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.2020年3月；16(3):548-561.
doi:10.1080/15548627.2019.1632104。 Epub 2019年6月23日。

氨基葡萄糖通过抑制自噬降解和抑制MTORC1信号传导的双重作用促进乙型肝炎病毒复制

永林 1 2, 吴春晨 三, 王雪雨 1, 石柳 4, 赵开涛 三, 特克拉·坎佩尔 1, 余海生 4, 李梦琪 4, 张继明（Jiming Zhang） 5, 陈明州 4, 朱颖（音） 4, 陈新文 三, 蒙吉路 1
附属公司

氨基葡萄糖通过抑制自噬降解和抑制MTORC1信号传导的双重作用促进乙型肝炎病毒复制

永林等。 自噬. 2020年3月.

摘要

氨基葡萄糖（GlcN）是一种广泛用于促进关节健康和有效治疗骨关节炎的膳食补充剂，是一种有效的大分子自噬/自噬激活剂在体外和体内以前的研究表明，乙型肝炎病毒（HBV）复制和包膜需要自噬。本研究的目的是确定GlcN是否以及如何影响HBV复制，使用在体外和体内实验。我们的数据表明，GlcN治疗显著增加了HBsAg的生成和HBV的复制。共聚焦显微镜和western blot分析显示，GlcN处理后，自噬体数量和自噬标记物MAP1LC3/LC3-II和SQSTM1水平明显升高。GlcN通过其氨基抑制溶酶体酸化，从而强烈阻断HBV病毒粒子和蛋白质的自噬降解。此外，GlcN通过以RRAGA（Ras相关GTP结合A）GTPase依赖方式反馈抑制雷帕霉素激酶复合物1（MTORC1）信号的机制靶点，通过诱导自噬体形成，进一步促进HBV复制。体内在HBV流体动力学注射小鼠模型中，GlcN的应用促进了HBV的复制并阻断了自噬降解。此外，GlcN促进了甲型流感病毒、肠道病毒71和水泡性口炎病毒的复制在体外总之，GlcN通过抑制自噬降解和抑制MTORC1信号传导的双重作用，通过诱导自噬应激有效促进病毒复制。因此，慢性病毒感染患者口服GlcN存在增强病毒复制的潜在风险。缩写：ACTB：肌动蛋白β；ATG：自噬相关；CMIA：化学发光免疫分析；刀豆球蛋白A；CQ：氯喹；组织蛋白酶D；DAPI:4'，6-二氨基-2-苯基吲哚；EV71：肠道病毒71；GalN：半乳糖胺；GFP：绿色荧光蛋白；GlcN：葡萄糖胺；GNPNAT1：葡萄糖胺磷酸N-乙酰转移酶1；HBP：己糖生物合成途径；HBV：乙型肝炎病毒；HBcAg：乙型肝炎核心抗原；HBsAg：乙型肝炎表面抗原；HBeAg：乙型肝炎e抗原；HBV RI：乙型肝炎复制中间产物；IAV：甲型流感病毒；LAMP1：溶酶体相关膜蛋白1；LAMTOR：晚期内体/溶酶体适配器、MAPK和MTOR激活剂；ManN：甘露糖胺；MAP1LC3/LC3：微管相关蛋白1轻链3；MTORC1：雷帕霉素激酶复合物1的机制靶点；PHH：原代人肝细胞；RAB7:RAB7A，RAS癌基因家族成员；RPS6KB1：核糖体蛋白S6激酶B1；RRAGA：Ras相关GTP结合A；逆转录聚合酶链反应；SEM：平均值的标准误差；siRNA：小干扰RNA；SQSTM1/p62：隔离体1；UAP1:UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶1；VSV：水疱性口炎病毒。

