美国国家科学院院刊。1999年11月23日；96(24): 13898–13903.
增强嵌合潜能的总体策略转录激活物
ARIAD基因治疗公司，地址：26 Landsdowne Street，马萨诸塞州剑桥市02139
Mark Ptashne编辑，纪念斯隆-凯特琳癌症中心，纽约州纽约市，并于1999年9月13日批准
摘要
提高转录激活物效力的努力是通常不成功，因为激活因子在哺乳动物细胞限制其向目标启动子的传递。在这里，我们报告称嵌合激活物的有效性可以是通过将其表达为非共价四聚体而显著改善捆绑。捆绑激活域在据推测，激活报告基因要比简单的单体激活剂更有效因为在相似的表达水平上激活域被传递到目标启动子。这些捆绑的激活域也比其中的蛋白质更有效激活域在同一多肽中串联重复链，因为这种蛋白质表达很差，因此未有效交付。这些观察结果表明必须绑定到启动子的激活域的阈值数对于激活，启动子活性仅是绑定的激活器数量。我们表明捆绑可以被利用实际上是为了提高哺乳动物双杂交分析的敏感性，能够检测弱交互或弱交互表达蛋白。捆绑还大大提高了性能小分子调控基因表达系统调节蛋白的表达水平是有限的，这种情况可能会在基因治疗应用中遇到。
基因治疗中的许多新兴技术生物学研究利用嵌合转录激活物控制目标基因的表达(1–6). 转录激活子与基因启动子区的特定DNA序列结合基因和通过其激活域与之相互作用并招募转录机制的组成部分(7–9). 通常，嵌合激活蛋白由一个外来的DNA结合域组成到宿主细胞和来自蛋白质的激活域，如单纯疱疹病毒调节因子VP16或人类p65亚单位转录因子NF-κB(10–13). 这两个激活域已经证明，当招募到广泛的推广人员(15–17). 此外，他们不同于许多其他激活域的激活能力稳定集成的促进剂(18,19). 与他们共享的一致能够作为两者转录的有效诱导剂整合的和外显子启动子，这些激活域共享许多结构特性(20–22)并与许多相同的人互动转录机制的组成部分(23–25).
嵌合体激活剂的大多数实际应用将受益于效力增强的激活域。一种常用的策略增加转录激活物的效力是简单的串联在单个上下文中重复激活域多肽链(22,26–29). 理论上，这种策略会产生活化域附近的局部浓度较高促进者，反过来提高了转录器被招募。几项研究表明特征良好的短氨基酸基序的多重聚合激活剂可以导致基因的有效协同激活表达式(26–30). 例如，串联重复的氨基酸基序强烈源自OCT-1和VP16的激活域刺激转录(26,27). 然而，这些主题的重复通常不会产生比完整的父域。一种可能的解释是tandemly重复激活域的性能出乎意料地差是低蛋白表达。事实上，含有VP16的蛋白质或者p65激活域在真核细胞中表达不良，可能是因为细胞毒性作用(30–33). 多重蛋白质因此，激活域的表达水平可能很低他们并没有被有效地招募到目标推广者。
在本报告中，我们展示了包含多个VP16或p65激活域的拷贝确实在哺乳动物细胞中的含量非常低，而且它们是无效的转录诱导物。我们提出了一项战略，以加强向靶启动子递送多种激活剂。我们证明了这一点表达为非共价四聚体的激活域融合蛋白“捆绑”的表达水平高于tandemly所重申的多元体，它们比简单的更有效类似表达水平的单体激活剂。捆绑激活结构域极大地提高了靶基因的表达水平并提高双杂交分析的敏感性。
材料和方法
质粒构建。
