跳到主页面内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2017年4月3日；13(4):739-753.
doi:10.1080/15548627.2017.1280220。 Epub 2017年1月27日。

狂犬病病毒磷酸蛋白结合诱导BECN1依赖的CASP2不完全自噬

刘娟（Juan Liu） 1, 王海龙 1, 顾金燕 2, 邓廷娟 1, 庄川元 1, 胡伯力 2, 徐云斌 1, 燕燕 1 三, 杰赞 1, 廖敏（音） 1 三, 艾琳·迪卡普里奥 4, 李建荣 4, 朔素 2, 周继勇 1 三
附属公司

狂犬病病毒磷酸蛋白结合诱导BECN1依赖的CASP2不完全自噬

刘娟（Juan Liu）等。 自噬. .

摘要

自噬是宿主免疫的重要组成部分，病毒利用自噬生存。然而，与病毒复制有关的自噬信号通路却鲜有报道。在这里，我们观察到狂犬病病毒（RABV）感染触发了细胞内自噬体的积累，并通过抑制自噬通量导致不完全自噬。随后，我们发现RABV感染诱导了CASP2/胱天蛋白酶2的减少以及AMP活化蛋白激酶（AMPK）-AKT-MTOR（雷帕霉素的机制靶点）和AMPK-MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）途径的激活。进一步研究表明，BECN1/Beclin 1与病毒磷酸蛋白（P）结合，通过降低CASP2激活CASP2-AMPK-AKT-MTOR和CASP2-AMPK-MAPK通路，诱导不完全自噬。综上所述，我们的数据首次揭示了RABV感染导致BECN1和CASP2依赖性自噬途径的串扰。

