衰老小鼠肝脏COX1表达缺陷

线粒体能量代谢随年龄变化

线粒体膜电位降低，超氧化物生成增加，表明呼吸链功能障碍，伴随着氧化磷酸化过程。因此，我们通过实时呼吸测定法评估线粒体耗氧量，以确定氧化磷酸化是否随年龄而明显下降。在ADP和底物（状态3）的非限制量存在下，积极呼吸的线粒体达到最大生理呼吸。我们发现65例患者的状态3呼吸较低 肝线粒体与12个 W只老老鼠(图2A） ●●●●。添加寡霉素和CCCP来测量非耦合最大呼吸显示出类似的差异。当我们量化每种情况下三次测量所得的平均值时，我们观察到在所有条件下耗氧量都显著降低(图2B） ●●●●。随后，我们测量了NADH和NAD⁺肝组织裂解物中的水平。有趣的是，这两种代谢产物在65 W线粒体(图2C） ●●●●。然而，全国广告部⁺/两个年龄组的NADH比率相似。令人惊讶的是，对实验队列肝脏裂解物中ATP水平的定量显示，65 W小鼠样品(图2D） ●●●●。为了评估稳定状态下ATP含量的增加是否是糖酵解增加的结果，我们还测量了相同样品中的乳酸水平，发现在65 W小鼠样品(图2E） ●●●●。因此，我们的结果表明，在老年小鼠的肝脏样本中，呼吸链的活性降低，细胞表现出高度的糖酵解代谢。

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图2。

线粒体代谢随年龄变化。（A） 通过Seahorse Flux Analyzer对两组新分离的线粒体进行耗氧率测量，以确定线粒体的呼吸容量（平均值±标准差。，n个=4). （B） 基质注射后计算基础呼吸；注射寡霉素后计算解偶联呼吸，注射CCCP后计算最大呼吸。根据三次测量的平均值（平均值±标准偏差，*表示P（P）<0.05来自双尾未成对学生t吨-测试，n个=4). （C） 使用NAD/NADH比色分析试剂盒（Sigma-Aldrich），从两组中等量的组织裂解液中测定NAD和NADH总量。NAD+被计算为NAD总量与NADH之间的差值。还计算了NAD/NADH比值。NAD+、NADH浓度（吸光度）和NAD/NADH比率归一化为幼鼠样品的平均值（柱散点图显示生物复制品的平均值和分布，*表示P（P）<0.05来自双尾非配对t吨-试验，ns=无显著性，n个=3). （D和E）每个队列使用等量的组织裂解物，通过荧光分析试剂盒（Abcam）分别测定ATP和乳酸水平（柱散点图显示生物复制品的平均值和分布，*表示P（P）<0.05来自双尾未成对学生t吨-测试，n个=3).

线粒体呼吸复合物IV活性随着年龄的增长而降低

65 W小鼠线粒体中观察到的呼吸减少使我们检查了不同小鼠分离线粒体中线粒体DNA的数量。为此，我们使用等量的纯化线粒体，并用RNA酶处理获得的DNA以耗尽线粒体RNA。随后，我们使用实时PCR对线粒体DNA进行定量评估。为了完全覆盖线粒体DNA，我们使用了为几个线粒体基因设计的引物。这些分析表明，这两个国家的线粒体DNA拷贝数相似 W和65 W老鼠(图3A） ●●●●。接下来，我们分析了线粒体OXPHOS复合体的选定亚基的蛋白质水平。在所述的线粒体蛋白中，只有COX1在老年实验队列中显示减少(图3B） ●●●●。斑点定量分析证实，只有65例患者的COX1水平在统计学上显著降低 W队列(图3C） ●●●●。这些发现表明了对呼吸链细胞色素c氧化酶（复合物IV）的选择性作用。因此，我们评估了分离线粒体中复合物IV的活性。正如稳态蛋白质分析所预期的那样，我们发现复合物IV的活性在65 周线粒体样本，与12周相比具有显著的可变性 周样本(图3D） ●●●●。这些关于复合物IV活性的发现与COX1稳态水平的降低相一致。

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图3。

OXPHOS复合物IV随年龄增加而减少。（A） 从接受mtDNA分离和后续qPCR的队列中分离出等量线粒体，以测试不同的mt基因，以估计相对mtDNA量（平均值±标准偏差。，n个=4). （B） 通过Tris-Tricine-SDS-Page和免疫印迹检测OXPHOS，从两组中分离线粒体(n个=3). （C） 使用ImageJ计算曲线下的面积，并将其归一化为Vdac（平均值±s.e.m，*表示P（P）<0.05来自双尾未成对学生t吨-测试，n个=3）（D）使用活性测定微孔板试剂盒（Abcam）测量复合物IV活性。复合物IV活性标准化为幼年小鼠样品的活性，显示平均值±标准偏差（*表示P（P）<0.05来自双尾未配对t吨-测试，n个=3).