关键词：自噬；乙型肝炎病毒；MTORC1信号；氨基葡萄糖；溶酶体酸化。

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数字

图1。
图1。
GlcN促进HBV复制和HBsAg表达。(A类)感染HBV病毒的PHH（感染多重性[MOI]=30）用5 mM GlcN、ManN或GalN处理，48小时后收获。(B类)用5 mM GlcN、ManN或GalN处理HepG2.2.15细胞48小时。用CMIA定量培养上清液中的HBsAg和HBeAg以及细胞裂解液中的细胞内HBsAg。(C类)用不同浓度（1、2、5和10 mM）的GlcN处理后0、24、48或72 h，通过CCK8测定细胞活力。(D–E型)用0、1、2或5 mM GlcN处理HepG2.2.15细胞48小时。(E类)用Southern印迹法检测封装的HBV复制中间产物。用qPCR检测培养上清液中HBV基因组水平。(F类)用northern印迹法分析HepG2.2.15细胞中的HBV RNA水平。S： CO，信号截止比；RC，松弛环状DNA；SS，单链DNA*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ns，不显著。
图2。
图2。
GlcN通过抑制自噬降解促进HBV复制。(A类)用5 mM GlcN和或不加100µM OGT抑制剂PUGNAc或10µM OGA抑制剂OSMI-1处理HepG2.2.15细胞24小时。(B类)用特异性siRNAs转染HepG2.2.15细胞UAP1公司（siUAP1公司)和GNPNAT1/GNA1（siGNPNAT1号机组)或40 nM的siRNA阴性对照（siNC），然后用5 mM GlcN处理48小时。CMIA定量检测培养上清液中分泌的HBsAg和HBeAg以及细胞内的HBsAg。O（运行）-使用ACTB作为负载对照，通过蛋白质印迹分析GlcNAc、UAP1和GNPNAT1的表达。(C类和D类)用5 mM GlcN处理HepG2.2.15细胞48小时。（C） 固定细胞，用一级抗体马抗HBsAg和兔抗LC3孵育，然后分别用Alexa Fluor 488-结合抗兔和Alexa Fuor 594-结合抗马二级抗体IgG染色。最后，通过共聚焦显微镜对细胞进行成像。比例尺：5μm。(D类)通过蛋白质印迹分析LC3、SQSTM1和HBcAg的表达。通过密度测定法测定LC3-II:ACTB比值。(E类)用mCherry-GFP-LC3质粒转染Huh7细胞，然后用5 mM-GlcN处理24 h。用10µM氯喹（CQ）培养24小时的细胞作为阳性对照。共聚焦显微镜检测mCherry和GFP的表达。比例尺：5μm。(F类)HepG2.2.15细胞按(C类)然后用10μg/ml DQ-BSA孵育30分钟。共聚焦显微镜分析DQ-BSA的累积荧光信号。用EBSS处理2小时的细胞作为阳性对照。比例尺：5μm。S： CO，信号截止比*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ns，不显著。
图3。
图3。
GlcN通过抑制溶酶体酸化来抑制自噬降解。(A类)将HBV质粒pSM2转染Huh7细胞，然后用5 mM GlcN处理24 h。用5µM CID1067700（CID）处理24小时的细胞作为阳性对照。将细胞固定，与马抗HBsAg和兔抗LAMP1抗体孵育，分别用Alexa Fluor 488-结合抗兔和Alexa Fuor 594-结合抗马二级抗体IgG染色。通过共焦显微镜观察HBsAg和LC3或LAMP1的染色。比例尺：5μm。(B类)用5 mM GlcN处理HepG2.2.15细胞24小时。细胞用100 nM LysoTracker红或1μM LysoBeacon绿染色1 h。用EBSS处理2小时的细胞作为阳性对照。用共焦显微镜分析LysoTracker红或LysoBeacon绿的荧光强度。比例尺：5μm。(C类)用5 mM GlcN处理HepG2.2.15细胞24小时。细胞用吖啶橙（AO）染色15分钟。AO荧光用488-nm（绿色）或561-nm（红色）激光通过共焦显微镜检测。比例尺：5μm。(D类)用5 mM GlcN处理HepG2.2.15细胞48小时。使用ACTB作为负载对照，通过蛋白质印迹分析成熟CTSD的表达水平。CTSD:ACTB比值通过密度测定进行量化。(E类——G公司)用5 mM GlcN处理HepG2.2.15细胞，加或不加10µM CQ处理24 h。(E类)使用LC3特异性抗体通过共聚焦显微镜对转染的细胞成像。比例尺：5μm。(F类)使用ACTB作为负载对照，通过蛋白质印迹分析LC3、SQSTM1和HBcAg的表达。LC3-II:ACTB比值通过密度测定法进行量化。(G公司)用CMIA分析培养上清中分泌的HBsAg和HBeAg。S： CO，信号截止比*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ns，不显著。
图4。
图4。
