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.2014年12月5日；289(49):34378-88.
doi:10.1074/jbc。M114.611970。 Epub 2014年10月21日。

硒蛋白H通过基因组维持和氧化还原调节抑制细胞衰老

Ryan T Y Wu先生 1, 雷曹 2, 本杰明·P·C·陈 三, 程文兴 4
附属公司

硒蛋白H通过基因组维持和氧化还原调节抑制细胞衰老

Ryan T Y Wu先生等。 生物化学杂志. .

摘要

氧化应激和持续的DNA损伤反应导致细胞衰老，这是一个严重涉及共济失调毛细血管扩张突变（ATM）和p53的退化过程。硒蛋白H（Selnoprotein H，SelH）是一种核硒蛋白，具有氧化还原和反式激活结构域。为了确定SelH在基因组维护中的作用，在人类正常和永生细胞系中使用shRNA敲除。SelH shRNA MRC-5二倍体成纤维细胞在环境O2下表现出明显的衰老特征，包括β-半乳糖苷酶表达、自体荧光、生长抑制和ATM途径激活。在存在ATM激酶抑制剂的情况下，通过p53 shRNA敲除或将细胞维持在3%的O2下，可以减轻这种衰老表型。在5天的恢复过程中，H2O2处理（20μm）对Ser-1981和γH2AX的磷酸化ATM诱导在扰乱的shRNA中消退，但在SelH-shRNA MRC-5细胞中加剧。克隆形成试验的结果表明，SelH shRNA-HeLa细胞对百草枯和H2O2过敏，但对羟基脲、新卡氮平或喜树碱不过敏。虽然H2O2处理诱导了SelH mRNA的表达，但SelH-GFP并没有动员到DNA氧化损伤的部位。SelH-shRNA中的谷胱甘肽水平低于打乱的shRNA-HeLa细胞，并且H2O2诱导的细胞死亡在N-乙酰半胱氨酸（谷胱甘苷前体）的存在下得以挽救。总之，SelH通过涉及ATM和p53的基因组维持途径保护细胞免受氧化应激引起的衰老。

