A haploid genetic screen identifies the major facilitator domain containing 2A (MFSD2A) transporter as a key mediator in the response to tunicamycin

doi:10.1073/pnas.1018098108

.2011年7月19日；108(29):11756-65.

doi:10.1073/pnas.1018098108。 Epub 2011年6月15日。

单倍体遗传筛查确定了包含2A（MFSD2A）转运蛋白的主要促化域是对衣霉素反应的关键介体

简·H·雷林¹, 克莱莉·克莱什, Jan E光标, 马利尼·瓦拉达拉扬, Thijn R Brummelkamp公司, 大卫·M·萨巴蒂尼

附属公司

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内政部： 10.1073/pnas.1018098108

单倍体遗传筛选确定含有主要促进结构域2A（MFSD2A）转运蛋白是对膜霉素反应的关键介质

简·H·瑞林等。美国国家科学院程序. 2011.

.2011年7月19日；108(29):11756-65.

doi:10.1073/pnas.1018098108。 Epub 2011年6月15日。

作者

简·H·瑞林¹, 克莱莉·克莱什, Jan E光标, 马利尼·瓦拉达拉扬, Thijn R Brummelkamp公司, 大卫·M·萨巴蒂尼

附属

¹怀特海生物医学研究所，美国马萨诸塞州剑桥02142。

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摘要

衣霉素（TM）抑制真核生物天冬酰胺连接的糖基化、蛋白棕榈酰化、神经节苷脂生成、蛋白聚糖合成、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶-A还原酶活性和细菌细胞壁生物合成。用TM处理细胞会引起内质网应激并激活未折叠的蛋白质反应。虽然在实验室环境中广泛使用了多年，但尚不清楚TM是如何进入细胞的。在这里，我们在一个无偏见的基因筛查中确定了一个主要促进因子超家族的转运体，即含有2A（MFSD2A）的主要促进因子域，作为TM毒性的关键介体。不含MFSD2A的细胞是TM-耐药细胞，而MFSD2A-过度表达的细胞是超敏细胞。超敏反应与细胞TM摄取增加相关，同时内质网应激反应增强。此外，MFSD2A突变分析揭示了C末端在正确的细胞内定位和蛋白质稳定性方面的重要功能，并确定了调节TM敏感性所必需的跨膜螺旋氨基酸残基。总的来说，我们的数据揭示了MFSD2A在质膜上作为假定的TM转运蛋白发挥的关键作用。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
不含MFSD2A的细胞对TM具有耐药性(A类)TM的结构是同源核苷酸糖类似物的混合物，其脂肪酰基链的长度（13-17个碳原子）、分支和不饱和度不同(n个= 8–11). 为了简单起见，只显示了一种TM异构体类型。(B类)单倍体KBM7细胞系中TM-resistance筛选的概述。文本中给出了详细信息。(C类)基因组位点*MFSD2A型*和屏幕中的GT插入（三角形）。白框表示5′和3′非翻译区，黑框表示编码外显子。箭头指示用于半定量RT-PCR分析的引物1和2的引物结合位点（也在D类). f、正向引物；r、反向引物。(D类)MFSD2A_GT1、MFSD2A_2GT2和WT KBM7细胞的RT-PCR分析显示没有残留*MFSD2A型*使用两种不同的*MFSD2A型*引物对。(E类)MFSD2A GT1型(**P（P）*< 3 × 10⁻⁹)和MFSD2A GT2(***P（P）*< 2 × 10⁻⁶)与WT KBM7细胞相比，细胞对TM的抵抗力显著增强（Student双尾细胞的wt1和wt2生存率相结合t吨测试）。慢病毒引入Flag-tagedMFSD2A型在MFSD2A GT KBM7细胞中构建cDNA可恢复与WT细胞相当的TM敏感性表型(****P（P）*< 1.4 × 10⁻⁶; MFSD2A GT2与MFSD2A-GT2+标记-MFSD2A之间的比较）。将KBM7细胞接种到96 well板中，并在500 ng/mL TM存在或不存在的情况下生长40 h。通过比较经TM处理的孔和未经处理的孔，使用CellTiter-Glo（CTG）分析测定细胞活力(*材料和方法*). RLU，相对发光单位。(F类)MFSD2A_GT2或WT KBM7细胞在有或无500 ng/mL TM的96 well平板中生长5 d，并用CTG法测定细胞存活率。MFSD2A GT2细胞显示出高度显著的TM抗性增强(*P（P）*< 10⁻⁸). 通过将处理细胞的平均值除以未处理的对照值来计算存活率。条形图显示每种情况下11口井的存活率平均值±SD。(*G公司*)在细胞裂解前用内质网应激诱导试剂处理8 h的两个独立WT和MFSD2A GT KBM7系的Western blot分析。用针对不同内质网应激标记物的抗体免疫印迹法评估UPR信号。BFA处理的样品在与剩余裂解物分离的凝胶上运行。(小时)将WT和MFSD2A GT1 KBM7细胞标记15分钟³⁵S蛋氨酸，在存在或不存在TM的情况下追赶指定的时间点，并在IP前用指定抗体在1%SDS中溶解。HC+CHO，糖基化的I类MHC重链；HC−CHO，脱糖I类MHC重链。

