-二苯基四唑溴化试剂（Promega）进行细胞生长分析(7,13).
Gli响应式报告器分析
将Shh-LightII细胞接种到24孔板中，每孔50000个，在1 mL全培养基中。第二天，取出完整的培养基，用PBS洗涤细胞一次。接下来，将仅含有0.5%BCS的低血清培养基与含有ShhN的条件培养基以1:1（v/v）混合，条件培养基补充有给定浓度或仅等量溶剂的环胺或IPI-269609，并加入孔中。在37°C下培养48 h后，取出培养基，用PBS清洗粘附细胞，并用100µL 1×被动裂解缓冲液（Promega）在平板上进行裂解。按照双荧光素酶报告分析系统（Promega）提供的标准方案对样品进行进一步处理。
最后，在光度计上测定发光（Wallac Victor21420，Perkin-Elmer）。所有实验设为三份，计算平均值和标准偏差。
胰腺癌细胞系的药物治疗、RNA提取和定量实时逆转录PCR
如前所述，测定稳态mRNA表达水平(7). 简言之，将对数生长期100 mm细胞培养皿中的胰腺癌细胞在0.5%FBS下血清饥饿24小时，然后在含有0.5%FBS的培养基中仅添加给定浓度或溶剂的药物，然后再培养72小时。
细胞在含有2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich）的裂解缓冲液RLT（Qiagen）的培养皿中进行裂解；使用橡胶警察（Sarstedt）收集裂解产物，并用QiaShreder自旋柱（Qiagen）均质。为了从肿瘤样品中提取RNA，使用旋转式均质机（Polytron PT1200C，Kinematica AG）均质组织。根据制造商提供的标准协议，使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）提取总RNA，并进行柱上DNA消化。
伤口化验
体外使用近汇合的E3LZ10.7和Capan-1细胞进行伤口愈合分析，这些细胞用6µmol/L IPI-269609或等量的溶剂在全培养基中处理。使用200µL移液管尖端刮去细胞区域，并在0、12和24小时时拍摄显微照片。
软琼脂分析
软琼脂中菌落形成的测定如前所述，只需稍作修改(7). 简单地说，将10000个胰腺癌细胞作为单细胞悬浮液溶解在含有0.7%琼脂糖（Invitrogen）的全培养基中，然后接种到六孔板中。底层含1%琼脂糖，顶层仅含全培养基。以最终浓度分别为3和6µmol/L的IPI-269609添加到每层中；添加等量的溶剂作为对照。将平板在37°C下培养4周。在37°C下，用0.05%结晶紫（Sigma-Aldrich）在80%PBS/10%乙醇/10%冰醋酸溶液中染色2小时后，通过紫外线照射观察菌落，并使用Quantity One分析软件（Bio-Read）进行定量。
H&E染色
在约翰霍普金斯大学医学院的参考组织学实验室中，用H&E对福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片进行染色。
ALDH活性的流式细胞术分析
确定在体外如前所述，使用IPI-269609（6µmol/L）或仅在低血清条件（0.5%FBS）下使用溶剂处理后进行ALDH活性(7).
S.c.胰腺癌异种移植的治疗
这里描述的所有动物实验都符合约翰·霍普金斯大学动物护理和使用委员会的指导方针。按照美国实验动物护理协会的指南对小鼠进行饲养。
为了生成s.c.小鼠异种移植物，对对数生长期的人类胰腺癌细胞进行胰蛋白酶处理，用PBS（Gibco-Life Technologies，Inc.）清洗，并用血细胞仪计数（Hausser Scientific）。
下一个，2.5×106将每个注射部位的细胞悬浮在总体积为200µL[PBS/Matrigel（BD Biosciences），1:1（v/v），预冷至4°C]的溶液中，皮下注射到6至12周龄雄性无胸腺CD1 nu/nu小鼠（Charles River）的两侧。
注射肿瘤细胞两周后，使用数字卡尺（Fisher Scientific），皮下肿瘤体积（V）测定为V（V）=1/2(ab公司2)，其中一是最大的b条是最小的正交肿瘤直径；小鼠分为四组，肿瘤体积相似。然后将每组随机分配到四种治疗方案中的一种：(一)控制(b条)IPI-269609每日单次剂量为20 mg/kg p.o(c（c）)吉西他滨100 mg/kg静脉注射，每4天一次，以及(d日)吉西他滨和IPI-269609联合用药。吉西他滨和IPI-269609分别以15和2.5 mg/mL的浓度溶解在无菌生理氯化钠溶液（0.9%）中。A组和C组接受等量的氯化钠溶液p.o。；A组和B组接受模拟腹腔注射氯化钠。IPI-269609剂量为20 mg/kg/d p.o.，是根据初步实验确定的，初步实验表明，通过定量实时逆转录-PCR，稳定的Gli1 mRNA水平被下调，Hedgehog通路被强效阻断。
每5天测定肿瘤体积作为主要结果和评估潜在毒性的小鼠体重。药物治疗25天后终止研究。
原位异种移植的产生和药物治疗
以前也曾描述过通过外科植入产生人胰腺癌小鼠原位异种移植物(7).
