BPDE, the Migration and Invasion of Human Trophoblast Cells, and Occurrence of Miscarriage in Humans: Roles of a Novel lncRNA-HZ09

Mengyuan Dai; Wenxin Huang; Xinying Huang; Chenglong Ma; Rong Wang; Peng Tian; Weina Chen; Ying Zhang; Chenyang Mi; Huidong Zhang

doi:10.1289/EHP10477

环境健康展望。2023年1月；131(1): 017009.

2023年1月31日在线发布。数字对象标识：2008年10月28日/10477年10月

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PMID：36719213

BPDE、人类滋养层细胞的迁移和侵袭以及人类流产的发生：一部小说的作用lncRNA-HZ09

蒙远戴,^1,^2,^* 黄文新,^1,^2,^* 黄欣英,^1,² 马成龙,^1,² 王荣（音）,^1,² 彭田,¹ 魏娜·陈,¹ 张颖（音）,¹ 陈杨蜜,¹和张惠东¹

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摘要

背景：

复发性流产影响1%–3%的妊娠。然而，在几乎50%的病例中，病因不明。越来越多的证据表明，苯并（a）芘[B（a）P]是多环芳烃（PAHs）的代表，与流产有关。然而，B（a）P/苯并（a）芘-7,8-二氢二醇-9,10-环氧化合物（BPDE）诱导的滋养层细胞功能障碍和流产的潜在机制仍不清楚。

目标：

目的是发现一种新型lncRNA的作用，lnc-HZ09型，在调节BPDE中抑制滋养层细胞的迁移和侵袭以及流产的发生。

方法：

将人滋养层细胞分别用0、0.25、0.5、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25、0.25， $1.0 or 1.5 micromolar$ 带或不带相应的BPDElnc-HZ09型沉默或过度表达。利用这些细胞，我们评估了细胞迁移和侵袭、PLD1/RAC1/CDC42通路成员的mRNA和蛋白质水平、lnc-HZ09在PLD1转录和mRNA稳定性中的调节作用，以及lnc-HZ09转录和稳定性。人类绒毛组织采集自RM( $lowercase italic n equals 15$ )组及其匹配的健康对照组（HC， $lowercase italic n equals 15$ )组。我们评估了BPDE-DNA加合物、lnc-HZ09的水平以及PLD1/RAC1/CDC42通路成员的mRNA和蛋白表达，并关联了它们的相对表达水平。我们进一步构建了0、0.05或 $0.2 milligram per kilogram$ B（a）P-诱发小鼠流产模型（每个 $lowercase italic n equals 6$ )其中测量了Pld1/Rac1/Cdc42通路成员的mRNA和蛋白表达。

结果：

我们发现了一本小说lnc-HZ09型用lnc-HZ09型细胞迁移和侵袭较少。此外，复发性流产妇女绒毛组织中这种lncRNA的水平高于健康人。在过度表达的滋养层细胞中，SP1介导的PLD1 mRNA水平较低，HuR介导的PLD1 mRNA稳定性较低lnc-HZ09型然而，经MSX1处理的滋养层细胞的lnc-HZ09型和METTL3介导的m6A甲基化lnc-HZ09型导致更大lnc-HZ09型RNA稳定性。在BPDE处理的人类滋养层细胞和RM绒毛组织中，MSX1介导lnc-HZ09型转录和METTL3介导lnc-HZ09型稳定性都更高。在我们的小鼠流产模型中，B（a）P处理的小鼠Pld1/Rac1/Cdc42通路成员的mRNA和蛋白质水平较低。

讨论：

这些结果表明，在人类滋养层细胞中，BPDE暴露上调lnc-HZ09型水平，抑制PLD1/RAC1/CDC42通路，抑制迁移和侵袭，为理解不明原因流产的原因和机制提供了新的见解。https://doi.org/10.1289/EHP10477

介绍

流产是最常见的不良妊娠结局之一，是指在妊娠22周或之前因胎儿排除而终止妊娠 $less than 500 grams$ 胎儿体重。¹据报道，妊娠5至20周内流产的累积风险为11%至22%，妊娠早期流产的风险更高( $less than 14 weeks$ )与后期相比。^2,三复发性流产是指同一配偶连续两次或两次以上流产，影响1%–3%的妊娠。^4,5许多研究表明，各种危险因素与妊娠早期流产有关，如染色体异常、抗磷脂综合征、先天性子宫结构异常、I型糖尿病和甲状腺功能障碍。^1,6,7然而，在大约50%的RM患者中，流产的临床原因是完全未知的，这些都被归类为原因不明的反复流产。^8,9因此，探索不明原因，准确预防和治疗流产就显得尤为迫切。

