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抗体是生命科学和临床研究中最常用的工具之一,用于研究各种生物学通路和疾病中的蛋白质及其功能。
好的抗体具有靶标特异性和灵敏度,即使在低表达水平下也能识别目的蛋白。但是,越来越多的研究表明,并非所有抗体都具有靶标特异性,也有许多抗体表现出与脱靶蛋白的交叉反应性。从而导致实验不可重复性这一公认问题。1这些非特异性抗体会导致资源浪费,并妨碍科学进步。2,3
解决方案:敲除验证
接受度最广且最受信任的抗体特异性验证过程之一是基因敲除 (韩国)验证。4让开验证是一项非常稳健的技术,可在不表达目的蛋白的 让开细胞系或组织中通过检测目的抗体来确证其特异性。
在 让开细胞系中测试特异性抗体时,特异性抗体不会产生信号,但在野生型 (重量)细胞系测试特异性抗体时,特异性抗体会产生特异性靶蛋白信号。以这种方式,让开验证作为真正的阴性对照,以确认抗体对目标蛋白的特异性。4,5个
阿布卡姆使用广泛的人 让开单倍体细胞系库来进行抗体验证。这些 让开细胞系通过 CRISPR-Cas9生成,并通过 桑格测序鉴定。这种类型的 让开细胞系提供了来自单个等位基因 让开的完全丧失功能的表型,并消除了在二倍体细胞模型中观察到的来自第二个等位基因对敲除的任何掩盖。6-8个
当 让开验证我们的抗体时,我们主要使用 免疫印迹来评估结果。让开验证可产生一系列 免疫印迹结果,以下示例给出了我们处理这些结果的方式。
特异性抗体
图1号文件: Cdk4拉巴单抗®产品 (ab108357)让开样本中正确分子量 (兆瓦)的预期条带消失。
所有泳道:千分之一稀释度的川地K4兔单克隆抗体 [EPR4513](ab108357)
泳道1: 在野生型 第一章细胞裂解液泳道第二章:川地K4基因敲除 第一章细胞裂解液
预测条带大小:34千伏安观测条带大小:34千伏安内参对照品(红色条带):千分之一稀释度的β 肌动蛋白抗体 (ab8226)
二抗:红外染料 800山羊抗兔 免疫球蛋白(H+L)红外染料 680山羊抗小鼠 免疫球蛋白(H+L)均为 万分之一稀释度
部分特异性抗体-额外条带
图第二章:川地K6小鼠单克隆产品 (ab54576)让开样本中正确兆瓦的预期条带消失;因此,抗体可识别其预期靶标。然而,在 重量和 让开样本中也存在额外条带。这可能是由于抗体与其他蛋白家族成员/亚型或不相关的蛋白质有交叉反应。
所有泳道:千分之一稀释度的川地K6抗体 (ab54576)泳道1号文件:野生型 第一章细胞裂解液泳道第二章:川地K6基因敲除 第一章细胞裂解液
预测条带大小:37千伏安观测条带大小:37千伏安
内参对照品(红色条带):千分之一稀释度的β 肌动蛋白抗体 (ab8227)
二抗:红外染料 800山羊抗小鼠 免疫球蛋白(H+L)红外染料 680山羊抗兔 免疫球蛋白(H+L)均为 万分之一稀释度
非特异性抗体–KO公司样本中的弱信号
图三:Akt1拉巴单抗®产品 (ab32038)让开样本中存在正确 兆瓦的预期条带,但强度低于 重量样本。然而,该抗体可能与样本中分子量与目标蛋白相同的其他蛋白家族成员/亚型有交叉反应。
所有泳道:千分之一稀释度的Akt1型兔单克隆抗体 (ab32038)
泳道1号文件:野生型 第一章细胞裂解液泳道第二章:Akt1型基因敲除 第一章细胞裂解液
预测条带大小:55千伏安观测条带大小:55-60千伏安
内参对照品(红色条带):1/1000稀释度的β 肌动蛋白抗体 (ab8226)
非特异性抗体–KO公司样本中的信号
图第四章:Akt1型兔多克隆产品 (ab91505)让开样本中仍存在预期的 兆瓦带,强度与 重量样本相同。使用基准抗体会在 重量中显示目标条带,而在 让开样本中无条带。
所有泳道:Akt1型兔多克隆抗体 (ab91505),1:1000泳道1号文件:野生型 第一章细胞裂解液泳道第二章:Akt1型基因敲除 第一章细胞裂解液
内参对照品(红色条带):1/1000稀释度的β 肌动蛋白抗体 (ab8226)
非特异性抗体-KO公司和重量样本中均无目标条带
当看到 让开验证标记时,您可以相信该抗体不仅在推荐的应用和种属中得到了验证,而且其特异性也已经通过我们内部 的让开验证方法得到了确认。
查看我们的击倒对手验证抗体的完整列表。
我们应用 CRISPR-Cas9技术开发了广泛的 让开细胞系和裂解液,从而为您提供可靠的抗体,节省您的时间和金钱。每个 让开细胞系都是单独克隆并通过 桑格测序验证的,同时内附亲代 重量对照裂解液,用于在一致的细胞背景下评估基因敲除的生物学影响。
查看我们的基因敲除细胞裂解液的完整列表。
查看我们的基因敲除细胞系的完整列表。