转录因子融合蛋白从pCGNN中表达(34).转录因子的单个组分由PCR作为包含Xba公司我立即选址第一密码子上游和Spe公司I站点，框架内终止密码子和巴姆紧邻下游的HI站点最后一个密码子。包含多种成分的嵌合蛋白通过逐步插入Xba公司I–巴姆夏威夷群岛碎片成Spe公司我/巴姆HI开放载体由Rivera描述等。(5). 单个组件使用的及其缩写如下：G，酵母GAL4 DNA-binding结构域，氨基酸1-94；F、 人FKBP12，氨基酸1–107；R、，人的FKBP12-雷帕霉素结合（FRB）结构域FKBP12-雷帕霉素相关蛋白，氨基酸2025-2113；S中，人NF-κB p65亚单位的激活域，氨基酸361–551; 五、 疱疹病毒VP16的激活域，氨基酸410–490; 和L，大肠杆菌氨基乳糖阻遏物酸46–360。例如，pCGNN-GF2是通过插入GAL4生成的DNA将域绑定到pCGNN以生成pCGNN-G，然后两个FKBP域的顺序插入。
稳定细胞系。
描述了本研究中使用的HT1080B稳定细胞系以前(19). 此细胞系包含稳定整合的分泌型碱性磷酸酶(SEAP公司)报告基因置于五个GAL4结合位点的控制之下。pCGNN-RLN/Z1F3/Neo和pCGNN-RN/Z1F13/Neo三顺反子载体稳定转染HT1080L细胞(5)生成HT34和HT35细胞。共收集了100多个G418耐药菌落。添加药物和SEAP分析如里维拉所述等。(5). 背景SEAP活性，来自未转染HT1080B从每个值中减去个单元格。
结果
激活域的多重化未能增加其效力在体内.
确定激活域的简单多重聚合增加了它们的活性，我们产生了一系列嵌合激活物包含两个或多个p65（S）的串联重复副本，或VP16（V）激活域融合到GAL4 DNA结合域（G）。我们分析了这些激活物在人类HT1080B细胞中的功能纤维肉瘤细胞系携带稳定整合的SEAP公司基因由最小IL-2启动子驱动，两侧有5个GAL4-结合位点。我们之前已经表明集成的SEAP公司报告基因表达于HT1080B电池(19). 正如预期的那样，将产生GAL4-p65融合蛋白（GS）的表达质粒导致显著激活SEAP公司报告基因（图。一个). 一种类似的活化剂，含有两种串联重复p65激活域（GS2）诱导的报告基因表达到大致相同的水平。相反，GAL4融合蛋白包含三个或四个p65激活域GS3或GS4拷贝，它们各自的效果要差得多。因此，串联重复p65激活域未能增加报告子基因表达，在更高的重复水平上，实际上产生了报告基因表达急剧下降。对于GAL4-VP16激活域重复的抑制作用更为强烈。仅携带两个重复VP16激活结构域的融合蛋白（GV2）诱导的基因表达水平显著低于单畴聚变（GV）（图。一个).
有效激活域的多重化增加了它们的特异性但会降低其细胞内浓度。(一个)显示的GAL4激活质粒（每个100 ng）引入HT1080B电池中，可稳定集成SEAP公司受控制的报告基因5GAL4-结合位点。重组蛋白GV和GV2含有GAL4DNA结合域融合了一个和两个VP16激活拷贝域。GS、GS2、GS3和GS4包含融合的GAL4 DNA结合域具有一个、两个、三个和四个p65激活域拷贝，分别是。G仅表示GAL4 DNA结合结构域。平均值显示分泌到培养基中的SEAP活性（±SD）。(B类和C类)蛋白质印迹分析转染细胞的总细胞提取物。对薄膜进行了探测首先用抗血凝素检测转染蛋白(B类)然后用抗p65抗体确认每条通道中的蛋白质含量大致相等(C类).