多环芳烃（PAHs）是一类典型的持久性有机污染物，由家用或工业用煤、香烟、化石燃料、木材和食品的不完全热解和/或燃烧产生。¹⁰多环芳烃长期存在于环境和生物群中，主要通过吸入和饮食对生物体产生毒性影响。¹¹越来越多的研究表明，许多多环芳烃与皮肤癌、肺癌和膀胱癌有关。¹⁰最近的研究还表明，多环芳烃作为内分泌干扰物，对生殖健康有不利影响。¹²多环芳烃的原型代表B（a）P被代谢生成最终代谢物苯并（a）芘-7,8-二氢二醇-9,10-环氧化合物（BPDE）。在一项对29名女性进行的小型研究中在体外受精后，自报接触主流烟雾的女性的卵泡液中的B（a）P水平高于自报未接触香烟烟雾的女性( $1.32 \pm 0.68 纳克 / 毫升$ 与。 $0.03 \pm 0.01 纳克 / 毫升$ ).¹³1991年至1995年期间，立陶宛非孕妇的卵泡液中也发现了比孕妇更多的B（a）P( $1.79 \pm 0.03 纳克 / 毫升$ 与。 $0.08 \pm 0.03 纳克 / 毫升$ ).¹⁴一项流产病例对照研究表明，母亲血液中BPDE-DNA加合物水平越高，流产风险越高。¹⁵在小鼠中，妊娠早期暴露于B（a）P会损害小鼠的子宫容受性，¹⁶抑制胚胎着床，¹⁶子宫内膜基质细胞蜕膜化。¹⁷因此，探索B（a）P或BPDE如何影响流产和相关的特定途径非常重要。

人绒毛外滋养层细胞（EVT）作为胎盘中最重要的成分之一，侵入妊娠子宫，建立母胎界面。¹⁸它们的正常增殖、迁移和侵袭对成功怀孕至关重要。¹⁹人类滋养层细胞的功能失调可能导致子宫螺旋动脉重建受损，以及与滋养层细胞相关的不良妊娠结局，如流产。²⁰在我们最近的工作中，我们发现人类滋养层细胞系HTR-8/SVneo²¹和天鹅71^20,22经BPDE处理的细胞凋亡水平较高，增殖、侵袭和迁移较少。经BPDE处理的人绒毛外植体也表现出较少的迁移和侵袭。²¹然而，这些结果的潜在机制在很大程度上仍不清楚。

哺乳动物细胞的侵袭和迁移受到许多信号通路的调节。磷脂酶D水解物1（PLD1）参与调节各种细胞生物学过程，如细胞生长、增殖、迁移和细胞内蛋白质运输。²²此外，RAC1（Ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物1）和CDC42（细胞分裂控制蛋白42）也调节细胞运动和增殖的动力学。²³此外，据报道，PLD1可以与RBL-2H3细胞中的RAC1和CDC42相互作用。²⁴因此，PLD1/RAC1/CDC42通路是否可能调节人类滋养层细胞和绒毛组织的迁移和侵袭，有待进一步研究。

LncRNAs是长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子，在转录和转录后水平上都具有重要的调控功能。²⁵lncRNA的表达受发育调控，lncRNA也具有组织特异性和/或细胞类型特异性。研究表明，滋养层细胞功能可能受到某些lncRNA的影响，例如lncRNA EPB41L4A-AS1，它诱导滋养层细胞和胎盘组织的代谢重编程²⁶; lnc-SLC4A1-1，通过激活免疫反应和调节 $nuclear factor-kappa B per C-X-C Motif Chemokine Ligand 8$ 轴²⁷; 和lncRNA MEG8，参与早期滋养层细胞功能的调节。²⁷最近，我们对不明原因的RM和HC绒毛组织以及BPDE处理的滋养层Swan 71细胞进行了转录组测序。²⁸基于这些测序数据，我们确定了一些新的lncRNA，包括lnc-HZ01，它通过形成lnc-HZ01/MXD1反馈环来调节BPDE抑制的滋养层细胞增殖和流产²⁹; lnc-HZ03上调p53/SAT1通路促进滋养层细胞凋亡并影响流产²⁸; lnc-HZ04，其作为miR-HZ04的ceRNA并上调 $inositol 1,4,5-trisphosphate (I P 3) receptor type1 per calcium or calmodulin-dependent protein kinase 2 per sarcoglycan beta$ 通路³⁰; 和lnc-HZ08，调节BPDE诱导的滋养层细胞功能障碍，并与流产相关。³¹这些工作表明，这些lncRNA与流产的发生密切相关。然而，大量新的lncRNA尚待鉴定。这些新的lncRNAs如何调节BPDE抑制的人类滋养层细胞迁移和侵袭，以及如何调节流产，目前尚不清楚。

因此，在本研究中，我们旨在探索BPDE抑制滋养层细胞迁移和侵袭的信号通路，并确定一种新的lncRNA在BPDE处理的滋养层细胞和RM绒毛组织中的调节作用。为了实现这些目标，我们在体外细胞实验、人体组织实验和体内小鼠模型实验，我们希望能够发现BPDE抑制人类滋养层细胞侵袭和迁移在流产发生中的机制，以及新型lncRNA的调节作用。希望这项工作能够为理解不明原因流产的原因和机制提供新的见解。

