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。2015年3月4:5:8733。
doi:10.1038/srep08733。

间充质干细胞通过p38和ERK-MAPK通路下调环氧合酶-2，减轻COPD患者的气道炎症和肺气肿

文谷 1, 林松 1, 李小明 1, 狄王 1, 郭学军 1, 魏国旭 1
附属公司

间充质干细胞通过p38和ERK-MAPK通路下调环氧合酶-2，减轻COPD患者的气道炎症和肺气肿

文谷等。 科学代表。 。

摘要

骨髓间充质干细胞（MSCs）已被确定为治疗慢性阻塞性肺疾病（COPD）的一种可能策略。我们以前的研究表明，MSC通过旁分泌机制对气道炎症和肺气肿具有治疗潜力。我们认为MSCs通过与巨噬细胞的相互作用逆转炎症过程并恢复受损的肺功能。在我们的研究中，将大鼠暴露于香烟烟雾（CS）中，然后将MSCs注入肺部5周。在这里，我们表明MSC的给药通过下调环氧合酶-2（COX-2）和COX-2介导的前列腺素E2（PGE2）的生成，可能通过对肺泡巨噬细胞的影响，减轻了气道炎症和肺气肿。体外共培养实验证明，MSCs通过抑制p38 MAPK和ERK活化相关磷酸化下调巨噬细胞COX-2/PGE2。我们的数据表明，MSCs可能通过抑制肺泡巨噬细胞中COX-2/PGE2，减轻CS暴露大鼠模型的气道炎症和肺气肿，部分由p38 MAPK和ERK途径介导。本研究除了其旁分泌机制外，还为MSC治疗COPD提供了一种引人注目的机制。

