Studying macromolecular complex stoichiometries by peptide-based mass spectrometry

doi:10.1002/pmic.201400466

审查

.2015年3月；15(5-6):862-79.

doi:10.1002/pmic.201400466。 Epub 2015年2月6日。

基于肽基质谱的大分子复合物化学计量研究

英戈·沃尔杰穆斯¹, 克里斯托夫·伦茨, 亨宁·厄劳布（Henning Urlaub）

附属公司

PMID： 25546807
预防性维修识别码： PMC5024058
内政部： 10.1002/pmic.201400466

审查

基于肽基质谱的大分子复合物化学计量研究

英戈·沃尔杰穆斯等。蛋白质组学. 2015年3月.

.2015年3月；15(5-6):862-79.

doi:10.1002/pmic.201400466。 Epub 2015年2月6日。

作者

英戈·沃尔杰穆斯¹, 克里斯托夫·伦茨, 亨宁·厄劳布（Henning Urlaub）

附属

¹德国哥廷根马克斯·普朗克生物物理化学研究所物理生物化学系。

PMID： 25546807
预防性维修识别码： PMC5024058
内政部： 10.1002/pmic.201400466

摘要

大多数细胞功能是由大分子复合物实现的。存在许多生化和光谱方法来表征特别是蛋白质/蛋白质复合物，但缺乏一种通用的方法来测定蛋白质化学计量。基于肽的MS，特别是作为完整蛋白质复合物MS分析的补充方法，现已发展到可以用于常规方式测定蛋白质化学计量的程度。虽然实验需求仍然很大，但基于肽的质谱已成功应用于分析来自不同生物背景的各种蛋白质复合物的化学计量学。在这篇综述中，我们讨论了在这种情况下使用的靶向MS获取策略的要求，特别关注样品制备、蛋白质消化和肽稳定性的相互关联的实验方面。此外，还比较了引入定量肽标准的不同策略及其对不同场景的适用性。

关键词：质谱；蛋白质复合物；SRM；化学计量学；技术。

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数字

图1
不同层的高分子复合物特征。复杂成分（A）包含复杂成分列表。复合化学计量学（B）定义了组分相对丰度，而拷贝数（C）量化了每个复合物的组分绝对数量。复合体拓扑（D）描述了复合体中组成部分的空间设置。复杂动力学（E）表示成分、化学计量和拓扑随时间的变化。

图2
基于MS的化学计量测定工作流程。在基于肽的方法中，分离的核糖体被蛋白质水解。当通过RP色谱分离时，用于归一化内源性肽系数的同位素替代肽。将内源性和AQUA肽喷入三重四极杆质谱仪。第一个四极过滤器具有正确的肽*米/z*同时阻断所有其他肽。通过第一个四极体的肽在碰撞细胞中破碎。所需的片段*米/z*在第三个四极中选择比率。由于三重四极杆质谱仪可以快速改变两个四极杆（跃迁）的设置，因此AQUA肽和内源性肽辅酶的片段可以相互量化。根据这些比率，可以很容易地推断出复杂的化学计量比。对于基于蛋白质的MS，将分离的核糖体喷洒到改良的高质量四极杆TOF（QTOF）光谱仪48中。第一步，测定核糖体的完整质量。然后，核糖体在碰撞细胞中解离，形成不同的核糖体柄复合物。已知总质量和不同核糖体亚复合物的质量，可以提取L12:L10化学计量比。

图3
使用时间进程评估量化准确性。（A）随着时间的推移，追踪缺失的裂解肽有助于评估所选肽的消化完整性。（B）在不稳定肽的情况下，即使在最大值，信号强度也不能反映内源性肽的水平。（C）当慢形成肽和不稳定肽结合时，积分面积比没有时间点反映真正的化学计量比。（D）当检查稳定肽时，添加AQUA肽的时间点确实会影响观察到的化学计量比，这等于真正的化学计量。（E）在消化后添加AQUA肽时，肽和蛋白质环境中具有相同速率的降解反应会降低观察到的化学计量比。当在工作流程的早期添加AQUA肽时，可以评估真实的化学计量。（F）无论添加AQUA肽的时间点如何，速度更快或仅在肽环境中发生的降解反应都会导致错误的化学计量。值得注意的是，由于观察到稳定的化学计量比，消化前或消化后的添加将掩盖这个问题。为了检测这种降解反应，消化后的添加更具指示性。

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