材料和方法

化学制品

无水二甲基亚砜、玉米油、苯并（a）芘[B（a）P，纯度99%]和放线菌素D来自Sigma-Aldrich。苯并（a）芘-7,8-二氢二醇-9,10-环氧化物（BPDE，99.9%）来自MRIGlobal（MRIGloba）。BPDE在DMSO中溶解 $4 millimolar$ 并存储在 $negative 80 degrees Celsius$ .B（a）P在使用前溶解在玉米油中。所有的载体对照或培养物均含有等量的二甲基亚砜（0.03%，v/v）。

体外试验分子和细胞生物学分析

细胞培养。

天鹅71细胞（Swan 71 cells）是耶鲁大学Gil Mor小组构建的一种早期人类滋养层细胞，它被人类端粒酶永久化³²并作为礼物从该组中获得。HTR-8/SVneo细胞是由SVneo病毒永久化的人早期滋养层细胞，购自湖南丰惠生物科技有限公司（CL0164）。天鹅71细胞在DMEM/F12培养基（GIBCO，Invitrogen）中培养，HTR-8/SVneo细胞在RPMI 1640培养基（GIBCO）中培养。这两种培养基都添加了10%的FBS（GIBCO），在含有5%的湿润空气中培养 ${一氧化碳}_{2}$ 37°C时。

细胞转染。

空载体pcDNA3.1（目录号V790-20）购自赛默飞世尔科学公司。用于构建过表达质粒的cDNAlnc-HZ09型（pcDNA3.1-HZ09）、METTL3 mRNA（pcDNA3.1-METTL3）、MSX1 mRNA（pcDNA3.1-MSX1）、SP1 mRNA（pcDNA3.1-SP1）或HuR mRNA（pcDNA3.1-HuR）被合成并通过Addgene构建到pcDNA3.1载体中（表S1）。相应的RNA序列从国家生物技术信息中心（NCBI）数据库获得（基因库，智人，GRCh38.p14；序列见表S1）。空载体pcDNA3.1用作阴性对照。赛默飞世尔公司定制了Si-HZ09、Si-METTL3、Si-MSX1、Si-SP1、Si-HuR和Si-NC（阴性对照）（序列见表S2）。Swan 71和HTR-8/SVneo细胞( $1 times 10 begin superscript 6 end superscript$ 细胞/孔）接种在6孔板中，培养至80%汇合。滋养层细胞转染 $2.0 micrograms per well$ 质粒或 $50 nanomolar$ 根据制造商的协议，siRNA在Lipofectamine 3000（Invitrogen）培养基中放置24小时。对于所有分析，使用TC20自动细胞计数器（Bio-Read实验室）进行细胞定量。

细胞迁移和入侵。

滋养层细胞( $1 times 10 begin superscript 6 end superscript$ 用si-NC、si-HZ09、si-PLD1、si-HuR或si-METTL3转染6孔板中的细胞/孔），或用Lipofectamine 3000培养基转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-HZ09，pcDNA3.2-PLD1或pcDNA3.11-METTL 24小时。取培养基，用胰蛋白酶分离细胞，将存活细胞重新悬浮于DMEM/F12或RPMI 1640培养基中。对于迁移分析， $3 times 10 begin superscript 4 end superscript$ 将细胞/孔接种在24孔跨孔室（Corning）中并培养24小时， $80 microliters$ 将稀释在DMEM/F12培养基（稀释比1:8）中的等分Matrigel（BD Biosciences）涂布在24孔跨孔室上，并在37°C下固化1h( $1 times 10 begin superscript 4 end superscript$ 细胞/孔）置于Matrigel基质顶部并培养24 h。底部培养箱含有含有10%FBS作为人类滋养层细胞趋化剂的培养基。24小时后，用4%多聚甲醛固定20分钟，用结晶紫染色15分钟，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次。为了便于观察，Axio Observer 3（蔡司）在 $200 times$ 放大并在五个随机字段中计数。

