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抗体是生命科学和临床研究中最常用的工具之一,用于研究各种生物学通路和疾病中的蛋白质及其功能。
好的抗体具有靶标特异性和灵敏度,即使在低表达水平下也能识别目的蛋白。但是,越来越多的研究表明,并非所有抗体都具有靶标特异性,也有许多抗体表现出与脱靶蛋白的交叉反应性。从而导致实验不可重复性这一公认问题。1这些非特异性抗体会导致资源浪费,并妨碍科学进步。2,3
解决方案:敲除验证
接受度最广且最受信任的抗体特异性验证过程之一是基因敲除 (KO)验证。4击倒对手验证是一项非常稳健的技术,可在不表达目的蛋白的 击倒对手细胞系或组织中通过检测目的抗体来确证其特异性。
在 击倒对手细胞系中测试特异性抗体时,特异性抗体不会产生信号,但在野生型 (重量)细胞系测试特异性抗体时,特异性抗体会产生特异性靶蛋白信号。以这种方式,击倒对手验证作为真正的阴性对照,以确认抗体对目标蛋白的特异性。4,5
阿布卡姆使用广泛的人 击倒对手单倍体细胞系库来进行抗体验证。这些 击倒对手细胞系通过 CRISPR-Cas9公司生成,并通过 桑格测序鉴定。这种类型的 击倒对手细胞系提供了来自单个等位基因 击倒对手的完全丧失功能的表型,并消除了在二倍体细胞模型中观察到的来自第二个等位基因对敲除的任何掩盖。6-8
当 击倒对手验证我们的抗体时,我们主要使用 西方印迹来评估结果。击倒对手验证可产生一系列 西方印迹结果,以下示例给出了我们处理这些结果的方式。
特异性抗体
图1: Cdk4 RabMAb公司®产品 (ab108357)击倒对手样本中正确分子量 (兆瓦)的预期条带消失。
所有泳道:1/1000 稀释度的镉钾4兔单克隆抗体 [EPR4513](ab108357)
泳道1: 野生型 HAP1型细胞裂解液泳道2:镉钾4基因敲除 HAP1型细胞裂解液
预测条带大小:34千帕观测条带大小:34千帕内参对照品(红色条带):1/1000 稀释度的β 肌动蛋白抗体 (ab8226)
二抗:红外染料 800山羊抗兔 IgG(H+L)红外染料 680山羊抗小鼠 IgG(H+L)均为 1/10,000 稀释度
部分特异性抗体-额外条带
图2:Cdk6号机组小鼠单克隆产品 (ab54576)击倒对手样本中正确兆瓦的预期条带消失;因此,抗体可识别其预期靶标。然而,在 重量和 击倒对手样本中也存在额外条带。这可能是由于抗体与其他蛋白家族成员/亚型或不相关的蛋白质有交叉反应。
所有泳道:1/1000 稀释度的Cdk6号机组抗体 (约54576)泳道1:野生型 HAP1型细胞裂解液泳道2:Cdk6号机组基因敲除 HAP1型细胞裂解液
预测条带大小:37千帕观测条带大小:37千帕
内参对照品(红色条带):1/1000 稀释度的β 肌动蛋白抗体 (ab8227)
二抗:红外染料 800山羊抗小鼠 IgG(H+L)红外染料 680山羊抗兔 IgG(H+L)均为 1/10,000 稀释度
非特异性抗体–KO公司样本中的弱信号
图三:Akt1 RabMAb公司®产品 (ab32038)击倒对手样本中存在正确 兆瓦的预期条带,但强度低于 重量样本。然而,该抗体可能与样本中分子量与目标蛋白相同的其他蛋白家族成员/亚型有交叉反应。
所有泳道:1/1000 稀释度的Akt1公司兔单克隆抗体 (约32038)
泳道1:野生型 HAP1型细胞裂解液泳道2:Akt1公司基因敲除 HAP1型细胞裂解液
预测条带大小:55千帕观测条带大小:55-60千帕
内参对照品(红色条带):1/1000 稀释度的β 肌动蛋白抗体 (ab8226)
非特异性抗体–KO公司样本中的信号
图4:Akt1公司兔多克隆产品 (ab91505)击倒对手样本中仍存在预期的 兆瓦带,强度与 重量样本相同。使用基准抗体会在 重量中显示目标条带,而在 击倒对手样本中无条带。
所有泳道:Akt1公司兔多克隆抗体 (ab91505),1:1000泳道1:野生型 HAP1型细胞裂解液泳道2:Akt1公司基因敲除 HAP1型细胞裂解液
内参对照品(红色条带):1/1000 稀释度的β 肌动蛋白抗体 (ab8226)
非特异性抗体-KO公司和重量样本中均无目标条带
当看到 击倒对手验证标记时,您可以相信该抗体不仅在推荐的应用和种属中得到了验证,而且其特异性也已经通过我们内部 的击倒对手验证方法得到了确认。
查看我们的击倒对手验证抗体的完整列表。
我们应用 CRISPR-Cas9公司技术开发了广泛的 击倒对手细胞系和裂解液,从而为您提供可靠的抗体,节省您的时间和金钱。每个 击倒对手细胞系都是单独克隆并通过 桑格测序验证的,同时内附亲代 重量对照裂解液,用于在一致的细胞背景下评估基因敲除的生物学影响。
查看我们的基因敲除细胞裂解液的完整列表。
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