为了检测各种融合蛋白的表达水平，我们对转染细胞的提取物进行免疫印迹分析（图。B类). 该分析表明GAL4融合蛋白包含两个或多个p65或VP16激活域副本与含有单个激活域。用一种抗体检测的对照斑点检测内源性p65证实类似数量的蛋白质被装载在每条车道上（图。C类). 综上所述，这些观察结果表明了两个结论。第一，串联重复激活域的变化导致激活蛋白的产生具有增加的比活性。这一点最为明显的是比较GS和GS2，得出类似水平的报告基因尽管蛋白质水平存在显著差异。第二，激活域的串联重复导致低蛋白表达水平，蛋白质浓度的降低可以在数量上超过了比活度的增加。因此，尽管这些蛋白质具有更大的内在效力，但它们不是以足够的数量交付给目标发起人，以实现净利润基因表达增加。
激活域的非共价“捆绑”。
我们的观察表明报告基因可以通过增强高效激活剂或，面对低激活剂表达细胞，通过提高激活剂的效率递送至启动子。考虑到这一点，我们修改了先前描述的小分子调控基因系统表达式(5). 我们的目标是获得更高水平的靶基因表达和提高靶基因表达效率应用，如基因治疗，其中调节转录因子可能较低。基本系统小分子调控基因表达（图。一个)由GAL4 DNA结合域组成融合到FKBP12（GF）的单个拷贝和来自NF-κB的p65亚单位融合到FKBP12-雷帕霉素相关蛋白（RS）(5,35). 见证人：天然产物化合物雷帕霉素，可同时与FKBP和FRB，FRB-65融合蛋白被招募到GAL4-FKBP融合蛋白，导致目标基因激活。这个安排导致最多传递一个p65激活每个GAL4单体的结构域（图。一个). 在这个系统中，招募到启动子的激活域的数量可以是以两种方式增加。首先，可以将多个FKBP域链接到GAL4，使每个GAL4单体能够募集多种激活剂（图。B类). 或者，多个激活域可以链接到FRB，使单个FKBP域能够招募多个激活器。
用于增加传递到启动子的激活域。(一个)在基本方法，两个融合蛋白，一个包含GAL4 DNA结合融合到FKBP12的结构域，另一个包含p65活化结构域与FRB融合，在细胞中表达。添加雷帕霉素导致每个DNA-结合招募一个激活域结构域单体。(B类)将多个FKBP融合到DNA结合域允许雷帕霉素招募多重激活每个DNA结合结构域单体的结构域。(C类)添加乳糖阻遏物四聚结构域对FRB活化的作用产生RLS的结构域融合蛋白允许雷帕霉素招募四个每个FKBP的激活域融合到DNA结合域。这个被招募到启动子的激活结构域的数量可以增加通过将更多FKBP部分连接到DNA结合域和/或乘以激活剂的结合位点的数量。理论上，一个启动子可以传递多达160个激活域通过处理表达GF4的细胞，含有5个GAL4结合位点和RLS与雷帕霉素的融合蛋白。实际激活次数传递到报告基因启动子的结构域在里面活泼地通过使用捆绑策略尚未确定。
捆绑增加激活域的效力。
与上面显示的一致，增加了串联重复嵌合激活剂中的激活域不是向雷帕霉素启动子（数据未显示）。相反，我们构建了一个携带单个激活域和促进非共价蛋白质多聚化的结构域，使得每个交付事件都会带来一个激活域的“捆绑包”启动子。这种蛋白质RLS含有一部分乳糖阻遏物(36)包含四聚结构域（L），位于FRB（R）和p65（S）域。产生的蛋白质应该存在于细胞为非共价四聚体，携带四个FRB结构域和四个激活域。在存在二聚体雷帕霉素的情况下雷帕霉素单分子（图。C类)可以招募整个四聚体束。通过组合FKBP的串联重复GAL4 DNA结合域上的部分与捆绑策略应该可以将多达16个p65激活结构域募集到单个GAL4单体。