高通量mRNA测序和数据处理。

天鹅71细胞( $5 times 10 begin superscript 6 end superscript$ 单元格）中 $10 millimeters$ 盘子过度表达lnc-HZ09型通过转染 $2.0 micrograms per well$ pcDNA3.1-HZ09和等数量的对照细胞 $2.0 micrograms per well$ pcDNA3.1也用于mRNA测序。根据BGI商业标准流程，在HiSeq 2000测序平台（BGI-深圳）上进行高通量mRNA测序(https://www.bgi.com/).^28,29,31简言之，总RNA通过Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific）提取。该过程包括去除rRNA、合成双链cDNA、末端修复、降解一条链以及通过聚合酶链反应（PCR）富集另一条链。通过测序证实了文库的质量。差异表达的mRNA $greater than 2 fold$ 和 $lowercase italic p less than 0.05$ 由华大基因提供的Tom博士在线生物信息学平台读取计数生成(biosys.bgi.com网站). 在NCBI数据库（基因库，智人，GRCh38.p14）中搜索不同的mRNA，以确定其基因组位点。这些差异表达的mRNA用于基因本体（GO）分析(http://geneontology.org/)生成GO图。^33,34

cDNA末端5′和3′快速扩增（RACE）分析。

用Trizol试剂分离总RNA。RACE-ready第一链cDNA用 $1 microgram$ 根据制造商的说明，使用SMARTer RACE 5′/3′试剂盒（Takara Bio）的总RNA。按照制造商的说明（Takara Bio），在LightCycler480 II（Roche）上进行5′-和3′-RACE PCR反应（包括PCR Master Mix、SeqAmp DNA聚合酶、5′-或3′-RACE-ready cDNA、5′或3′GSP、UPM、SeqAmp Buffer和四个dNTP）。PCR程序如表S3所示。RACE PCR产物在1%琼脂糖凝胶上分离，并用NuceloSpin凝胶和PCR清理试剂盒（Takara Bio）提取。然后，使用In-Fusion Snap Assembly Master Mix（Takara Bio）在50°C下亚克隆DNA产物到pGH-T载体（GV0108-C，上海通用生物技术有限公司）中15分钟，然后使用基因特异性引物（Sagene）进行双向测序（表S4）。使用生物分析仪2100使用RNA 6000纳米芯片（安捷伦）测定RNA完整性。使用NanoDrop One C分光光度计（Thermo Fisher Scientific）评估DNA数量。的全长核苷酸序列lnc-HZ09型如表S5所示。

总RNA提取和定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）。

根据制造商的协议，使用含有DNase I（生命技术）的Trizol（Invitrogen）从Swan 71细胞、HTR-8/SVneo细胞、人类绒毛组织或小鼠胎盘组织中提取RNA。使用NanoDrop 2000紫外分光光度计（Thermo Fisher Scientific）评估RNA质量和数量。如前所述进行RT-qPCR分析。^28,29,31简单地说，分离的RNA( $800 nanograms$ )使用第一链cDNA合成试剂盒（Invitrogen）将其转化为cDNA。然后，使用 $20 microliter$ SYBR qPCR系统（包括Maxima-SYBR Green qPCR Mix，其中包括Maxima Hot Start Taq DNA聚合酶、SYBR Green I和dNTPs）遵循制造商的说明（赛默飞世尔科技公司）（条件见表S6）。放大结果使用 $2 begin superscript negative uppercase delta uppercase delta cycle threshold end superscript$ iQ5实时检测系统（Bio-Read实验室）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）mRNA被用作lncRNA和mRNA的标准化内标。引物（Sangon Biotech）序列如表S7所示。

蛋白质印迹分析。

如前所述进行Western blot分析。^28,29,31简言之，使用RIPA裂解缓冲液（Thermo Fisher Scientific）提取蛋白质，并使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒（Pierce）进行定量。蛋白质类( $30 micrograms$ )使用6%–12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，然后转移到平衡聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Amersham Biosciences）。用5%牛血清白蛋白（BSA；Sigma-Aldrich）在25℃下封闭膜1 h。然后，在4℃下将膜与一级抗体孵育过夜。主要抗体包括抗PLD1（1:100稀释；sc-28314，Santa Cruz Biotechnology）、抗RAC1（1:1000稀释；ab155938，Abcam）、抗CDC42（1:1000；ab1429，Abcam）、抗SP1（1:1000稀稀释；ab255289，Abcam）、抗HuR（1:1000稀释剂；ab200342，Abcan）、抗MSX1（1:600稀释；LS-C30725，LifeSpan Biosciences）、，抗METTL3（稀释度1:1000；ab195352，Abcam）、抗GAPDH（稀释度1:1000；ab8245，Abcam）和 $anti-lowercase beta tubulin$ （稀释度1:1000；ab78078，Abcam）。用含有吐温-20（TBST）的Tris缓冲盐水洗涤三次，每次10分钟后，将膜与二级抗体在25°C的封闭溶液中孵育1小时。二级抗体包括山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（稀释度1:1000；ab207995，Abcam）和山羊抗鼠IgG（稀释度：1:1000；ab207996，Abcam）。通过图像J分析每个蛋白带的相对密度 $β -微管蛋白$ 或GAPDH作为内部标准。