简单地说，在无菌条件下采集皮下异种移植瘤，切割成边长为1 mm的立方体，并保存在PBS中，直到原位植入。使用异氟烷（Vedco）气体麻醉对6至12周龄的雄性无胸腺CD1 nu/nu小鼠进行麻醉，并通过左侧肋下切口观察脾脏和粘附胰腺。使用显微镜（机器人手术器械），在胰腺内准备一个小口袋，将先前准备好的肿瘤块插入其中。胰腺切口用8-0尼龙单丝缝合线缝合；腹壁用6-0尼龙单丝缝合；使用AutoClips（Braintree Scientific）调整皮肤。
手术植入E3LZ10.7异种移植瘤块三周后，通过超声扫描（Vevo660，Visual Sonics）确认胰腺内肿瘤的存在，并在三个正交轴上进行测量，一,b条、和c（c）; 肿瘤体积测定为V（V）= (美国广播公司) / 2. 将小鼠分为平均肿瘤体积相似的两组，并随机分配接受IPI-269609（20 mg/d p.o.）或仅用溶剂模拟治疗30 d。
在Capan-1的病例中，基于通过持续途径敲除和更长的治疗期来评估对原发性肿瘤生长的最大影响的想法，在原位肿瘤植入2周后通过皮下植入两个14D Alzet渗透泵（Alzet）来开始用药，持续治疗6周，每14天更换一次泵。使用Alzet泵时，将IPI-269609溶解在40 g/L无菌水中30%（2-羟基丙基）-β-环糊精（Sigma-Aldrich）中；对照组动物只在水中注射30%环糊精。
治疗结束时，对所有动物实施安乐死，确定原发肿瘤的大小，并进行尸检以确定肉眼可见的转移。取脾、肝、一肾、肺、胃和肠，用福尔马林固定。在脾脏的病例中，每次连续采集的器官中只有没有直接肿瘤侵袭的部分。对于每只小鼠，通过这些器官的一个随机切片进行组织学评估，以确定是否存在微转移。
ALDH免疫组织化学
使用标准技术进行免疫组织化学分析。简言之，通过一系列分级乙醇洗涤对福尔马林固定石蜡包埋组织的4µm切片进行烘焙、脱蜡和水合。抗原提取在柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中90+°C的蒸锅中进行25分钟。然后在室温下用一级ALDH抗体（BD Biosciences；1:100）探测切片1小时，然后用双内生酶块（DAKO）阻断步骤。使用EnVision+可视化系统（DAKO）与3，3′-二氨基联苯胺显色剂开发反应，并用苏木精复染。
使用Frida分析软件对ALDH高表达的细胞进行相对定量。7
植入式刺猬阻断剂IPI-269609预处理
为了进一步分析Hedgehog信号对肿瘤起始的作用，仅在皮下注射胰腺癌细胞到裸鼠体内之前和之后不久，每隔7天用IPI-269609阻断Hedgehong通路。特别是，用6µmol/L IPI-269609或等量的溶剂处理胰腺癌细胞系E3LZ10.7或Capan-1在体外对于3d。同时，使用7D s.c.渗透性Alzet泵（Alzet）将IPI-269609应用于裸鼠。使用带有台盼蓝复染的血细胞仪对细胞进行计数。仅使用活细胞>95%的悬浮液进行注射。总计5×106将细胞皮下注射到雄性CD1 nu/nu无胸腺小鼠的侧翼，总体积为200µL PBS/Matrigel（1:1，v/v）。给小鼠用药总共7天（即注射肿瘤细胞后再用药4天）。如上所述，在注射后7天和14天使用数字卡尺测定肿瘤体积。
统计分析