研究捆绑激活域融合蛋白在在这个系统中，我们用表达转录因子融合蛋白和用10nM雷帕霉素处理细胞以递送活化启动子的结构域。我们发现FRB-65融合蛋白RS与每个GAL4单体诱导报告基因仅略高于背景（GF1+RS，图。一个). 相反，提供单个RLS每个GAL4单体（GF1+RLS）诱导的报告基因束转录强烈。免疫印迹分析表明RS和RLS蛋白在转染细胞中的表达水平相似（参见图。B类). 因此，增加激活次数靶向启动子的结构域导致显著增加在基因表达中。
稳定整合基因的表达水平与与启动子结合的激活域的数量和强度。(一个)指示的DNA结合结构域和激活结构域融合蛋白（参见材料和方法对于使用缩写）转染到携带稳定整合SEAP公司报告基因置于控制五个GAL4结合位点。在所有情况下，SEAP表达式绘制了接受100 ng激活域的培养物的值表达质粒，瞬时给出峰值表达值转染细胞，并在稳定状态下略低于峰值水平转染细胞系。SEAP的背景活动（24个SEAP单位）是在绘图之前从每个值中减去。在这个实验中，表达GF1+RS融合蛋白组合产生四种雷帕霉素存在下高于背景水平的SEAP单位。(B类)DNA结合域和激活域表达质粒转染HT1080B细胞。在所有情况下，培养基中分泌的SEAP活性平均值显示添加10nM雷帕霉素（±SD）。蛋白质印迹分析抗血凝素抗体的总细胞裂解物允许细胞中转录因子组分水平的评估。
事实上，通过测试融合蛋白的各种组合可以系统地改变激活域的数量从1到16（图。一个).在这些条件下传递到启动子并诱导的激活域数量报告基因活性。这一观察结果表明，总的来说，工程基因的表达可能仅受数量限制以及能够有效传递给稳定整合基因的启动子。
激活域捆绑包更强大，表现更高级别高于多重激活域。
接下来，我们将RLS束的转录活性与RS4融合蛋白，能够提供相同数量的雷帕霉素诱导的p65启动子激活域交付事件。为此，我们表达了DNA结合域GF1与RS4或RLS融合蛋白用10 nM雷帕霉素激活启动子。我们再次观察到强烈诱导RLS束向启动子的募集报告基因表达（图。B类). 相反，雷帕霉素未能在表达GF1和GF1的细胞中诱导报告基因表达RS4融合蛋白。因为每个交付事件都应该带来相同的启动子激活域的数量，这可能是活性的差异是由于RS4相对于RLS公司。与此解释一致，RS4与GS4蛋白一样，是在转染细胞中以极低水平表达（图。B类). 其低浓度会导致复合物减少在雷帕霉素存在下形成。对这一想法的进一步支持来自雷帕霉素诱导的RS4活性是确实可以与GAL4 DNA结合蛋白一起检测到包含三个串联重复的FKBP域（图。B类),表明RS4的低浓度可以部分地通过增加其受体的浓度进行补偿。
捆绑活动增加的另一种解释雷帕霉素存在时激活剂RLS是FRB的捆绑结构域对雷帕霉素介导的药物产生亲和力效应融合蛋白的相互作用。也就是说，RLS束的作用是高效转录诱导剂不是因为它们能够向启动子传递更多激活域，但因为多个FRB域和FKBP的协同交互连接到DNA结合结构域的部分。为了排除这个假设，我们进行了图顶部所示的实验。一个。我们表示RLS的极限数量在截短蛋白（LS）数量增加的情况下缺少FRB域的。我们期望LS蛋白稀释FRB从而降低潜在的贪婪效果。图。B类表明，即使在LS超过RLS，报告基因表达水平10 nM雷帕霉素的存在并没有减少。这一观察表明这种贪婪并不是集束食品效力增加的原因激活域。事实上，在LS的最高浓度下可能大多数束包含不多于一个FRB结构域，建议通过单个激活域招募四个激活域FRB足以实现高效启动子激活。
RLS束的转录活性取决于多次激活，但不与束中的FRB结构域一起激活。(一个)RLS和RLS增加时激活含结构域蛋白束细胞内LS或L区的浓度共存。(B类) (上部)GF1编码质粒（20 ng）单独或与100 ng RLS联合感染LS或L区域的浓度。用10 nM刺激细胞雷帕霉素和培养基中的SEAP活性在18小时后测定转染后。分泌到添加雷帕霉素后的培养基如图所示（±SD）。(下部)用Western blot分析法检测裂解产物12CA5抗体。