荧光原位杂交（FISH）。

Lnc-HZ09号在Swan 71细胞中检测到Cy3标记lnc-HZ09型探针（5′-CACGAGC-Cy3-TGCCCACGGTCT-Cy3-TCCTT-3′）（Empire Genomics），符合FISH试剂盒程序（RIBOBIO），如前所述。³¹简而言之，Swan 71细胞( $1 times 10 begin superscript 4 end superscript$ 细胞/孔）接种在35-mm共聚焦培养皿（分类号80100；NEST）中24小时；然后用PBS清洗，用4%多聚甲醛（Sigma-Aldrich）固定15分钟，用1%Triton X-100（Sigma Aldrich $2 micromolar$ FISH探头lnc-HZ09型用PBS洗涤三次后，在73°C下预处理5分钟。然后，用DAPI对这些固定细胞进一步染色20分钟。用PBS洗涤三次后，在 $488 nanometers$ 共焦荧光显微镜上DAPI和570 nm FISH探针( $Nikon super-resolution microscope plus air$ ; 尼康）。相对水平lnc-HZ09型使用20个随机细胞和Image J软件对细胞质和细胞核进行定量( $hue equals 200$ ).

mRNA稳定性分析。

Swan 71或HTR-8/SVneo细胞( $1 times 10 begin superscript 6 end superscript$ 细胞/孔）过度表达或敲除lnc-HZ09型将HuR或METTL3接种在6孔板中12小时。然后，用 $5 micrograms per milliliter$ 放线菌素D（Sigma-Aldrich）阻断mRNA转录。在0、1、2、3、4或5小时后，从细胞中提取RNAlnc-HZ09型或PLD1 mRNA通过RT-qPCR分析。GAPDH mRNA作为标准化内标。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析。

根据制造商的协议，使用EZ-Magna ChIP染色质免疫沉淀试剂盒（Millipore）进行ChIP分析。^29,31简而言之，Swan 71或HTR-8/SVneo细胞( $1 times 10 begin superscript 7 end superscript$ 细胞）用pcDNA3.1-HZ09或si-HZ09转染或用 $1.0 micromolar$ BPDE公司。然后，在37°C下用1%甲醛交联细胞15分钟，并在 $125 millimolar$ 用生物破坏者（Diagenode SA）超声处理甘氨酸5分钟后，产生300至600 bp的DNA片段。随后，使用MSX1抗体（稀释度1:200；sc-517256，Santa Cruz Biotechnology）或SP1抗体（稀释率1:200；ab227383，Abcam）在4°C下在反向旋转器上过夜进行免疫沉淀，IgG重量相等（稀释度1:100；ab172730，Abcam）作为阴性对照。的启动子区域lnc-HZ09型或PLD1经免疫沉淀、提取和扩增( $800 nanograms$ )qPCR（表S6中的程序）。表S8中列出了特定的qPCR引物。

RNA免疫沉淀（RIP）分析。

基于制造商的方案，使用Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒（Millipore）进行RIP测定。²⁹简单地说，滋养层细胞( $1 times 10 begin superscript 7 end superscript$ 细胞）在含有核糖核酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中进行裂解。将细胞裂解物与附着有人HuR抗体（ab200342；Abcam）或小鼠IgG（5873S；细胞信号技术）的磁珠孵育，作为阴性对照。免疫沉淀RNA( $800 nanograms$ )由Trizol提取，并使用表S8中列出的引物（Sangon Biotech）通过RT-qPCR（表S6中的程序）进行分析。

甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）。

$uppercase n begin superscript 6 end superscript-methyladenosine$ （m6A RNA甲基化）修饰lnc-HZ09型如前所述，通过MeRIP-qPCR检测确定。²⁹简单地说，纯化和片段化的RNA与皮尔斯蛋白A/G磁珠（Thermo Fisher Scientific）和 $5 micrograms$ 抗m6A抗体（ab208577；Abcam）或兔IgG作为阴性对照，在4°C下旋转2小时。洗涤后，使用表S8中列出的引物洗脱m6A修饰RNA并通过RT-qPCR（表S6中的程序）检测。总RNA的十分之一被用作输入。通过对输入水平进行归一化，计算每个样品中相应的m6A修饰水平。

体外RNA下拉分析。

体外如前所述进行RNA下拉分析。³¹简要地，lnc-HZ09型,lnc-HZ09型-AS（反义序列）、PLD1 mRNA或PLD1-mRNA-AS分别为在体外从pGEM-T-HZ09、pGEM-T-HZ09-AS、pGEM-T-PLD1或pGEM-P-PLD1-AS转录而来，所有这些都是使用pGEM-T空载体（A3600；Promega）定制和合成的，使用TranscriptAid T7 High Yield Transscription Kit（Thermo Fisher Scientific），并使用GeneJET RNA纯化试剂盒（Thermo-Fisher科学）纯化。然后，使用生物素RNA标记混合物（Roche）用生物素标记每个RNA，并在4°C下与蛋白-RNA结合缓冲液中的裂解蛋白混合1h。Lnc-HZ09号-AS或PLD1 mRNA-AS用作阴性对照（序列见表S9）。随后，使用Pierce磁性RNA-蛋白下拉试剂盒（Thermo Fisher Scientific）通过磁珠上的链霉亲和素将RNA-蛋白质复合物拉下，并通过Western blotting分析蛋白质。