关键词：BECN1；CASP2依赖途径；RABV；自噬；病毒蛋白P。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
RABV感染诱导小鼠N2a细胞和大脑中的自噬体积累。（A） 转染GFP-LC3B的N2a细胞12 h，然后感染MOI=2的RABV Flury株36 h和48 h。固定细胞，用小鼠抗N单克隆抗体（红色）进行免疫染色，在共焦显微镜下观察自噬体（绿色）。DAPI（蓝色）染色核DNA。比例尺：10μm。（B） 用MOI=2的RABV Flury株感染N2a细胞，或模拟感染4 h、8 h、12 h、24 h、36 h和48 h。（C） 将RABV株Flury以100 TCID的剂量注入3-old-ICR小鼠脑内50或PBS（每只小鼠100μl）用于24 hpi和80 hpi，并分离小鼠的大脑。然后用小鼠抗N mAb、兔抗LC3A/B、抗SQSTM1和抗GAPDH抗体通过蛋白质印迹分析（B）和（C）中的细胞和小脑样品。将SQSTM1、LC3-II和GAPDH的比率归一化为控制条件。误差线：3个独立测试的平均值±SD。双向方差分析*P（P）<0.05**P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001. （D） 通过实时定量PCR对病毒DNA进行定量。定量结果表示为来自RABV感染小鼠大脑的每ml基因组DNA的病毒DNA拷贝数。所有实验均一式三份。
图2。
图2。
在RABV感染的细胞中，自噬体无法与溶酶体融合。将编码GFP-LC3B的质粒转染N2a细胞12小时，然后以MOI=2感染RABV HEP-Flury株24小时。（A） 用溶菌酶追踪红（50 nM）培养细胞15分钟；共聚焦显微镜（白色箭头）观察到GFP-LC3B标记的自噬体（绿色）与LysoTracker红色染色的酸化小泡（红色）共定位。（B） 固定细胞，用溶酶体标记物兔抗LAMP1（红色）和鼠抗N单克隆抗体（蓝色）进行免疫染色，共焦显微镜观察自噬体与溶酶体的融合情况（白色箭头）。比例尺：10μm。（C） 用5.6μM氯喹处理RABV感染N2a细胞24小时，并用小鼠抗N单抗、兔抗LC3A/B、抗SQSTM1抗NBR1和抗GAPDH抗体进行免疫印迹试验。将SQSTM1、NBR1和LC3-II与GAPDH的比率归一化为控制条件。误差线：3个独立测试的平均值±SD。双向方差分析*P（P）<0.05**P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.
图3。
图3。
自噬对RABV复制的影响。（A） N2a细胞在含有1μM、2μM、4μM Rapa的DMEM中预处理2h，然后感染MOI=2的RABV HEP-Flury株，并在含有Rapa的DMAM中培养24h。（B） N2a细胞用1μM的Rapa或EBSS预处理2 h，然后用MOI=2的RABV HEP-Flury株感染1 h，再在含有Rapa或EBSS的DMEM中培养24 h。（C） N2a细胞用5 mM 3-MA或1μM沃特曼蛋白预处理2 h，然后在MOI=2时感染RABV HEP-荧光株，并在没有或有5 mM 3-MA或1µM沃特曼宁的情况下培养24 h。（D） 用非靶向shCtrl和shRNA转染（E）N2a细胞附件5（第页附件5)或Lc3b公司（第页Lc3b公司)感染RABV 12 h，孵育36 h。收集（A）至（E）中的细胞上清液和裂解液用于病毒滴度检测，并使用小鼠抗N单克隆抗体、兔抗LC3A/B和抗GAPDH抗体进行western印迹。用TCID测定N2a细胞中的病毒滴度50化验。将LC3-II或N与GAPDH的比值归一化为对照条件。（F） EBSS或Rapa处理细胞的RABV滴度。（G） 3-MA或沃特曼宁处理的细胞的RABV滴度。（H） sh的RABV滴度附件5或shLc3b公司处理过的细胞。误差条：3次独立测试的平均值±标准差。数据分析采用（A）至（E）的双向方差分析和（F）至（H）的单向方差分析*P（P）<0.05**P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.
图4。
图4。
在RABV感染期间，MTOR和AKT信号通路被激活。（A） N2a细胞在MOI=2时感染RABV HEP-Flury株24小时。（B） 用shRNA靶向转染N2a细胞Akt1公司或Mtor公司24小时后，细胞以MOI=2感染RABV HEP-荧光株36小时。然后采集感染细胞，用小鼠抗N单克隆抗体、兔抗p-MTOR、抗MTOR、抗p-AKT、抗AKT、抗LC3A/B和抗GAPDH抗体进行进一步的western blotting分析。（C） 将p-MTOR:MTOR、p-AKT:AKT和LC3-II:GAPDH的比率归一化为对照条件。（D） 用TCID测定N2a细胞中的病毒滴度50化验。误差线：3个独立测试的平均值±SD。单向方差分析*P（P）<0.05**P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.
图5。
图5。
RABV感染通过激活AMPK-MAPK途径诱导自噬。用siRNA靶向转染（A，B）N2a细胞普尔卡a1或地图124小时后，用MOI=2的RABV HEP-Flury株感染细胞，并进一步孵育36小时。然后用小鼠抗N单克隆抗体、兔抗AKT、抗p-AKT、反p-MTOR、抗MTOR、反p-PRKAA、反-PRKAA、抗p-MAPK1/3、反MAPK1/3，反p-MAPK11、抗MAPK11，抗LC3A/B和抗GAPDH抗体采集感染细胞进行进一步的western blotting分析。（C） 将p-MTOR:MTOR、p-AKT:AKT、p-PRKAA:PRKAA、p-MAPK1/3:MAPK1/3、p-MAPK11:MAPK11和LC3-II:GAPDH的比值归一化为对照条件。误差线：3个独立测试的平均值±SD。单向方差分析*P（P）<0.05**P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.
图6。
图6。