关键词：共济失调；毛细血管扩张；活性氧（ROS）；硒；衰老；第53页。

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数字

图1。
图1。
严重抑制SelH shRNA MRC-5细胞的增殖，提早出现细胞衰老，并增加氧化应激。将SelH shRNA（两个靶向序列）和打乱的shRNA MRC-5人类二倍体成纤维细胞接种（104细胞/孔）置于12孔板上，在20%的培养基中培养36天(A类)或3%O2培养箱(E类) (n个=3），然后在接近汇流时进行细胞计数。B中，通过蔡司AxioObserver 100荧光显微镜的FITC通道评估细胞中的自体荧光(n个= 6).C，第2代细胞与CM-H孵育2DCFDA（5μ米)在37°C下持续15分钟，然后通过荧光显微镜采集FITC信号。相关ROS水平表示为平均值±S.E(n个=6），并显示了代表性图片。D类，细胞在20%或3%的O培养基中培养2培养7天，然后用其各自的平均值±S.E.鉴定SA-β-gal阳性细胞(n个=3）呈现。*，第页与打乱的shRNA细胞相比，<0.05；#,第页<0.05，与3%O相比2.
图2。
图2。
H后SelH shRNA MRC-5细胞持续DNA损伤反应和细胞衰老加剧2O（运行）2治疗。第2代接种在盖玻片上的SelH shRNA和打乱的shRNA MRC-5细胞用H2O（运行）2(20 μ米)然后进行为期5天的恢复。γH2AX百分比(A类)和pATM Ser-1981(B)-阳性细胞以平均值±S.E表示(n个=6），并显示恢复后第5天拍摄的代表性照片。C恢复后5天，测定SA-β-gal阳性细胞，如图1所示，数据用平均值±S.E表示(n个= 6). *,第页与打乱的shRNA细胞相比，<0.05；#,第页<0.05，与3%O相比2.
图3。
图3。
SelH shRNA-HeLa细胞对H的敏感性增加2O（运行）2和百草枯，但不是其他DNA损伤剂。用梯度浓度的H2O（运行）2(A类)，百草枯(B)，羟基脲(C)，喜树碱(D类)和新卡唑嗪(E类). 存活率以平均值±S.E表示(n个= 3).F类，定量RT-PCR分析用梯度浓度H处理的打乱shRNA-HeLa细胞中SelH mRNA的表达2O（运行）224小时。用18S rRNA标准化后，不含h的表达水平2O（运行）2治疗设置为1.*，第页<0.05，与无H相比2O（运行）2治疗。
图4。
图4。
在活细胞中，SelH不能被激光诱导氧化和破坏DNA。在瞬时表达SelH-GFP和PCNA-DsRed的活MRC-5细胞中产生局部DNA损伤，并在照射后30分钟内进行随访。分别使用GFP和DsRed通道在延时荧光显微镜下检测SelH和PCNA的定位。这个胰头表示局部激光损伤的位置。
图5。
图5。
ATM激酶和p53蛋白参与了SelH对MRC-5细胞基因组不稳定和复制衰老的保护。12孔板（2×10）中的SelH shRNA和打乱shRNA MRC-5细胞4细胞/孔）在有无Ku 60019的情况下培养(A类)和Ku 55933(B)5μ米28天，然后进行细胞计数。在SelH shRNA MRC-5细胞中进行γH2AX和pATM Ser-1981表达的免疫荧光分析以及SA-β-gal外观的显微捕获(C–E类，*，第页<0.05，与第0天或Ku 60019或Ku 55933治疗组相比）。F类选择嘌呤霉素后14天，产生SelH和p53双shRNA和对照MRC-5细胞，然后计数结晶紫染色的活菌落。菌落被定义为包含至少50个细胞的菌落。数值为平均值±S.E(n个= 3) (*,第页< 0.05). 展示了在40倍明亮视野下拍摄的代表性照片。
图6。
图6。
SelH在细胞内GSH含量和H反应中凋亡死亡中的作用2O（运行）2HeLa细胞治疗。 A类，用H处理早期传代细胞2O（运行）2(0–160 μ米)24小时后，用mBCL对胰蛋白酶化的单个细胞进行染色，以进行流式细胞仪分析。B，用H处理细胞2O（运行）2(160 μ米)并采集进行线粒体染色，通过测定线粒体膜电位的破坏来评估细胞凋亡。展示了代表性图片(绿色，凋亡细胞；红色，活细胞）。凋亡细胞百分比用平均值±S.E表示(n个= 8).C中，用H处理后进行克隆形成试验2O（运行）2单独或与NAC联合使用。SelH和不含H的打乱shRNA细胞中的菌落数2O（运行）2或NAC治疗设为100%。数值为平均值±S.E(n个= 3). *,第页与打乱的shRNA细胞相比，<0.05。
图7。
图7。
SelH在H后磷酸化Nrf2核积累中的作用2O（运行）2治疗。 A类、经H处理的SelH shRNA和打乱shRNA HeLa细胞的核部分2O（运行）224小时后进行Western分析。B，免疫印迹强度由ImageJ定量，核pNrf2表达由层粘连蛋白B标准化，并用平均值±S.E表示(n个= 3).C将SelH shRNA和打乱的shRNA MRC-5细胞接种到盖玻片上，用H2O（运行）2(20 μ米)，并在5天的过程中在新鲜培养基中恢复。在没有H的打乱shRNA细胞中，测量核pNrf2的荧光强度，设置为100%2O（运行）2治疗，并以平均值±S.E.表示(n个= 6). *,第页与打乱的shRNA细胞相比，<0.05。
图8。
图8。
SelH介导的对氧化应激衰老反应的抑制示意图模型。SelH是一种双功能核蛋白。首先，SelH可以通过CXXU基序作为抗氧化剂，直接清除ROS，尤其是H2O（运行）2(24). 第二，从头开始当Nrf2磷酸化并从Keap1中解离并在氧化应激下转位到细胞核时，pNrf2和SelH可能通过A-T钩基序（27）反式激活GSH和II期解毒酶的合成。总之，SelH保护细胞核免受ATM和p53依赖的氧化应激衰老反应的影响。
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