Kruskal-Wallis分析使用微软Windows的SPSS 14.0版（SPSS，Inc.）进行；双尾吨测试和Mann-WhitneyU型测试是使用Prism 4.00版（GraphPad Software，Inc.）完成的。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
结果
IPI-269609抑制刺猬信号体外
用含有ShhN的条件培养基培养LightII细胞（参考。10;)在低血清条件下48小时。与溶剂处理对照组相比，6µmol/L IPI-269609处理显著抑制LightII细胞的Gli-responsive报告活性。
如所示，IPI-269609以剂量依赖的方式阻碍了ShhN刺激的LightII细胞的报告活性。报告人抑制程度在体外与环胺相当，且在较高浓度下更为明显。
通过对21个胰腺癌细胞系（包括我们研究所产生的几个低流量细胞系）进行3-（4,5-二甲基噻唑基-2）-2,5-二苯基四唑溴化物检测，我们发现在低血清条件下使用6µmol/L IPI-269609治疗96小时后，出现了广泛的生长抑制（0%到几乎100%）()这与我们小组和其他人之前的研究结果一致(5–7).
进一步了解在体外特征化和体内实验中，选择了两株胰腺癌细胞系E3LZ10.7和Capan-1。这些细胞系是根据产生的异种移植物的可变组织学谱（E3LZ10.7中分化差，Capan-1中分化中等）、IPI-269609的可变反应谱选择的在体外()以及它们在裸鼠体内形成原位异种移植物的能力。
IPI-269609抑制刺猬抑制胰腺癌细胞迁移和集落形成体外
IPI-269609（6µmol/L）孵育48小时后，Hedgehog靶基因Gli1在mRNA水平下调在体外().
IPI-269609对胰腺癌细胞株的治疗作用在体外类似于刺猬路径阻断的生物效应。与环胺类似，与IPI-269609（6µmol/L）孵育后，胰腺癌细胞系E3LZ10.7中Gli1稳态mRNA水平显著下调(一个).体外在E3LZ10.7和Capan-1伤口试验中观察到IPI-269609治疗减少了细胞迁移(B类)，以及在软琼脂中的菌落形成和锚定非依赖性生长(C类). IPI-269609降低了E3LZ10.7细胞系中SSC-low/ALDH-bright细胞的比例。ALDH抑制剂二乙基氨基苯甲醛的处理(DEAB公司)作为阴性对照(D类). 该图显示了三个独立实验（*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.01).
此外在体外当使用新型抑制剂IPI-269609进行通路阻断时，也概述了之前使用“标准”刺猬抑制剂环胺发现的刺猬抑制对细胞迁移和克隆形成的影响。也就是说，在IPI-269609介导的Hedgehog抑制作用下，伤口愈合试验中观察到的细胞迁移和软琼脂中的菌落形成均显著减少().
IPI-269609减少ALDH-Bright胰腺癌细胞亚群体外
此前研究表明，抑制胰腺癌细胞系中的Hedgehog信号传导可减少具有肿瘤起始（克隆形成）特性的SSC-low/ALDH-bright细胞的亚群(7). 与上述结果一致，我们发现E3LZ10.7与IPI-269609（6µmol/L）在低血清条件下孵育可显著降低SSC-low/ALDH-bright细胞的比例，约为4倍().
