A reversible gene trap collection empowers haploid genetics in human cells

doi:10.1038/nmeth.2609

.2013年10月；10(10):965-71.

doi:10.1038/nmeth.2609。 Epub 2013年8月25日。

可逆基因陷阱收集增强人类细胞单倍体遗传学

蒂尔曼·比尔克斯特·默尔（Tilmann Bürckstümmer）¹, 卡琳娜·班宁, 菲利普·海因策, 理查德·肖贝伯格（Richard Schobesberger）, 克劳迪娅·克岑多夫, 弗洛里安·保勒, 多丽丝·陈, Nicole他们, Fiorella Schischlik公司, 曼努埃尔·雷布萨曼, 米查尔·斯米达, 费兰·费斯·德拉克鲁斯, 安娜·拉帕（Ana Lapao）, 梅丽莎·李斯特, 本杰明·艾辛格, Philipp M Guenzl先生, 文森特·布洛曼, 托马斯·科诺普卡, 比安卡·加普, 卡加寄生虫, 芭芭拉·梅尔, 约翰内斯·施特克尔, 沃尔夫冈·费希尔, 塞伊拉·萨利奇, M Rita Taba卡萨里, 西尔维娅·纳普, 凯琳·本内特, 克里斯托夫·博克, 雅克·科林奇, 罗伯特·克拉洛维奇, 古斯塔夫·阿莫勒, 乔治·卡萨里, Thijn R Brummelkamp公司, 朱利奥·Superti-Furga, 塞巴斯蒂安·M·B·奈曼

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可逆基因陷阱收集增强人类细胞单倍体遗传学

蒂尔曼·比尔克斯特·默尔（Tilmann Bürckstümmer）等人。 Nat方法. 2013年10月.

.2013年10月；10(10):965-71.

doi:10.1038/nmeth.2609。 Epub 2013年8月25日。

作者

蒂尔曼·比尔克斯特·默尔（Tilmann Bürckstümmer）¹, 卡琳娜·班宁, 菲利普·海因策, 理查德·肖贝伯格（Richard Schobesberger）, 克劳迪娅·克岑多夫, 弗洛里安·保勒, 多丽丝·陈, 妮可他们, Fiorella Schischlik公司, 曼努埃尔·雷布萨曼, 米查尔·斯米达, 费兰·费斯·德拉克鲁斯, 安娜·拉波, 梅丽莎·李斯特, 本杰明·艾辛格, 菲利普·M·根策尔, 文森特·布洛曼, 托马斯·科诺普卡, 比安卡·加普, 卡加寄生虫, 芭芭拉·梅尔, 约翰内斯·施特克尔, 沃尔夫冈·费希尔, 塞伊拉·萨利奇, M Rita Taba卡萨里, 西尔维娅·纳普, 凯琳·本内特, 克里斯托夫·博克, 雅克·科林奇, 罗伯特·克拉洛维奇, 古斯塔夫·阿莫勒, 乔治·卡萨里, Thijn R Brummelkamp公司, 朱利奥·Superti-Furga, 塞巴斯蒂安·M·B·奈曼

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摘要

敲除收集是研究模型生物（如酵母）的宝贵工具。然而，目前还没有大规模的人类细胞敲除收集。利用近单倍体人类细胞中的基因陷阱诱变，我们建立了一个平台来生成和分离单个“基因陷阱细胞”，并用它来制备携带单个基因陷阱插入的人类细胞系集合。在大多数情况下，插入可以反转。这个不断增长的文库包含3396个基因，占表达基因组的三分之一，是DNA条形码，可以对多种细胞表型进行系统筛选。我们检测了细胞对TNF-α、TGF-β、IFN-γ和TNF-相关凋亡诱导配体（TRAIL）的反应，以说明这一独特的人类等基因细胞系集合的价值。

