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.2016年3月1日：96:46-58。
doi:10.1016/j.meth.2015.08.024。 Epub 2015年9月1日。

一种基于高内容图像的系统识别抗前体化合物的筛选管道

纳德·库本 1, Kyle R Brimacombe公司 2, 梅根·多尼根 1, 李竹音 2, 汤姆·米斯特利 三
附属公司

一种基于高内容图像的系统识别抗前体化合物的筛选管道

纳德·库本等人。 方法. .

摘要

Hutchinson-Gilford早衰综合征（HGPS）是一种由前体蛋白（核结构蛋白层粘连a的突变形式）的组成性产物引起的早发致命性早衰疾病。前体蛋白的存在导致广泛的形态学改变，表观遗传和DNA损伤相关的核缺陷，最终破坏组织和有机体功能。以HGPS影响途径为重点的假设驱动方法已被用于确定具有抗进展作用的药物靶点。在这里，我们报告了一种无偏见的HGPS发现方法，通过实施基于高通量、高含量成像的筛选方法，该方法能够系统识别小分子，防止多种孕激素诱导的衰老缺陷的形成。通过筛选2816种FDA批准的药物，我们发现维甲酸是一类新型化合物，可逆转HGPS患者皮肤成纤维细胞的老化缺陷。这些发现建立了一种新的抗进展药物发现方法。

关键词：FDA批准的化合物；HGPS；高含量成像；高通量筛选；孕激素；维甲酸。

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利益冲突声明

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
诱导型GFP-孕激素成纤维细胞系统的特征。（A） 含有多西环素诱导的GFP标记的层粘连蛋白A、前体蛋白或前体蛋白C661S突变体的稳定人类皮肤成纤维细胞系的示意图，用于GFP、层粘连素B1、γH2AX和DNA DAPI染色的免疫荧光（IF）检测。（B） DNA DAPI染色的代表性IF图像（插图左下角）和所有三种GFP-层粘连诱导的成纤维细胞系在无强力霉素和有强力霉素的情况下连续4天的GFP信号。比例尺：10μM。（C） 未诱导和4天诱导的GFP层粘连成纤维细胞系的蛋白质印迹和β-肌动蛋白标准化层粘连蛋白水平的定量。数值表示3个实验的平均值±SD。(第页> 0.05). （D） 组蛋白3（H3-K27-3M）、γH2AX和53BP1 HGPS标记物上诱导的GFP-层粘连蛋白水平以及层粘连B1、LAP2、HP1γ、三甲基赖氨酸27的IF信号定量（见第2节）。数值代表3次实验的平均值±SD(N个> 300, *第页GFP-层粘连蛋白A和GFP-前体细胞系之间<0.05）。
图2。
图2。
HGPS缺陷的高含量成像定量。（A） GFP-progrein诱导的成纤维细胞中用于自动检测和量化HGPS缺陷的管道示意图。（B，C，E）基于GFP-progrein诱导的成纤维细胞（4天，1μg/ml多西环素）中DNA DAPI信号的核分割代表性图像，显示DAPI染色（A）、GFP-progerin（B）和层粘连B1 IF染色（D）；比例尺：10μM。（D） GFP-progrein诱导的成纤维细胞中γH2AX病灶的对比分割示例（4天，1μg/ml多西环素）。比例尺：10μM。
图3。
图3。
在GFP前体蛋白诱导的成纤维细胞中高通量筛选FDA批准的化合物库。（A） 筛查分析概述。GFP-前体蛋白诱导的成纤维细胞在多西环素的存在下被镀上，同时用FDA批准的化合物进行处理，这些化合物要么对GFP-后体蛋白的诱导和层粘连B1和γH2AX HGPS老化缺陷的形成没有影响（无影响），要么基于改善这些终点而被视为影响。未经处理、诱导的GFP progerin细胞用作阴性对照，阳性对照是GFP progerin未被诱导或在FTI存在下被诱导的细胞（见第2节）。（B） 所有分析终点的阳性和阴性对照的免疫荧光图像。比例尺：10μM。（C） 面板B的量化（见第2节）。N个> 300; *第页< 0.05. 数值表示3个实验的平均值±SD。（D） 点击从筛选中确定的候选化合物及其所属的相应生物类别。（E）基于1、3、10和29μM浓度对GFP前体蛋白诱导和层粘连B1和γH2AX标记物的影响，筛选出的维甲酸化合物（维甲酸和异维甲酸）的剂量-反应曲线。所有老化标记的阳性和阴性对照水平分别用绿色和红色虚线表示。数值表示3个实验的平均值±SD。
图4。
图4。
在HGPS患者成纤维细胞中验证FDA批准的候选化合物。免疫荧光染色定量分析（见第2节）HGPS患者成纤维细胞中的孕激素、层粘连蛋白B1、LAP2、HP1γ、H3-K273M、γH2AX和53BP1 HGPS标记物，这些细胞用初级筛选中鉴定的候选化合物处理8天。根据初步筛选结果，除多索茶碱（1μM）外，每种化合物使用10μM的剂量。数值表示3个实验的平均值±SD。N个> 300; *第页<0.05，未经治疗的HGPS与复合治疗的HGPS相比。化合物：#1，维甲酸#2、他扎罗汀#3、米力农#4、盐酸曲喹素#5、多索茶碱#6、盐酸异丙肾上腺素#7、盐酸丙卡特罗半水合物#8、硫酸沙丁胺醇#琥珀酸氢化可的松#10，deflazacort#11，曲安奈德#12，氯代苯甲酸盐#13，丁酸间苯二酚#14，戊酸二氟考龙#15、贝塔巴#16，醋酸泼尼松龙#17，二氯乙酸酯#18，瑞美舒龙#19，醋酸氟可的松#20,3,4-二羟基-2-（甲胺基）苯乙酮盐酸盐#21，琥珀酸舒马曲坦#22例，顺铂#23、莫扎瓦普坦#24，2-乙基己基水杨酸盐#25，磺胺乙酰胺#26，氯化苯乙氧基铵#27，阿苯达唑。
图5。
图5。
维甲酸降低HGPS患者成纤维细胞中A型层粘连蛋白的表达并逆转老化缺陷。（A） HGPS患者和野生型成纤维细胞中所示HGPS标记物的代表性免疫荧光图像，用10 lM异维甲酸、三苯丙胺或他扎罗汀治疗。比例尺：10μM。（B） Western blot和量化所有三种维甲酸对HGPS患者成纤维细胞中A型层粘连蛋白水平的影响。数值代表3个实验的平均值±标准差*第页与未经治疗的HGPS患者成纤维细胞相比，<0.05。（C） 用10μM异维甲酸或他扎罗汀治疗后，HGPS患者成纤维细胞中GAPDH mRNA表达的层粘连蛋白A、前体蛋白和层粘连素C mRNA水平标准化的表达分析。数值表示3个实验的平均值±SD*第页与未治疗的HGPS患者成纤维细胞相比，治疗组<0.05。
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