S.c.E3LZ10.7异种移植物的处理
在观察到新型小分子抑制剂IPI-269609的治疗完全类似于在体外使用环胺抑制刺猬的效果，我们接下来试图评估体内IPI-269609治疗对胰腺癌生长和转移的影响。
为此，预先建立的E3LZ10.7皮下异种移植物(n个=每治疗组4人）随机分配接受(一)模拟治疗(b条)IPI-269609 20 mg/d p.o(c（c）)吉西他滨100 mg/kg i.p.，每4天一次，或(d日)IPI-269609和吉西他滨按给定剂量联合治疗。皮下注射肿瘤细胞悬液2周后开始药物治疗，皮下肿瘤的平均体积为60至70毫米3，持续了25天。
如所示与治疗结束时平均肿瘤体积小约40%的对照组相比，IPI-269609治疗组动物的皮下肿瘤生长受到轻微抑制；然而，这些差异并没有达到统计学意义，可能是因为每个治疗臂的动物数量很少，异种移植瘤大小的个体间差异很大。另一方面，与模拟治疗对照组相比，吉西他滨治疗或IPI-269609联合吉西他宾治疗可显著抑制皮下肿瘤生长P（P）药物治疗15天后开始<0.01（D15）]。单独使用吉西他滨治疗与联合使用IPI-269609和吉西他宾治疗之间没有差异。
用IPI-269609治疗s.c.E3LZ10.7异种移植物。尽管药物治疗25天后，IPI-269609（20 mg/kg/d p.o.）治疗动物的异种移植瘤平均大小比对照组小约40%，但这种差异在统计学上并不显著。吉西他滨（每4天腹腔注射100毫克/千克）的生长抑制作用更为明显。单独使用吉西他滨和联合使用IPI-269609和吉西他宾治疗的动物之间的生长抑制没有差异(n个=每组4人）。*，P（P）< 0.05.
在给定剂量下，我们没有观察到任何毒性迹象；这些动物警觉而活跃；检查器官的组织学检查正常（数据未显示）；根据总体重（数据未显示），体重没有下降。
IPI-269609治疗原位胰腺癌异种移植物的转移
先前的研究表明，环胺对皮下肿瘤生长的影响最小，同时能深度抑制全身转移(7). 因此，我们想检查IPI-269609是否能够抑制胰腺癌异种移植物远处器官转移的发展体内使用外科植入技术，在雄性CD1 nu/nu无胸腺小鼠中生成原位E3LZ10.7异种移植物，并在胰腺内植入3周后开始治疗胰腺内肿瘤。小鼠接受IPI-269609（20 mg/kg/d）或模拟治疗，共30天。
采用我们的手术植入方法，E3LZ10.7的肿瘤切除率为100%。
而用IPI-269609阻断Hedgehog对胰腺内“原发性”肿瘤生长没有影响()，我们观察到IPI-269609治疗动物的远处转移完全消失，而5只模拟治疗动物中有5只（100%）观察到至少一个远处器官部位的转移(). 同样，在给定剂量下，没有出现生长迟缓、行为异常或其他明显的毒性迹象（数据未显示）。
IPI-269609治疗原位E3LZ10.7异种移植物。一个IPI-269609（20 mg/kg/d p.o.）处理30 d，不会影响原位E3LZ10.7异种移植物的生长。B类经IPI-269609处理的原位E3LZ10.7的H&E染色(我)或仅溶剂(ii（ii）).C类，E3LZ10.7淋巴结转移的组织学示例(我)和脾脏(ii（ii）); H&E染色。
表1
原位E3LZ10.7异种移植物中发现远处器官转移的动物数量
组
| 控制，n个(%)
| IPI-269609，n个(%)
|
|---|
| 没有动物 | 5 | 5 |
|---|
| 淋巴结 | 第2页，共5页（40页） | 第0页，共5页（0） |
| 脾脏 | 第4页，共5页（80） | 第0页，共5页（0） |
| 肝脏 | 第2页，共5页（40页） | 第0页，共5页（0） |
| 肠 | 第0页，共5页（0） | 第0页，共5页（0） |
| 肺 | 第0页，共5页（0） | 第0页，共5页（0） |
| 腹膜 | 第2页，共5页（40页） | 第0页，共5页（0） |
| 肾脏 | 第2页，共5页（40页） | 第0页，共5页（0） |
组织学上，原位异种移植瘤类似低分化胰腺导管腺癌；IPI-269609治疗动物和对照动物之间没有明显差异().