人体组织分析

组织收集和声明。

如前所述，从2018年12月至2019年12月在华西第四医院（中国成都）接受治疗的15名不明原因反复流产患者（RM组）和15名选择堕胎作为健康对照的女性（HC组）收集绒毛组织。^28,29,31所有RM患者都有 $greater than or equal to 2$ 连续不明原因流产。任何具有以下特征之一的女性都被排除在外³⁵:一)子痫或先兆子痫；b条)病毒性传染病（如艾滋病、梅毒、结核病、淋病）；c（c）)多囊卵巢综合征；d日)子宫异常或宫颈机能不全；e（电子）)黄体期缺陷、自身免疫异常、高雄激素血症、高催乳素血症或抗磷脂抗体综合征；（f）)双亲或流产的异常核型；克)内分泌或代谢性疾病的症状（如甲状腺功能亢进、糖尿病和甲状腺功能减退）；和小时)结核病、HIV、HBV、HCV或 $γ -干扰素$ 发布测试。所有HC组患者均缺乏上述八项特征中的任何一项，并有过妊娠史。一块大小约为 $2 \times 0.5 \times 0.5 {厘米}^{三}$ 在妊娠6～10周时，从胎盘胎儿侧用手切开，清除这两组孕妇的蜕膜。这些样品被连续清洗并立即在液氮中冷冻。使用硅胶珠（107735；Merck）通过使用TissueLyser LT仪器（Qiagen）摇晃1分钟使绒毛组织均匀化。大约 $300 milligrams$ 绒毛组织在 $600 microliters$ 用于总RNA提取的Trizol试剂（Invitrogen）和RIPA裂解缓冲液（Thermo Fisher Scientific）中含有用于总蛋白分离的蛋白酶抑制剂混合物。实验方案已经四川大学华西第四医院医学伦理委员会授权。研究前签署了书面知情同意书。

绒毛组织中BPDE-DNA加合物水平的测定。

使用组织/细胞基因组DNA提取和纯化试剂盒（K1442-100；BioVision）从人类绒毛组织中分离基因组DNA。使用BPDE-DNA加合物ELISA试剂盒（STA-357；Cell Biolabs）评估BPDE-DNA加合物的水平。简单地说，DNA样本( $2 micrograms per milliliter$ )经1%琼脂糖凝胶测定，将其超声成200–1000 bp的片段，然后在室温下与抗BPDE抗体（稀释度1:1000；235601，Cell Biolabs）在96 well板中孵育2 h。用洗涤缓冲液（310806；Cell Biolabs）洗涤后，向每个孔中添加二级抗体（10902；Cell Biolabs。反应终止后，通过测量吸光度测定BPDE-DNA加合物的相对水平 $450 nanometers$ 使用微孔板阅读器（VL0L00D0；Thermo Fisher Scientific），以简化DNA标准（235602；Cell Biolabs）作为吸光度空白。使用BPDE-DNA标准曲线定量BPDE-DNA加合物的数量。结果表示为每微克DNA中BPDE-DNA加合物的纳克数。

在体内小鼠模型试验

如前所述构建了B（A）P-诱导的流产小鼠模型。^28,29,31简而言之，C57BL/6小鼠来自Charles River公司，并被安置在当地的实验动物中心。将小鼠（6-8周龄）置于标准环境条件下（12小时光/暗循环，22°C）。小鼠进行了1周的驯化，在此期间，他们接受标准的食物和自来水随意雌性小鼠与雄性小鼠通宵交配，阴道塞的出现被视为怀孕的第一天（D1），通过监测体重的增加进一步验证了这一点。三组怀孕小鼠（每组 $lowercase italic n equals 8$ )每日给予B（a）P（0，0.05，或 $0.2 milligram per kilogram$ （溶于玉米油中），用等体积的玉米油作为溶媒对照，从D1到D13经口灌胃。所有小鼠每天称重，并通过注射戊巴比妥使其安乐死( $100 milligrams per kilogram$ )在D14收集子宫。从每组小鼠中随机收集胎盘。人工解剖胎盘组织，然后在液氮中进行snap冷冻并保存在 $negative 80 degrees Celsius$ 用于随后的RT-qPCR和Western blotting分析。该方案经华西医学中心医学伦理委员会批准。