为了验证这确实是激活次数的假设每个招聘活动的域名对于实现高效启动子激活，我们在图的下部。一个。在这里，我们只表达了四聚结构域（L），从而稀释FRB和p65包中的激活域。在这种情况下，有一个报告基因表达的浓度依赖性降低。在测试的L的最高浓度，其中L的过量量非常大到RLS，以便大多数束最多包含一个激活域，报告基因表达与传统RS融合蛋白。因此，似乎增强了捆绑激活域的效力来源于它们能够向每个分子的启动子传递多个激活域交付事件。
捆绑增加极低激活物表达时的转录水平。
捆绑活化剂效力的提高有几个潜力实际应用。在激活器表达式为太低而无法支持靶基因激活，例如可能经常在基因治疗或细胞系中遇到转染，捆绑的激活剂可能会起作用。为了重现这种场景，我们生成了稳定的报告细胞系，其中嵌合转录因子是通过将激活剂在相对较弱Rous控制下的表达肉瘤病毒启动子取代强巨细胞病毒启动子（图。一个). 一个稳定细胞系池（HT34）表达捆绑激活物RLS，而另一个池（HT35）表达常规激活物RS对雷帕霉素的反应显著；HT34响应稳健，而HT35根本没有响应（图。B类). 在相反，RLS和RS在两组中的表达水平相似水池（图。C类). 在隔离两个池中的克隆（未显示数据）。因此，在同等水平上蛋白表达，捆绑激活剂可以成功激活在常规激活剂无法达到的条件下，靶基因。
刺激基因所需的激活剂阈值可以通过提高交付效率来减少表达启动子的激活域。(一个)图表显示转录激活物编码序列稳定整合到HT1080电池。激活域与DNA结合域融合通过将蛋白质相对较弱的控制下的相应编码序列劳斯肉瘤病毒启动子。内部核糖体进入序列（IRES）源于脑心肌炎病毒。复合材料DNA-结合域融合蛋白ZFHD F3已在前面描述(5). (B类)HT34和HT35细胞池用雷帕霉素在培养基中24小时的指示浓度在此期间分泌到培养基中的SEAP活性为仔细斟酌的。在所有情况下，分泌到添加雷帕霉素24小时后的培养基显示（±SD）。(C类)蛋白质印迹分析用抗p65抗体检测HT34和HT35细胞。RLS和RS蛋白质以非常低的水平表达，并显示为非常微弱的条带。
捆绑提高了双杂交分析的灵敏度。
当使用双杂交分析检测蛋白质-蛋白质相互作用(37–39). 此分析的输出取决于两个融合蛋白的相互作用，其中一个包含DNA结合域和另一个激活域，导致报告基因的激活。因为这个检测中的阳性信号需要组装双组分转录因子复合物，这两种融合蛋白必须以足够的水平表达它们之间的亲和力足以形成这些复合物。然而，在许多情况下，这些融合蛋白表达不良，或它们的亲和力低于检测阈值。测试是否绑定激活域伙伴可能会克服这种情况局限性，我们研究了c-Src SH3结构域和其合作伙伴c-Cbl(40,41). 虽然这些蛋白质的相互作用可以在基于酵母的双杂交试验中检测到，没有相互作用在哺乳动物系统中检测到GAL4-CBL和SH3-p65之间。转染哺乳动物细胞的免疫印迹分析表明失败是由于GAL4-CBL融合蛋白表达不良所致（未显示数据）。我们询问是否可以通过捆绑SH3-p65融合蛋白（图。B类). 事实上，如图。C类,捆绑蛋白SH3-LS从报告基因，而常规SH3-S获得的信号几乎无法检测到融合。通过以下方法获得了类似的结果SH3-VP16融合蛋白。因此，激活域的捆绑双杂交分析中的伙伴允许测量相互作用传统系统中的逃逸检测。
激活域融合蛋白的非共价捆绑增强哺乳动物细胞中蛋白质相互作用的检测。(一个)双杂交分析的图示含有靶标和激活物的捆绑融合蛋白域。GAL4 DNA结合域融合到c-Cbl（G-CblC类)与靶蛋白SH3相互作用融合到p65激活域（SH3-S或V inC类)乳糖阻遏物四聚结构域p65激活域序列（SH3-LS英寸C类). (C类) (上部)HT1080B电池承载SEAP公司报告基因置于用100 ng的指示表达质粒。分泌的SEAP活性平均值转染后24小时注入培养基中（±SD）。(下部)制备提取物的Western blot分析抗血凝素探针检测瞬时转染细胞抗体。