使用另一种胰腺癌细胞系Capan-1证实了这些作用。在5只对照动物中，有5只（100%）在至少一个远处器官部位发现转移，但在使用IPI-269609治疗的小鼠中，仅发现两个区域淋巴结转移().
表2
原位Capan-1异种移植物转移到远处器官部位的动物数量
组
| 控制，n个(%)
| IPI-269609，n个(%)
|
|---|
| 没有动物 | 5 | 5 |
|---|
| 淋巴结 | 第4页，共5页（80） | 第2页，共5页（40页） |
| 脾脏 | 第5页，共5页（100） | 第0页，共5页（0） |
| 肝脏 | 第4页，共5页（80） | 第0页，共5页（0） |
| 肠 | 第5页，共5页（100） | 第0页，共5页（0） |
| 肺 | 第1页，共5页（20） | 第0页，共5页（0） |
| 腹膜 | 第1页，共5页（20） | 第0页，共5页（0） |
| 肾脏 | 第1页，共5页（20） | 第0页，共5页（0） |
在治疗结束时，IPI-269609治疗小鼠的Capan-1肿瘤体积趋于较小，但这种差异也没有达到统计学意义(P（P）=0.095）。同样，在该队列中未观察到任何毒性或体重减轻的迹象。
组织学上，这些肿瘤类似于中分化导管腺癌，IPI-269609治疗组与对照组无差异（数据未显示）。
ALDH-Bright胰腺癌细胞的去除体内
其他人先前的研究表明，具有高ALDH活性的细胞亚群在各种恶性肿瘤中显示出增加的克隆潜能(14–17)最近我们发现抑制刺猬可以减少胰腺癌细胞系中的这一人群在体外(7).
评估IPI-269609对Hedgehog的抑制是否降低了胰腺癌异种移植物中具有高ALDH活性的细胞的比例体内，原位E3LZ10.7异种移植物(n个=每个治疗组3只），使用皮下渗透性Alzet泵用IPI-269609治疗5天，并用免疫组织化学方法评估ALDH的表达。
肿瘤内稳态Ptch mRNA水平的下调反映了Hedgehog的抑制作用(P（P）= 0.021;). 值得注意的是，IPI-269609抑制Hedgehog通路的同时，ALDH活性高的细胞显著减少体内用免疫组织化学观察这些肿瘤().
应用IPI-269609导致刺猬靶基因显著下调第1部分在mRNA水平体内在E3LZ10.7异种移植物中(一个)免疫组化显示，伴有ALDH活性高的癌细胞减少(B类). 使用Frida分析软件定量ALDH阳性细胞(C类; *,P（P）< 0.05).
IPI-269609预处理降低肿瘤发生率体内
如上所述，迄今为止获得的实验结果似乎表明，抑制Hedgehog对抑制肿瘤转移有着深远的影响，可能部分通过靶向具有高ALDH活性的肿瘤细胞亚群来介导，而对“大块”原发肿瘤的影响最小。因为转移在功能上等同于远处肿瘤的发生，我们假设体外用IPI-269609预处理细胞可以优先消除致瘤亚群，阻断异种移植。
为了进一步证实这一假设，我们推测仅在肿瘤发生期间阻断Hedgehog信号是否足以影响胰腺癌异种移植的生长。为此，胰腺癌细胞系E3LZ10.7或Capan-1在皮下注射到裸鼠体内之前，用IPI-269609（6µmol/L）或溶剂培养3天。同时，在使用s.c.Alzet泵的裸鼠中，用IPI-269609阻断Hedgehog信号。使用泵进行用药的总时间为7天（即肿瘤细胞注射后的第4天；).
围植入刺猬封锁足以导致体内胰腺癌异种移植物的生长抑制。一个使用的治疗方案：IPI-269609抑制胰腺癌细胞株中的Hedgehog信号在体外同时，使用皮下渗透泵对裸鼠持续应用IPI-269609，并在肿瘤细胞植入后再持续4d。仅使用溶剂模拟处理作为对照，仅使用活细胞>95%的细胞悬浮液进行注射。在癌细胞注射后1周和2周测量S.c.肿瘤生长。IPI-269609预处理导致裸鼠中s.c.E3LZ10.7和异种移植物的生长显著降低(B类;n个=每组6人）。**，P（P）< 0.01.
