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.2022年9月；113(9):3085-3096.
doi:10.1111/cas.15469。 Epub 2022年7月7日。

M（M）6去甲基化酶脂肪团和肥胖相关蛋白通过ULK1调节自噬激活调节胃癌顺铂抵抗

张燕 1 2, 凌西高 2, 王文（Wen Wang） 2, 张腾（Teng Zhang） 2, 方一栋 三, 丁文平 1 4
附属公司

M（M）6去甲基化酶脂肪团和肥胖相关蛋白通过ULK1调节自噬激活调节胃癌顺铂抵抗

张燕等人。 癌症科学. 2022年9月.

摘要

耐药性是胃癌治疗失败的重要因素。N个6-甲基腺苷（m6A） 是真核生物中主要的mRNA内部修饰。m的作用6胃癌耐药性的改变尚不清楚。在本研究中，m6甲基化RNA水平显著降低，而m6顺铂耐药（SGC-7901/DDP）胃癌细胞中去甲基化酶脂肪团和肥胖相关蛋白（FTO）明显升高。敲除FTO可在体内外逆转SGC-7901/DDP细胞的顺铂耐药性，这归因于抑制Unc-51样激酶1（ULK1）介导的自噬。从机制上讲，ULK1的表达在FTO-m6A依赖和YTHDF2介导的方式。总之，我们的研究结果表明，FTO/ULK1轴在胃癌顺铂耐药中发挥着关键作用。