软件预测和数据分析

编码潜力评估工具(https://wlcb.oit.uci.edu/cpat网址/)]³⁶用于分析lncRNA的蛋白编码潜力。使用NCBI开放阅读框架查找器预测开放阅读框架（ORF）(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder网站/)]. 保护域数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)]和Pfam 34.0(http://pfam.xfam.org/)³⁷用于分析lncRNA中的保守结构域。PROMO软件[版本3.0.2(http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi？dirDB=TF_8.3)]^38,39用于预测转录因子。使用STRING[版本11.5]分析PLD1可能调控的蛋白质(https://cn.string-db.org/)].⁴⁰最后，用SRAMP软件【2.15版】鉴定RNA上的m6A甲基化修饰位点(http://www.cuilab.cn/sramp/)].⁴¹

所有实验均独立重复三次，数据表示为 $意思是 \pm 标准偏差$ （SD； $lowercase italic n equals 3$ ). 使用SPSS软件（24.0版；SPSS Inc.）进行统计分析。独立样本学生 $t吨$ -两组间进行测试；更多组采用Dunnett或LSD事后检验进行单向方差分析。相对表达水平的相关分析采用Pearson分析。虚线框用于在视觉上区分RM组和HC组的数据点。所有图形均使用GraphPad Prism（8.0版；GraphPad Inc.）制作。当* $lowercase italic p less than 0.05$ , ** $lowercase italic p less than 0.01$ ，或*** $lowercase italic p less than 0.001$ .

结果

在RM绒毛组织和BPDE-Exposed人滋养层细胞中高表达的新型lnc-HZ09的特性

在我们之前的工作中，通过高通量转录组测序，我们确定了22个新的lncRNA，它们在BPDE处理后的人类Swan 71细胞中显著高表达，10个新的incRNA在RM组织中相对于HC组织显著高表达。²⁸在这些测序数据中，一种新的lncRNA，lnc-32238，是BPDE暴露的滋养层细胞（图S1A）和相对于HC组织的RM组织（图S1B）中高度表达的lncRNAs之一，这意味着这种lncRNA可能以一种未知的调节方式调节BPDE暴露的滋养层细胞的功能失调和流产的发生。在当前的工作中，我们重点关注这种lncRNA。RT-qPCR分析进一步证实Lnc-32238在BPDE暴露的Swan 71和HTR-8/SVneo细胞中显著高表达(图1A、B). 通过cDNA末端快速扩增（RACE）分析（图S1C；表S4和S5），该lncRNA被鉴定为长度为365个核苷酸（nt）的有义转录物，位于第16号染色体（chr 16:3220699-3221017）。然后，这个lnc-32238被称为lnc-HZ09型，其序列提交给了NCBI，注册号为MW675687。蛋白质编码潜力lnc-HZ09型使用NCBI ORF查找器和CPAT（编码概率 $0.036 less than 0.364$ ).³⁶此外，lnc-HZ09型使用CDD和Pfam发现没有保守结构域。⁴²数据表明：lnc-HZ09型可能不编码蛋白质（表S10）。Lnc-HZ09号FISH检测发现，其分布于Swan 71细胞的细胞质和细胞核(图1C).

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图1。

新型lnc-HZ09的表达水平与lnc-HZ09过表达或敲除的人类滋养层细胞的迁移和侵袭。（A–B）RT-qPCR分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )第页，共页lnc-HZ09型BPDE处理的Swan 71（A）或HTR-8/SVneo（B）细胞中的表达水平。（C） FISH分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )的分布lnc-HZ09型（红色）在Swan 71细胞的细胞核和细胞质中（比例尺， $50 micrometers$ )以及lnc-HZ09型焦点。（D–G）对过度表达（D和F）或敲除（E和G）的Swan 71（D–E）或HTR-8/SVneo（F–G）细胞迁移和侵袭的Transwell分析lnc-HZ09型（比例尺， $200 micrometer$ ). 每个视图的细胞数被量化。这些条形图的汇总数据显示在Excel表S1中。在RT-qPCR分析中，未经处理的细胞中的RNA水平设置为“1”。C–G显示了三个独立实验的代表性数据。（A–G）中的数据显示 $意思是 \pm 标准偏差$ 三个独立实验的结果。双尾学生的 $t吨$ -测试（D，F）；（A，B，E，G）的单因素方差分析* $lowercase italic p less than 0.05$ , ** $lowercase italic p less than 0.01$ ，以及*** $lowercase italic p less than 0.001$ 注：方差分析，方差分析；BPDE，苯并（a）芘-7,8-二氢二醇-9,10-环氧；荧光原位杂交；HZ09，过度表达lnc-HZ09型; NC，siRNA阴性对照；ns，无显著性；RT-qPCR，定量逆转录聚合酶链反应；SD，标准偏差；si-HZ09，击倒lnc-HZ09型; 载体，pcDNA3.1的空载体。