胰腺癌细胞预处理的目的在体外是在注射到裸鼠体内之前消除ALDH-bright细胞。将IPI-269609应用于裸鼠，以消除宿主基质细胞通过分泌Hedgehog配体对通路激活的任何潜在贡献，从而在肿瘤发生过程中尽可能完全阻断Hedgehong信号。在那之后，没有再使用任何药物，只是简单地跟踪皮下异种移植瘤的生长。
令人惊讶的是，这种植入期Hedgehog阻断剂足以在Capan-1（数据未显示）和E3LZ10.7的异种移植物中引起显著的生长迟缓(). 事实上，生长迟缓比上述预先建立的异种移植物治疗中观察到的更为明显。
讨论
2003年，包括我们自己的研究小组在内的两个小组首次描述了胰腺癌中Hedgehog信号的异常再激活(5,6). 刺猬激活似乎主要通过胰腺癌细胞异常配体过度表达介导(5)但最近，有人提出了另一种可能有助于增加胰腺癌中Hedgehog通路活性的机制（例如，通过启动子超甲基化导致通路抑制剂人类Hedgehong相互作用蛋白沉默；参考文献。18).
在裸鼠中使用皮下异种移植物作为体内胰腺癌模型和环胺作为小分子Hedgehog抑制剂的模型，这些初步报告已经表明药物阻断Hedgehong信号作为胰腺癌潜在的新治疗选择。此外，这些研究还表明，将肿瘤细胞注射到裸鼠体内同时开始刺猬阻断可能会更显著地抑制胰腺癌异种移植物的生长(5)而不是应用于已经建立的异种移植物(6). 事实上，我们小组最近的一份报告显示，用环胺封闭刺猬，可显著抑制菌落形成在体外并阻止了转移的发展体内使用原位异种移植物，胰腺癌细胞系的治疗导致SSC-low/ALDH-bright亚群的减少，该亚群具有致瘤特性在体外(7).
在本研究中，我们发现新型小分子Hedgehog抑制剂IPI-269609完全类似于环胺阻断胰腺癌细胞Hedgehong信号的特性在体外和体内.细胞运动和在体外使用IPI-269609治疗后，菌落形成受损在体外; 此外，远处转移体内与我们之前使用环胺的观察结果类似，使用人胰腺癌小鼠原位异种移植物观察到的结果基本上被废除(7). 这与之前的报告一致，即Hedgehog信号介导上皮-间充质转化，从而增强癌细胞的运动能力和侵袭能力(7,19,20).
我们之前已经证明，用环胺抑制刺猬可以降低SSC-low/ALDH-bright癌细胞的比例(7)最初在血液恶性肿瘤中发现，其特点是在非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷小鼠中植入率明显较高(14–17). 在本研究中，我们发现与环胺类似，IPI-269609治疗可以减少胰腺癌细胞系中的这种亚群在体外此外，我们首次表明，刺猬阻断似乎可以降低ALDH过度表达癌细胞的比例体内免疫组织化学观察表明，这可能是Hedgehog阻断剂阻止肿瘤发生和发展转移的主要机制。在这个模型中，转移级联的最后一步被解释为在远处器官部位开始不同的新肿瘤。
本文的研究结果支持Bar等人最近的一份报告(21)他描述说，环胺治疗降低了ALDH-右侧胶质母细胞瘤细胞的比例，并削弱了其形成神经球的能力在体外以及它在裸鼠体内生长肿瘤的潜力。
迄今为止，我们从未能够根据Hedgehog配体表达的程度明确预测胰腺癌细胞系或异种移植物对药物Hedgehong途径抑制的反应。8因此，我们很有兴趣推测，如本文所示，ALDH-bright细胞染色是否适合作为替代生物标记物，以预测未来胰腺癌的总体预后或对Hedgehog通路抑制的敏感性。
我们的观察在一定程度上与Li等人最近的另一份报告一致(8)描述了具有干细胞样特性的胰腺癌细胞亚群的鉴定；CD24型+/CD44细胞+/欧洲航天局+研究发现，与体积肿瘤细胞相比，细胞具有显著的致瘤能力，并表现出干细胞的其他特性，如自我更新和产生分化后代的能力。值得注意的是，这一假定的胰腺癌干细胞组分的特征还包括Sonic Hedgehog配体SHH的过度表达约为“大块”肿瘤细胞的10倍，以及SHH的过表达约为周围非恶性胰腺组织的50倍，这意味着增加的Hedgehog信号可能是这一假定胰腺癌干细胞群体的一个决定性特征。
无论未来采用哪种概念，上述观察结果以及本研究中的实验结果都支持这样的假设，即以Hedgehog通路为靶点可能被证明是一种有效的治疗策略，可以特别有效地防止转移的形成。换言之，用小分子抑制剂靶向异常的Hedgehog信号可能为未来有效靶向假定的癌症干细胞亚群提供工具(22).