讨论
我们的数据表明，具有重复激活域的激活子在哺乳动物细胞中表达水平很低这个原因不能作为有效的转录诱导剂发挥作用体内因此，通过使用传统方法，它不是可能提高转录激活剂的效力在工程细胞。捆绑销售战略在避免低表达水平的问题，因为非共价捆绑的激活剂具有共价的效力多聚蛋白质，但simpler的明显毒性激活器。因此，捆绑允许交付多个高效地将激活域转移到目标启动子。
将激活剂传递到目标的效率启动子-是否由小分子二聚体、DNA蛋白介导相互作用，或蛋白质-蛋白质相互作用-仅由相互作用的内禀亲和常数和反应物的浓度。共价多重化激活器失败有效激活靶基因，因为其浓度低阻止他们达到目标。激活剂浓度低也可以解释实验后靶基因表达不佳的原因如我们所示，基因转移和双杂交失败分析。因此，捆绑激活剂比共价激活剂更有效重申激活剂，可能是因为它们在细胞内具有更高的活性集中精力使他们能够实现更高的目标入住率。
捆绑活化剂可能比单体更有效，因为每个交付事件都会为目标带来多个激活域发起人。虽然这个想法本身很简单，但它是令人惊讶的是，这种影响在数量上如此巨大。几乎所有在这里显示的实验中，捆绑的激活剂产生了健壮的基因在常规激活剂的条件下表达几乎完全无效。为什么捆绑的最简单解释激活器的有效性要高得多，因为存在一个阈值必须交付给转录前启动子。
例如，如果需要两个绑定的激活域转录启动，简单的激活剂需要两个独立的交付事件，而捆绑包只需要一个。如果交付频率-由激活剂及其对受体位点的亲和力为每10个事件一次发起人，那么只有1/100的发起人会达到阈值如果每个传递事件将单个激活域带到发起人。相比之下，每次交付捆绑激活剂都需要启动子超过阈值。因此，在蛋白质相同的情况下浓度，捆绑激活剂的有效性将≥10倍。如果阈值大于两个激活器，或频率交货期较低，则捆绑的数量优势激活器可能是巨大的。
捆绑策略具有实际应用。我们在这里演示了激活域捆绑大大提高了灵敏度哺乳动物的双杂交分析，使得两者之间的相互作用很差待检测的表达蛋白。捆绑激活域将可能还允许检测非常微弱的相互作用和潜在的瞬态相互作用不会导致信号进入常规分析。
嵌合激活物也构成了放置基因的系统的基础小分子控制下的转录(6)，用于调节转基因在动物模型和基因治疗中的表达应用。我们在这里展示了捆绑允许雷帕霉素调节系统功能时的调节蛋白是表达水平很低——许多基因治疗中的一种可能情况程序。有趣的是，我们还观察到捆绑会改变雷帕霉素激活的剂量反应约为10倍1 nM雷帕霉素的最大活化（图。B类)与…相比通常为10 nM(5). 因此，合并绑定域可能会改进实质性调控基因治疗的实用性减少所需的药物剂量。对于此类临床应用，我们开发了一种人类起源的替代四聚体结构域这应该是最低限度的免疫原性（未公布的数据）。
最终，嵌合激活物可能被用来激活未转录的内源性基因，通过将其表达为融合到天然或设计的DNA结合域，靶向利益促进者。捆绑激活器的驱动能力无明显细胞毒性的激活水平可能至关重要这些方法的成功。
致谢
我们感谢ARIAD基因治疗部门的成员支持。我们感谢Tim Clackson、Roy Pollock、Dorre Grueneberg和凯伦·佐勒感谢他们对手稿的有益评论。
缩写
| SEAP公司 | 分泌型碱性磷酸酶 |
| 联邦储备委员会 | FKBP12-雷帕霉素结合 |
工具书类
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