动物

所有小鼠的维护和研究均按照德国动物福利法案的指导方针进行，并得到德国尼德萨赫森Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit的批准（AZ:33.9-42502-04-14/1720）。这些动物要么被保存在标准啮齿动物喂食WT C57BL/6N小鼠的IVC（单独通风笼）中的高屏障（SPF规定的无病原体）区域，只有动物护理人员才能进入。WT C57BL/6N小鼠历史上是从德国苏尔兹菲尔德Charles River Laboratories，Research Models and Services GmbH获得的。随后，它们被保存在哥廷根马克斯·普朗克多学科科学研究所的动物设施中，直到达到适当的实验年龄。

线粒体分离

在各年龄段处死动物以分离肝脏。然后用玻璃陶器在15个 ml隔离缓冲液（IB），含10 mM Tris-MOPS pH 7.4，1 mM EGTA/Tris和200 mM蔗糖。在700×克, 10 最小值，4°C。线粒体以7000×克, 10 最小值，4°C。然后将其清洗并重新悬浮在隔离缓冲液中，并使用Bradford分析测定其蛋白质浓度。

线粒体蔗糖梯度纯化

为了从分离的线粒体中去除线粒体外核酸，首先用50 U苯甲酸酶30 最小值，4°。离心（2×，14000×克, 10 min，4°C）和IB中的再悬浮（如线粒体分离所述的成分，含有2.5 mM EDTA）停止了苯甲酸酶活性。通过放置1体积含有1.7的分离缓冲液来制备蔗糖梯度 将蔗糖倒入离心管中，并将其覆盖在含有1 M蔗糖。线粒体最终在1 M蔗糖隔离缓冲液并小心装入梯度。离心25分钟后 最小值，25000 rpm（SW41Ti，Beckman-Colter）在4°C下，从间期分离线粒体。

线粒体膜电位测量

使用流式细胞仪（FACSCanto，BD Biosciences）对分离的肝线粒体（如上所述）进行膜电位测量。将线粒体重新悬浮在新制备的分析缓冲液中（pH 7.0；250 mM蔗糖，20 mM Tris-MOPS，100 μM Pi（K），0.5 mM氯化镁₂，第5页 mM琥珀酸，2 µM鱼藤酮）。100 在所有样品中添加µM四甲基罗丹明-甲酯-氯甲醚，TMRM（Life Tech；T668），未染色对照除外，并将样品培养10 室温下最小，避光。测量在Ex488/Em590进行 纳米。

线粒体呼吸分析（海马）

通过Seahorse XFe96分析仪（Agilent；S7894-10000）上的呼吸测定法获得新分离的肝线粒体（如上所述分离）的耗氧率（OCR）。线粒体在线粒体测定（MAS）缓冲液（pH 7.4；70）中重新悬浮 mM蔗糖，210 mM甘露醇，5 mM HEPES，1个 mM EGTA，10个 毫微米千赫₂警察_4,5 mM氯化镁₂0.5%BSA（w/v），浓度为0.1 mg/ml。线粒体在海马XF96细胞培养微板（Agilent；101085-004）中校准，并在2000×g离心5次 室温下的最小值。在Seahorse XFe96传感器盒（Agilent；101085-004）的端口A中，丙酮酸盐（0.1 M丙酮酸盐，40 mM琥珀酸盐，40 MAS缓冲液中的mM ADP）或琥珀酸（100 µM琥珀酸盐，40 MAS缓冲液中的µM ADP混合物作为线粒体的底物。30 μM寡霉素，40 CCCP的µM，10 将溶解在MAS缓冲液中的µM抗霉素和鱼藤酮分别添加到传感器筒的端口B、C和D中。测量采用了改进的Mito压力测试方案。这些修改包括取消细胞板的平衡步骤，以尽量减少分离线粒体上的应力时间，并增加另一个端口注射以适应底物。