CASP2是RABV介导自噬中AMPK的上游调节因子。用siRNA靶向转染N2a细胞普卡1（A） 或shRNA特异性案例2（B） 持续24小时，然后在MOI=2时用RABV感染细胞，并进一步孵育36小时。然后用小鼠抗N单克隆抗体、兔抗CASP2、抗p-MTOR、抗MTOR、反p-AKT、抗AKT、反p-PRKAA、抗-PRKAA、反CASP3、反CASP8、抗CASP9、抗LC3A/B和抗GAPDH抗体采集感染细胞进行进一步的western blotting分析。（C） 将p-MTOR:MTOR、p-AKT:AKT、p-PRKAA:PRKAA以及CASP2、CASP3、CASP8、CASP9和LC3-II与GAPDH的比率标准化为对照条件。（D） 用TCID测定N2a细胞中的病毒滴度50化验。误差线：3个独立测试的平均值±SD。单向方差分析*P（P）<0.05**P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.
图7。
图7。
RABV N/P抑制CASP2的表达，并足以通过AKT、MTOR、AMPK和MAPK的磷酸化诱导自噬。（A） 用Flag-N或P和GFP-LC3B（绿色）共转染N2a细胞24小时，固定，用小鼠抗Flag抗体（红色）免疫染色，共焦显微镜下观察。DAPI（蓝色）染色核DNA。比例尺：10μm。（B） 将载体Flag-N或P以1或2μg的剂量转染细胞48 h，用小鼠抗Flag单克隆抗体、兔抗LC3A/B、抗SQSTM1和抗GAPDH抗体进行western印迹分析。将SQSTM1和LC3-II与GAPDH的比值标准化为控制条件。（C） 用载体Flag-N/P转染细胞48 h，用小鼠抗Flag单克隆抗体、兔抗P-MTOR、抗-MTOR、抗P-AKT、抗AKT、反CASP2、抗P-PRKAA、抗-PRKAA、反P-MAPK1/3、抗MAPK1/3，抗P-MAPK11、抗MAPK11和抗GAPDH抗体进行western blotting分析。将p-MTOR:MTOR、p-AKT:AKT、p-PRKAA:PRKAA、p-MAPK1/3:MAPK1/3、p-MAPK11:MAPK11和CASP2:GAPDH的比值标准化为对照条件。误差线：3个独立测试的平均值±SD。（B）中的双向方差分析和（C）中的单向方差分析*P（P）<0.05**P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.
图8。
图8。
病毒蛋白P在CASP2介导的信号通路中与BECN1相互作用。（A） 将N2a细胞与Flag-N、GFP-P、RED-BECN1质粒共转染24 h，用共焦显微镜检测BECN1（红色）与病毒蛋白N（蓝色）或P（绿色）共定位。白色箭头表示共定位位点。比例尺：10μm。（B） 将N2a细胞与Flag-P和Myc-BECN1共转染48 h，并使用所示抗体测定P和BECN1之间的相互作用。*表示用于免疫沉淀的抗体的免疫球蛋白重链。WB，western blotting；IP，免疫沉淀。（C） 用Flag-P和siRNA靶向性共同转染N2a细胞贝肯148 h，然后采集小鼠抗P和抗BECN1单克隆抗体、兔抗CASP2、抗P-PRKAA、抗PRKAA，抗LC3A/B、抗SQSTM1和抗GAPDH抗体进行western blotting分析。将p-PRKAA与PRKAA、CASP2、LC3-II和SQSTM1与GAPDH的比值归一化为控制条件。（D） ULK1磷酸化和PIK3C3表达。用MOI=2的RABV Flury株感染N2a细胞或转染Flag-P细胞24h，用小鼠抗Flag抗体、兔抗P-ULK1抗体、抗ULK1、抗PIK3C3抗体和抗GAPDH抗体进行western blotting检测ULK1磷酸化和PIK3C表达。误差线：3个独立测试的平均值±SD。单向方差分析*P（P）<0.05**P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.
图9。
图9。
RABV通过CASP2-AMPK-MAPK1/3/11-AKT1-MTOR途径诱导不完全自噬的模型。RABV编码的P蛋白通过与BECN1结合导致CASP2减少。CASP2减少激活AMPK的磷酸化。磷酸化的AMPK随后激活AKT、MAPK11和MAPK1/3的磷酸化。磷酸化AKT导致MTOR磷酸化。磷酸化的MAPK11、MAPK1/3和MTOR激活自噬体的形成。自噬体吞噬RABV病毒，不将其传递到溶酶体。
请参阅PMC中的此图片和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Esclatine A，Chaumorcel M，Codogno P.巨自噬信号与调控。2009年微生物免疫学最新进展；33533-70; PMID:19802559；http://dx.doi.org/10.1007/978-3-642-00302-8_2-内政部-公共医学
    1. 自噬的分子机制：尚未解答的问题。《细胞科学杂志》2005；118（第1部分）：7-18；PMID:15615779；http://dx.doi.org/10.1242/jcs.01620-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Dreux M，Chisari FV公司。病毒和自噬机制。细胞周期2010；9(7):1295-307; PMID:20305376；http://dx.doi.org/10.4161/cc.9.7.11109-内政部-公共医学
    1. Marino G，Lopez-Otin C.自噬：分子机制、生理功能和人类病理学相关性。细胞分子生命科学2004；61(12):1439-54; PMID:15197469；http://dx.doi.org/10.1007/s00018-004-4012-4-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 莱文B，瑞岛N，维珍HW。免疫和炎症中的自噬。《自然》2011；469(7330):323-35; PMID:21248839；http://dx.doi.org/10.1038/nature09782-内政部-项目管理咨询公司-公共医学