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利益冲突声明

竞争性金融利益

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数字

**图1。KBM7细胞的基因组和蛋白质组特征。**
(一)通过碘化丙啶染色和FACS分析单倍体和二倍体KBM7细胞的细胞分裂素Giemsa染色和DNA含量。比例尺，20μm。(b条)KBM7细胞的圆形图。从外到内圈显示带有细胞遗传学带和着丝粒的染色体（红色）；纯合子（橙色）和杂合子（紫色）变体，双基因区以绿色突出显示，完全缺失以红色突出显示已知的SNV（在dbSNP构建137、dbSNP建立129、1000 Genomes版本2012年4月、Exome Variant Server 5400或6500中列出）描述为蓝色，“唯一”（未在上述任何数据库中列出）表示为绿色，COSMIC（版本61）表示为黄色，移码为浅蓝色，停止键变体为红色勾号（后两个在同一个圆圈中）。这个*BCR-ABL1型*易位和*SRGAP1公司*-*PPM1H（PPM1H）*反转显示为灰色带状。(**c（c）**)比较mRNAs（百万千碱基读取数，RPKM）和蛋白质（指数修正蛋白质丰度指数，emPAI）表达的散布密度图。皮尔逊相关系数*P（P）*价值(n个= 9,835). (d日)通过蛋白质表达评估选定通路的KEGG通路覆盖率。所有KEGG途径（199条途径）均根据覆盖率进行分类。(电子,**（f）**)mRNA的超染色体分析(电子)和蛋白质(**（f）**)级别。第8染色体上基因的mRNA表达(电子,*P（P）*= 4.5 × 10⁻¹²（Wilcoxon秩和）用于比较所有常染色体(n个=9453），带8号染色体(n个=385））和蛋白质表达(**（f）**,*P（P）*=0.002（Wilcoxon秩和），用于将所有常染色体与8号染色体进行比较）。

**图2。用于生成单倍体“基因标记”细胞的管道。**
(一)逆转录病毒基因捕捉载体示意图。SA，剪接受体；LTR，长端子重复。条形码是使用网关克隆策略引入的。(b条,**c（c）**)克隆生成概述(b条)和条码位置映射(**c（c）**).

**图3。基因标记突变体是可逆的，可以类似于基因敲除。**
(一)高通量测序管道中绘制的所有基因陷阱整合位点的分布。(b条)逆转录病毒基因捕获载体示意图，包括平行*液氧磷*重组位点和品红箭头指示PCR分析的引物位点（顶部）。用逆转录病毒编码和他莫昔芬诱导的Cre重组酶感染克隆4天后的基因组DNA PCR分析。亲代KBM7细胞作为PCR特异性的阴性对照（C）。SA，剪接受体；LTR，长端子重复。(**c（c）**)用基因陷阱阻断p53表达的KBM7细胞进行Western blot，用Cre重组酶治疗和不治疗。亲代KBM7细胞被用作p53表达的对照。(d日)对指定克隆的mRNA进行RT-PCR分析。设计位于整合位点两侧的外显子PCR引物（如右图所示），用于从顶部所示的突变体中扩增cDNA。(电子)所示克隆的Western blot分析。每个抗体识别的抗原显示在右侧。

**图4。突变KBM7细胞的分子图谱建立了基因型-表型关系。**
(一)IκB-α水平的Western blotTNFRSF1A型TNF-α刺激的突变细胞和对照细胞。(b条)转录组分析*TNFRSF1A型*用TNF-α刺激突变细胞和对照细胞6小时（Affymetrix探针集散点图）。折叠变化>2以红色表示(**c（c）**)用CellTiter-Glo测定细胞活力*TNFRSF1A型*突变体(n个=2个生物复制品；两个样品在同一实验中分别处理和测量）和对照细胞(n个=4个生物复制品）用环己酰亚胺处理12小时，含或不含TNF-α。误差棒，s.d(d日)Western blot分析显示的细胞中磷酸化的SMAD2（Ser465和Ser467），用TGF-β刺激或不治疗（−）。(电子)蛋白质印迹*NF1型*磷酸化ERK（pERK）的突变体和对照细胞。细胞隔夜无血清。(**（f）**)磷酸化STAT1（pSTAT1）的蛋白质印迹*JAK2号机组*γ刺激的突变细胞和对照细胞。(克)转录组分析*JAK2号机组*用干扰素-γ刺激突变细胞和对照细胞6小时，如b条. (小时)RIP1、裂解半胱天冬酶3（C3）和微管蛋白的Western blot分析*CASP8公司*用TRAIL刺激突变细胞和对照细胞4小时。箭头表示RIP1断裂。(我)细胞活力*CASP8公司*用TRAIL处理突变细胞和对照细胞16小时。阿霉素作为阳性对照。误差线，s.d(n个=同一试验中3个独立处理的重复）。(j个)通过qRT-PCR测定的mRNA水平*国际单项体育联合会1*控制中或*ARID2公司*用IFN-γ处理突变细胞24小时或不处理。误差线，s.d(n个=3个独立实验）。(k个)FACS直方图猪和*PIGX公司*用抗CD59-PE抗体染色的突变细胞。

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1. Corley-Smith GE、Lim CJ、Brandhorst BP。雄核发育斑马鱼（Danio rerio）遗传学的生产。1996年；142:1265–1276.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Yi M，Hong N，Hong Y.水母鱼单倍体胚胎干细胞的产生。科学。2009;326:430–433.-公共医学
1. Elling U等。单倍体小鼠胚胎干细胞衍生的正向和反向遗传学。细胞干细胞。2011;9:563–574.-项目管理咨询公司-公共医学

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