NAD/NADH测量

NAD的量化⁺/使用NAD测定小鼠肝组织样品中的NADH比率⁺/NADH定量试剂盒（Sigma-Aldrich；MAK037）。遵循供应商提供的协议。北美_全部的以及NADH在450℃时测量吸光度 在裂解物的机械裂解和脱蛋白后，在微孔板读取器（Synergy H1；BioTek；8041000）上以nm的波长进行。为了与NAD分开测量NADH_全部的，北美⁺被热分解30 60°C下的最小培养时间。

ATP测量

使用ATP检测试剂盒（比色法/荧光法）（Abcam；ab83355）并按照供应商协议的规定测量组织ATP总含量。为了测定总ATP，对小鼠肝组织进行机械裂解和脱蛋白。样品孵育30 室温下最小，反应混合物一式三份。甘油的磷酸化导致产品在570可检测到 使用微孔板阅读器（Synergy H1；BioTek；8041000）测量nm。

乳酸测量

使用L-乳酸检测试剂盒（比色法/荧光法）（Abcam；ab65330）检测小鼠肝组织裂解物中的乳酸。实验按照供应商提供的协议进行。机械裂解后，样品脱蛋白并检测30 最小值：在570℃下用热量法测定乳酸 纳米。测量一式三份，并使用微孔板阅读器（Synergy H1；BioTek；8041000）进行可视化。

线粒体DNA分离

使用QIAamp®DNA Blood Mini Kit从线粒体中分离线粒体DNA。分离的线粒体（见上文）在提供的样品缓冲液中稀释1:50，并执行制造商的协议。

RNA的分离纯化

分离和纯化的线粒体在1 ml TRIzol，使用供应商的方案。然后按照制造商的说明用DNase I（ThermoFisher Scientific）处理样品。为了纯化样品，使用了RNA清洁和浓缩试剂盒（R1013，Zymo Research）。使用Nanodrop 2000测量RNA质量和浓度。

cDNA合成与qPCR

cDNA是使用RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒（K1621；ThermoFisher Scientific）合成的，特别是在热循环器（Labcycle Gradient，SensoQuest GmbH）中使用来自分离RNA的随机六聚体引物（如前一节所述）。在Quant Studio 6 Flex Real-Time PCR系统（4485691；ThermoFisher Scientific）上，将该cDNA四倍用于与Sensi Mix SYBR Low-ROX试剂盒（QT625-05；Bioline）的实时PCR反应。所用引物的所有引物序列可根据要求提供。

Tricine-SDS PAGE和western blot

使用标准方法进行Tricine-SDS-PAGE。样品在T-PER组织蛋白提取缓冲液（ThermoFisher Scientific；78510）中进行溶解。所用凝胶为10-18%梯度凝胶。使用标准的半干转移法进行蛋白质印迹。

细胞色素c氧化酶活性测定

复合物IV啮齿动物酶活性微板分析试剂盒（Abcam；ab109911）用于评估分离的小鼠肝线粒体中细胞色素c氧化酶的活性。该程序按照供应商的指示执行。该检测的原理是使用免疫沉淀的线粒体复合物IV，其活性由细胞色素c的氧化决定。使用微孔板阅读器（Synergy H1；BioTek；8041000）测量细胞色素c吸光度，细胞色素c因氧化而变为无色，在550℃下可检测到 纳米。

图书馆准备

线粒体总RNA被纯化并浓缩在RNA-Clean Concentrator™-5柱上（美国加利福尼亚州欧文市Zymo Research）。cDNA文库由50个 ng RNA根据牛津纳米孔技术（牛津纳米孔科技有限公司，英国牛津）协议“DNA-PCR测序”，使用14个周期的PCR（8 最小拉伸时间）。ONT适配器连接到650 cDNA的ng。

纳米孔测序和分析

使用MinION Mk1b和R9.4.1流式细胞对纳米孔文库进行测序。使用MinKNOW（版本21.11.9）生成数据并进行基本调用。然后将fastq文件上传到Epi2Me实验室（1.1版）的差异基因表达工作流并进行分析。使用Prism 9软件（GraphPad software，San Diego，CA，USA）对获得的转录本计数进行处理，以生成热图和火山图。

统计分析

两组（或多组）数据的平均值之间的显著差异采用非配对分析t吨-Prism 9软件（GraphPad software，San Diego，CA，USA）中的测试或方差分析测试，除非另有说明。

作者承认资金部分列出的资金机构。