**图2。**
MFSD2A糖基化和MFSD2A-过度表达的影响。(A类)在细胞裂解之前，在存在或不存在TM的情况下，将慢病毒感染产生的过度表达指示蛋白的稳定A549细胞培养24小时。蛋白质经Flag亲和纯化，免疫沉淀物经SDS/PAGE和Western blotting分析。(B类)免疫纯化的MFSD2A经PNGase F消化，SDS/PAGE和抗Flag抗体免疫印迹分析。(C类)稳定表达Flag-MFSD2A和Flag-MFSD2AΔN-糖蛋白的A549细胞用1μg/mL TM处理24小时或不处理。在细胞裂解后，如前所述，对纯化的MFSD2A或MFSD2A-ΔN-glcyo进行Western blot分析。(D类)中提到的稳定A549过表达株系A类用TM或thapsigargin治疗20小时。用免疫印迹法分析裂解产物，并用指示的抗体进行探测。(E类)中描述的相同过表达线A类和D类长期接触TM。Flag-MFSD2A过表达细胞对TM过敏[**P（P）*<0.001，对于1 ng/mL TM和*P（P）*< 1.5 × 10⁻⁶（学生双尾t吨测试）对于其余较高的TM浓度；合并对照组进行统计分析]。将稳定的A549细胞接种到六孔板中（每种情况下三个孔）；细胞接种后24小时，用含有所示TM浓度的新鲜DMEM替换培养基，用自动库尔特计数器额外计算3 d±TM后的细胞数。生存率是通过用TM处理的存活细胞数除以相同基因型的未处理样品的细胞数来计算的。(F类)将稳定表达所示蛋白的PANC1细胞用TM或thapsigargin处理30 h，并用显示抗体的免疫印迹法分析裂解产物。(*G公司*)稳定表达Flag-MFSD2A的A549细胞的TM剂量反应分析(左侧)或Flag-γ-管蛋白(赖特; 对照组），并用TM处理29小时。GRP78印迹以上的值表示相对于猛禽水平的标准化GRP78表达。使用奥德赛红外成像系统（LI-COR）同时处理和扫描印迹。使用Odyssey应用软件，通过将每个GRP78蛋白带的定义矩形区域的像素强度除以猛禽对照的相应测量值，对GRP78表达进行量化。

**图3。**
MFSD2A突变体的MFSD2A-定位和过度表达效应。(A类)瞬时转染HEK293T的IF共焦显微镜(顶部)，稳定的HeLa(中部)，或稳定的PANC1细胞(下部)，全部表达EGFP-MFSD2A，揭示了MFSD2A在质膜上的定位。分别用磷脂和Hoechst对肌动蛋白细胞骨架和细胞核进行可视化。(B类)SDS/PAGE，然后对来自稳定A549细胞的标记免疫富集MFSD2A突变体和控制蛋白进行Western blot分析。(C类)通过慢病毒感染MFSD2A C末端缺失突变体或ER靶向的MFSD2A-型（MFSD2AKKRQ），建立稳定的多克隆A549细胞系E类)并测试其调节TM敏感性的能力。与WT MFSD2A相比，与10 ng/mL TM治疗联合使用时，所有C末端MFSD2A-突变体结构诱导凋亡的能力显著降低(**P（P）*< 0.02;*P（P）*其余C末端突变体的值也都很显著；即。，*P（P）*< 0.01). 细胞在含有10或50 ng/mL TM的培养基中培养3天。条形图和误差条形图表示三个孔的平均±SD。(D类)中所述稳定系细胞提取物的免疫印迹分析B类和C类用TM或载体处理30小时。(E类)稳定表达Flag-MFSD2AKKRQ的A549细胞Flag和Actin的IF染色(左侧). 用针对Flag表位的抗体对MFSD2A进行可视化。MFSD2AKKRQ与ER标记Calnexin的共染显示重叠的染色模式(赖特).

**图4。**
过度表达MFSD2A的细胞中TM积累增加。500 ng/mL TM处理0.5(A类), 1 (B类)，或3小时(C类)与对照组相比，在稳定的A549 Flag-MFSD2A过表达细胞中，TM的积累显著增强且具有时间依赖性(*P（P）*<0.03，对于所有TM物种和使用学生双尾图显示的时间点t吨测试）。A和B TM物种命名法是指Tsvetanova等人（1）建议的几何或位置异构体。通过MS分析裂解产物的总TM含量（详情见*材料和方法*). 数值为标准化平均浓度±SD(n个= 3).

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敲开突尼斯霉素入口的门。
Bassik MC，Kampmann M。 Bassik MC等人。美国国家科学院院刊2011年7月19日；108(29):11731-2. doi:10.1073/pnas.1109035108。Epub 2011年7月6日。美国国家科学院院刊2011。采购管理信息：21734150 免费PMC文章。没有可用的摘要。

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