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数字

图1
图1。MSC给药降低了肺组织中升高的COX-2和PGE2。
（A） 。免疫组化法检测肺组织COX-2水平。与Sham组相比，CS组COX-2蛋白显著增加，该蛋白定位于支气管上皮和肺泡腔。与CS组相比，CS+MSCs组COX-2表达降低（n=5，每组，×100倍放大）。（B） ●●●●。将肺组织刮成匀浆，并通过western blotting分析COX-2的表达。CS组COX-2表达增加，MSC给药后降低。（凝胶在相同的实验条件下运行，全长印迹如补充图S4所示。）（C）。实时PCR分析COX-2 mRNA水平，CS组与Sham组相比COX-2的mRNA显著增加。MSC给药后COX-2 mRNA下降。（D） ●●●●。收集肺匀浆并使用高度特异的酶免疫分析技术分析PGE2水平。CS组PGE2水平升高，CS+MSCs组降低。数据表示CS组和CS+MSCs组之间的平均值±SEM，n=5，**显著差异（P<0.01），*显著差异（P<0.05）。
图2
图2。肺组织中COX-2和CD68表达和定位的免疫组织化学分析。
制备肺切片，用免疫荧光显微镜评估COX-2（绿色）和CD68（红色）的表达和亚细胞定位。DAPI染色细胞核（蓝色）也显示出来。图像显示了四个独立实验之一的代表性数据。与Sham组（b，c）或Sham+MSCs组（f，g）相比，CS组（j，k）的COX-2和CD68表达增加。COX-2免疫反应主要定位于CD68阳性巨噬细胞（l）。MSC给药后，COX-2表达显著下降，CD68表达中度下降（n=5，×100放大）。
图3
图3。CD68阳性细胞和CD68的百分比+白介素-10+BAL中的单元格。
（A–D）。用抗CD68和抗IL-10抗体对BAL分离的细胞进行染色，并用流式细胞仪对10000份细胞进行分析。细胞最初在正向和侧向散射时被选通，以清除碎片，并使用象限点图进行计算。（F） ●●●●。绘制各组CD68阳性细胞的百分比（右下和右上窗口）。与Sham组相比，CS治疗后CD68阳性巨噬细胞的比例显著增加了约30%，并且存在MSCs时CD68阳性细胞数量减少。在CD68阳性人群中，IL-10阳性（CD68+白介素-10+)与CS组相比，CS+MSCs组的细胞数增加了约13%。数据表示单个实验中每组5只大鼠的平均值±SEM，并代表具有类似结果的两个独立实验（n=5）*CS组与CS+MSCs组比较有显著性差异（P<0.05）。
图4
图4。MSC处理降低了CS-诱导的巨噬细胞COX-2表达。
（A） 。采用Transwell分析法分析MSC迁移。在没有巨噬细胞的情况下，MSC迁移最小。然而，与巨噬细胞共同培养的MSCs中细胞迁移显著增加。（B） ●●●●。在最终浓度为5-20%的情况下，将巨噬细胞和MSCs与CSE溶液共培养12 h至48 h，并使用western blot分析检测COX-2的表达。MSC治疗以剂量依赖的方式下调了CS诱导的COX-2表达。此外，10%和20%的CSE显著诱导COX-2，MSC治疗逆转了这一结果。10%和20%CSE组之间没有显著差异。（C） ●●●●。MSC治疗以时间依赖的方式下调CS诱导的COX-2表达。CSE在12小时时诱导COX-2表达，而MSC治疗并没有降低COX-2的表达，这可能是由于孵育时间不足。MSC处理在孵育24小时或48小时后显著降低了CS-诱导的COX-2表达（D）。用MTT法测定巨噬细胞的活力。用10%CSE孵育48小时的细胞达到了最高的细胞活力。数据表示n=5/组的平均值±SEM#与相应的未治疗对照组相比，显著差异（P<0.05）和##显著差异（P<0.01）*与相应的MSCs（−）对应物相比，差异显著（P<0.05）和**显著（P<0.01）。（全长印迹如补充图S5所示。）
图5
图5。MSCs可减弱CS诱导的COX-2、PGE2、IL-6和iNOS的生成，并促进巨噬细胞中IL-10的生成。
（A–D）。巨噬细胞在10%CSE中培养48小时，并进行实时PCR分析。与溶媒对照组相比，CSE显著增加COX-2、IL-6和iNOS mRNA表达，并降低IL-10 mRNA表达。MSC治疗组COX-2、IL-6和iNOS mRNA水平显著降低，而IL-10 mRNA水平略有升高。（E–G）。保留培养上清并进行ELISA。上清液中PGE2和IL-6水平升高，MSC治疗后下降。然而，MSC处理后，上清液中的IL-10蛋白下降，而升高。数据表示CS组和CS+MSCs组之间n=5/组的平均值±SEM，*显著差异（P<0.05），**显著差异（P<0.01）。
图6
图6。MSC处理抑制CS诱导的巨噬细胞p38 MAPK和ERK的磷酸化，但不抑制JNK的磷酸化。
用10%CSE处理巨噬细胞0–40分钟，通过western blot分析评估细胞质提取物中MAPK磷酸化。（A） 。检测巨噬细胞的活化相关磷酸化p38 MAPK和总p38 MAPK。p38 MAPK在20分钟后磷酸化，在30分钟时最大磷酸化以响应CSE刺激；MSC处理抑制了磷酸化。（B） ●●●●。ERK在20分钟后磷酸化，30分钟时磷酸化最高，以响应CSE刺激；MSC处理可抑制磷酸化。（C） ●●●●。JNK在20分钟时被磷酸化，30分钟时磷酸化最高，以响应CSE。然而，MSCs不能抑制JNK的活化相关磷酸化。印迹是至少四个独立实验的代表。数据表示与相应的未治疗对照组相比，平均值±SEM、#显著差异（P<0.05）、#显著差别（P<0.01）*与相应的MSCs（−）对应物相比，差异显著（P<0.05），**差异显著（P<0.01）。（补充图S6中给出了全长印迹。）
图7
图7。抑制P38 MAPK和ERK而非JNK可以阻止MSC介导的对CS诱导的巨噬细胞COX-2表达的影响。
分别用p38 MAPK抑制剂SB203580、ERK抑制剂U0126或JNK抑制剂SP600125处理巨噬细胞，与MSCs培养后通过western blot分析检测COX-2蛋白。（A） 。在巨噬细胞与三种MAPK抑制剂孵育以获得适当的最终浓度后，测量细胞活力。使用浓度高于5μM的SB203580、浓度高于10μM的U0126和浓度高于35μM的SP600125显著降低细胞活力。（B） ●●●●。单用三种MAPK抑制剂处理巨噬细胞，在COX-2蛋白水平上没有发现显著差异。（C–D）。分别用SB203580（5μM）、U0126（10μM），SP600125（35μM）或DMSO预处理巨噬细胞，并在有或无MSCs的情况下培养。p38 MAPK抑制剂SB203580和ERK抑制剂可降低CS-诱导的COX-2上调，而JNK抑制剂SP600125则不能。MSCs治疗后，SB203580或U0126预处理的巨噬细胞无显著差异。然而，MSC处理降低了用JNK抑制剂SP600125处理的巨噬细胞中COX-2的表达，表明MSC通过p38 MAPK和ERK信号抑制COX-2的表达，但不通过JNK信号抑制。印迹是至少四个独立实验的代表。数据表示平均值±SEM，#与相应的未治疗对照组相比存在显著差异（P<0.05）*与相应的MSCs（−）对应物相比，差异显著（P<0.05）。（补充图S7中显示了全长印迹。）
图8
图8。p38 MAPK激活剂茴香霉素诱导COX-2表达，MSC处理可部分降低COX-2的表达。
（A） 。用不同浓度的茴香霉素处理巨噬细胞，检测细胞活力。巨噬细胞活力在4μM浓度以上显著降低。（B） ●●●●。茴香霉素在0.1-1.0μg/ml浓度范围内增加COX-2的表达，但在1.0μg/ml（C-D）浓度以上保持不变。由于A部分和B部分的实验，选择1.0μg/ml、2.0μg/ml和4.0μg/ml的茴香霉素浓度进行进一步的实验，因为这些浓度不会影响细胞活力以及COX-2水平。MSCs在1.0μg/ml茴香霉素浓度以下显著降低COX-2的表达。然而，随着茴香霉素浓度的增加，抑制作用减弱，这表明有限的MSC治疗不能完全逆转p38 MAPK激活剂的作用。这一发现也证实了间充质干细胞通过p38 MAPK下调COX-2。印迹是至少四个独立实验的代表。数据表示平均值±SEM，*与相应MSCs（−）对应值相比存在显著差异（P<0.05）。（全长印迹如补充图S8所示。）
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