过去几年，药物刺猬阻断作为一种新的癌症治疗策略的临床评估一直受到阻碍，因为缺乏合适的物质，可能作为未来人类使用的药物。新型小分子Hedgehog通路抑制剂IPI-269609旨在克服这一缺点。它易溶于水；在本研究中，对半乳糖进行改性，例如添加环糊精，可以用来进一步提高其溶解度。该药物表现出强烈的通路抑制作用在体外和体内在所述的治疗期间，在施用剂量下，小鼠没有出现毒性、体重减轻或其他不良事件迹象。因此，IPI-269609可能是未来临床测试的一种有趣的候选物质。
Romer等人2004年的一项研究(23)已报告在体外PTCH1中Hedgehog通路活性的抑制以及肿瘤生长和生存期的延长+/−/第53页−/−小分子抑制剂介导的髓母细胞瘤转基因小鼠模型，该模型已在高通量筛选中鉴定(24). 然而，该化合物在胰腺癌治疗中的疗效尚未得到证实，关于人类的不良反应和毒性的临床数据目前尚不可用。
值得注意的是，另一种小分子Hedgehog途径拮抗剂GDC-0449（Genentech）对不同实体癌患者（即基底细胞癌，在i期临床试验中；参考文献。25)目前正在二期临床试验中评估联合化疗和贝伐单抗作为转移性结直肠癌患者的一线治疗方案，9可能很快会启动额外的第二阶段试验。
如果药物性刺猬阻断剂在未来某个时候能够成功地应用于临床，那么这种治疗策略与其他药物的结合很可能会优于单一药物治疗。与吉西他滨等已经建立的药物治疗方案相结合，目的是减少肿瘤体积，或与其他新型靶向治疗相结合，也是可以想象的(7,26). 虽然我们没有发现吉西他滨联合IPI-269609对s.c.E3LZ10.7异种移植物的生长抑制有任何协同作用，可能是因为在给定剂量下，吉西他宾单独在该模型中具有相对显著的生长抑制作用，使用较低、次优剂量的吉西他滨完全有可能揭示潜在的协同效应。
综上所述，本文的结果支持这样一个概念，即以异常Hedge-hog信号为靶点的药物是开发胰腺癌新治疗方案的有效途径。可在临床环境中评估的合适通路抑制剂的可用性是将该策略转化为未来临床应用的又一步。
致谢
我们感谢Christine Iacobuzio-Donahue博士（马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院病理学系）慷慨提供低侵袭性胰腺癌细胞系E3LZ10.7；Philip A.Beachy博士（霍华德·休斯医学研究所，约翰霍普金斯大学医学院分子生物学和遗传学系；现住址：加利福尼亚州斯坦福大学发育生物学系和干细胞生物学与再生医学研究所94305-5329）感谢稳定转染细胞系293-ShhN-pIND和Light2的慷慨捐赠；Marc Halushka帮助使用Frida软件分析免疫组织化学染色。
赠款支持：NIH拨款R01CA113669（A.Maitra）、Sol Goldman胰腺癌研究中心和Michael Rolfe基金会。G.Feldmann获得了德国学术交流服务（DAAD）博士后项目的奖学金资助。
工具书类
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