GlcN通过其氨基抑制溶酶体降解来促进HBV复制。(A类和B类)用5 mM GlcN或N个-乙酰-d日-葡萄糖胺（Ace-GlcN）分别维持48小时。(C类和D类)用5mM-GlcN或Ace-GlcN治疗HBV病毒感染的PHH（MOI=30）48小时。(A类和C类)使用ACTB作为负荷控制，通过western blotting分析LC3、SQSTM1和HBcAg的表达。LC3-II:ACTB比值通过密度测定法进行量化。(B类和D类)用CMIA分析培养上清中分泌的HBsAg和HBeAg。S： CO，信号截止比*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ns，不显著。
图5。
图5。
GlcN通过反馈抑制MTOR信号诱导自噬来促进HBV复制。(A类)用5 mM GlcN处理HepG2.2.15细胞，并在处理后0、6、12、24和48 h收获。Western blot分析检测MTOR、p-MTOR、LC3和SQSTM1的表达，以ACTB作为负荷对照。通过密度测定法量化LC3-II:ACTB和p-MTOR:ACTB比值。(B类和C类)用5 mM GlcN和或不加2µM MTOR活化剂MHY1485（MHY）处理HepG2.2.15细胞48小时。(B类)固定细胞，用兔抗LC3抗体孵育，然后用Alexa Fluor 488-共轭抗兔二级抗体IgG染色。最后，通过共焦显微镜对细胞成像。比例尺：5μm。(C类)用CMIA分析培养上清液中分泌的HBsAg和HBeAg以及细胞裂解液中的细胞内HBsAg。(D类——E类)用特异性siRNAs转染HepG2.2.15细胞拉加（RRAGA）（si拉加（RRAGA）)或在40nM下的siNC。24小时后，用5 mM GlcN处理转染细胞48小时。(D类)通过western blotting分析RRAGA、MTOR、p-MTOR、LC3和SQSTM1的表达。如上所述对LC3-II:ACTB和p-MTOR:ACTB的比率进行定量。(E类)如上所述，分析培养上清液中分泌的HBsAg和HBeAg以及细胞裂解液中的细胞内HBsAg。S： CO、信号截止比*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ns，不显著。(F类)GlcN如何通过抑制自噬降解和抑制MTORC1信号通路的双重作用诱导自噬应激，从而有效促进病毒复制的拟议模型。一方面，GlcN通过其氨基抑制溶酶体酸化来阻止自噬降解。另一方面，GlcN通过反馈抑制MTORC1信号以RRAGA GTPase依赖的方式进一步诱导自噬体的形成。
图6。
图6。
氨基葡萄糖在HBV HI小鼠模型中促进HBV复制。(A类)C57BL/6小鼠接受带有10µg质粒pAAV-HBV1.2的HI。HI后14天，通过腹腔注射PBS或50 mg/kg/d GlcN治疗小鼠3周。在GlcN治疗后0、1、2和3周收集小鼠血清样本。(B类)在指定的时间点检测HBV感染的血清标志物HBsAg和HBV DNA。血清HBsAg采用CMIA分析。HBsAg阳性定义为≥1*。(C类)血清HBV DNA用qPCR定量。(D类——F类)在GlcN治疗后第21天收集肝组织。每组的两个样品分别标有指示的数字，并用于进一步的实验。(D类)肝组织切片用抗HBc抗体染色（放大200倍）。对HBcAg阳性肝细胞进行计数。(E类)提取HBV复制中间产物并通过Southern印迹检测。用qPCR检测小鼠肝脏中的HBV DNA水平。(F类)以ACTB作为负荷对照，进行Western blot分析检测MTOR、LC3和SQSTM1蛋白。LC3-II:ACTB比值通过密度测定法进行量化*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ns，不显著。
图7。
图7。
GlcN增强了IAV、EV71和VSV复制在体外. (A类——C类)用10、1或1 mM GlcN处理MDCK、RD和Huh7细胞，并在处理后24小时收获。使用ACTB作为负荷对照，通过western blotting检测LC3和SQSTM1的水平。LC3-II:ACTB比率通过密度测定法进行定量。(D类)MDCK细胞感染IAV（H3N2；MOI=0.1）并用10 mM GlcN处理24 h。IAV的mRNA水平NP公司通过RT-qPCR对基因进行定量。(E类)RD细胞感染EV71（MOI=1），并在收获细胞之前用1 mM GlcN处理12 h。用EV71 VP1特异性引物通过RT-qPCR测定EV71 RNA水平。(F类)用VSV感染Huh7细胞（MOI=1），并用1 mM GlcN处理24 h。采集培养基，用VSV特异性引物RT-qPCR检测病毒载量*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ns，不显著。IAV、甲型流感病毒；EV71、肠道病毒71；水疱性口炎病毒。
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MeSH术语

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赠款和资金

这项工作得到了德国Forschungsgemeinschaft（RTG1949/2和Transregion TRR60）的资助；Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG）[Transregion TRR60]；德国Forschungsgemeinschaft（DFG）[RTG1949/2]。