关键词：自由贸易区；ULK1；自噬；顺铂耐药；胃癌。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）是胃癌细胞顺铂（DDP）耐药性的潜在靶点。（A） 用0–32.0μM DDP处理SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞，并进行CCK‐8分析以评估24小时后的细胞活力。（B）IC50计算顺铂在SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞中的值。（C） 米6评估GES-1、SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞中总RNA的甲基化水平。通过western blotting测定GES-1、SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞中METTL3、METTL14、FTO和ALKBH5的表达。用慢病毒FTO shRNA转染（F–H）SGC-7901/DDP细胞。用pcDNA3.1‐FTO质粒转染SGC-7901细胞。采用蛋白质印迹法检测FTO的蛋白表达。（I，J）用FTO shRNA和FTO质粒转染SGC‐7901/DDP和SGC‐7901细胞，并通过CCK‐8测定细胞活力。用FTO shRNA和FTO质粒转染（K，L）SGC-7901/DDP和SGC-7901细胞，并在DDP处理24 h后通过CCK-8测定细胞活力。结果显示为平均值±SDn个=3-4个独立实验*第页 < 0.05与SGC‐7901、GES‐1、阴性对照shRNA（shNC）或阴性对照（NC）组相比；# 第页 < 0.05 vs.SGC‐7901组。FTO，pcDNA3.1‐FTO质粒；OD，光密度；shFTO、FTO shRNA
图2
图2
脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）通过促进胃癌细胞的自噬促进顺铂（DDP）抵抗。（A，B）FTO敲除的SGC‐7901/DDP细胞中FTO、P62和LC3B表达的Western blot分析。（C，D）FTO过度表达的SGC‐7901细胞中FTO、P62和LC3B表达的Western blot分析。（E） 转染FTO shRNA和FTO过表达质粒的SGC-7901/DDP和SGC-7901细胞中LC3B puncta的免疫荧光图像。（F） 转染FTO shRNA和FTO过表达质粒的SGC-7901/DDP和SGC-7901细胞中自噬体的透射电镜分析。箭头表示自噬体。用5μM 3-甲基腺嘌呤（3-MA）或10μM氯喹（CQ）处理24小时后，对SGC-7901/DDP细胞中FTO、P62和LC3B表达进行（G，H）Western blot分析h.结果以平均值±SD表示n个=3-4个独立实验*第页 < 0.05 vs.阴性对照组shRNA（shNC）、阴性对照组（NC）或对照组（Con）。FTO，pcDNA3.1‐FTO质粒；shFTO，FTO shRNA
图3
图3
脂肪量减少和肥胖相关蛋白（FTO）减弱Unc‐51样激酶1（ULK1）的表达。（A） 自噬相关基因的mRNA表达(自动液位计5,自动液位计7,ULK1系列，以及BECLIN1公司)通过定量实时PCR在FTO敲除的SGC‐7901/DDP细胞中检测到。（B–D）利用FTO shRNA和FTO过表达质粒对SGC-7901/DDP和SGC-7901细胞中FTO和ULK1表达进行Western blot分析。（E，F）转染ULK1 siRNA后，对SGC-7901/DDP细胞中FTO、ULK1、P-ATG13、P62和LC3B表达进行Western blot分析n个=3-4个独立实验*第页 < 0.05 vs.阴性对照shRNA（shNC）、阴性对照（NC）或阴性对照siRNA（siNC）组。顺铂；FTO，pcDNA3.1‐FTO质粒；shFTO、FTO shRNA；siULK1、ULK1 siRNA
图4
图4
脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）通过靶向N6甲基腺苷（m6A） 依赖方式。（A、B）转染或不转染ULK1 siRNA的FTO过度表达的SGC-7901/DDP细胞中FTO、ULK1、P-ATG13、P62和LCB3蛋白表达的Western blot分析。（D） FTO‐过度表达的SGC‐7901/DDP细胞转染或不转染ULK1 siRNA，并在DDP处理24小时（E）m6通过甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）-定量PCR（qPCR）检测转染shFTO的SGC‐7901/DDP细胞中ULK1 mRNA的水平。（F） 使用FTO Ab进行RIP‐qPCR分析，并在转染FTO质粒的SGC‐7901/DDP细胞中测量ULK1的富集。结果以平均值±SD表示n个=3-4个独立实验*第页 < 0.05 vs.阴性对照（NC）或阴性对照shRNA（shNC）组；# 第页 < 0.05 vs.pcDNA3.1‐FTO质粒（FTO）组。shFTO、FTO shRNA；siULK1、ULK1 siRNA
图5
图5
脂肪量和肥胖相关蛋白（FTO）通过YTHDF2调节Unc‐51样激酶1（ULK1）的表达水平。（A，B）Western blot分析转染YTHDF2 siRNA的SGC‐7901/DDP细胞中YTHDF 2、ULK1和P‐ATG13的表达。（D） 用5μg/ml放线菌素D处理转染YTHDF2 siRNA的SGC‐7901/DDP细胞指定时间。通过定量PCR定量ULK1的mRNA表达。（E，F）对转染或不转染YTHDF2 siRNA的FTO沉默SGC-7901/DDP细胞中FTO、YTHDF 2、ULK1、P‐ATG13、P62和LCB3表达的Western blot分析 h.结果以平均值±SD表示n个=3-4个独立实验*第页 < 0.05 vs.阴性对照siRNA（siNC）或阴性对照（NC）组；# 第页 < 0.05 vs.FTO shRNA（shFTO）组。siYTHDF2，YTHDF2-siRNA
图6
图6
敲除脂肪团和肥胖相关蛋白（FTO）可提高体内耐药胃癌细胞对顺铂（DDP）的敏感性。（A） 将转染FTO shRNA（shFTO）的SGC7901/DDP细胞注射到BALB/c裸鼠的两侧。小鼠每周注射一次5mg/kg i.p.顺铂或PBS。每隔一天测量肿瘤体积。（B） 裸鼠异种移植瘤的代表性照片。（C，D）（C）H&E染色和（D）Ki‐67免疫组织化学染色的代表性图像。（E，F）裸鼠异种移植瘤中FTO、Unc‐51样激酶1（ULK1）、P62和LCB3表达的Western blot分析*第页 < 0.05 vs.PBS+阴性对照shRNA（shNC）组；# 第页 < 0.05 vs.DDP+shNC组
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