lnc-HZ09过表达或沉默对人滋养层细胞迁移侵袭的检测

因为lnc-HZ09型在BPDE处理的滋养层细胞中高度表达，探讨其在滋养层细胞功能调节中的作用。为了确定这一点，lnc-HZ09型通过转染pcDNA3.1-HZ09在人类滋养层细胞Swan 71细胞中过度表达（验证如图S1D所示）；并将这些细胞和相应的对照细胞用于mRNA测序。在测序数据中，我们发现1055个mRNA下调，710个mRNA上调，但存在差异 $greater than 2 fold$ 和 $对$ -值 $less than 0.05$ 过度表达lnc-HZ09型（Excel表S2中的排序数据）。随后，GO生物过程分析表明，细胞迁移可能受到lnc-HZ09型过度表达（图S1E）。为了通过实验验证这一点，lnc-HZ09型通过转染pcDNA3.1-HZ09过度表达或通过转染其两种不同的siRNA（si1-HZ09或si2-HZ09）在Swan 71和HTR-8/SVneo细胞中沉默，并且通过RT-qPCR分析验证了其效率（图S1D，F-H）。评估各细胞的迁移和侵袭。我们发现了lnc-HZ09型-与转染空载体的细胞相比，过表达细胞的迁移和侵袭明显减少。相反，lnc-HZ09型-沉默细胞的迁移和侵袭能力显著增强(图1D-G).

lnc-HZ09通过PLD1/RC1/CDC42通路对滋养层细胞迁移和侵袭的调控

其次，可能受以下因素调节的潜在信号通路lnc-HZ09型进行了进一步研究。首先，发现了差异表达的关键分子。在BPDE处理的Swan 71细胞、人类RM与HC绒毛组织的RNA测序数据中，以及lnc-HZ09型-在过度表达的细胞中，我们发现了9个表达水平不同的下调mRNA $greater than 2 fold$ 实验组和对照组之间（例如，经BPDE处理的与未经处理的Swan 71细胞，RM与HC绒毛组织，以及lnc-HZ09型-过表达vs.对照Swan 71细胞） $对$ -值 $less than 0.05$ 在这三组测序数据的交叉处(图2A). RT-qPCR分析进一步证实，它们在Swan 71细胞中均上调lnc-HZ09型通过siRNA击倒（图S2A）。其中，PLD1是变化最大的mRNA之一（图S2A）。字符串分析²⁴表明PLD1可能与RAC1和CDC42相互作用(图2B)这意味着PLD1/RAC1/CDC42通路可能调节滋养层细胞的迁移和侵袭，也可能受lnc-HZ09型在滋养层细胞中。

图2A是名为苯并（a）芘二醇环氧处理与未处理的维恩图，显示了三个圆圈。顶部的圆圈标有250，左侧的圆圈标明1043，右侧的圆圈注明927。交叉区域标记为9。交叉区域代表胶原蛋白α-1（12）、2型碘甲状腺原氨酸脱碘酶、肌球蛋白重链10、磷脂酶D1、Pleckstrin和Sec7结构域包含3、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体13型、单链D N A结合蛋白2和转化生长因子β-2。图2B是磷脂酶D1、Ras-related C3肉毒杆菌毒素底物1和细胞分裂控制蛋白42同源物的字符串分析。图2C是一组两个蛋白质印迹，显示了Swan 71的Vector（100），HZ 09（31），阴性对照（100），si1 HZ 09（163），si2 HZ 09（187），以及H T R-8或SVneo（柱）的Vector（100），HZ 09（74），阴性对照（100），si1 HZ 09（144），si2 HZ 09（179）和磷脂酶D1，下体β-微管蛋白，特异性蛋白1，和小写的β-微管蛋白（行）。图2D是一个西方螺栓，显示Vector（100）、HZ 09（169）、Negative control（100。图2E、2F、2O、2P、2Q、2R是标题为Swan 71中的染色质免疫沉淀、H T R-8或SVneo中的染色素免疫沉淀、Swan 71的受体相互作用蛋白、Swan 71中的受体相互关系蛋白、H T R-8或SVneo中的受体相互作用蛋白、H T R-8或SVneo中受体相互作用蛋白质的条形图，绘制磷脂酶D1启动子相对折叠富集图，范围从0到6，增量为2；磷脂酶D1启动子相对折叠富集，范围从0到6，增量为2；核糖核酸相对表达，范围从0到6，增量为2；核糖核酸相对表达，单位增量范围为0～4；核糖核酸相对表达，范围从0到6，增量为2；和核糖核酸相对表达，在抗免疫球蛋白G和抗特异性蛋白1中以单位增量（y轴）从0到4不等；抗免疫球蛋白G和抗特异性蛋白1；抗免疫球蛋白G和抗人抗原R；抗免疫球蛋白G和抗人类抗原R；抗免疫球蛋白G和抗人抗原R；HZ 09和磷脂酶D1的抗免疫球蛋白G和抗人类抗原R（x轴）。图2H、2I、2S、2T、2U、2V是标题为Swan 71染色质免疫沉淀、Swan 71染色体免疫沉淀、Swan 71受体相互作用蛋白、Swan 71中受体相互作用蛋白质、H T R-8或SVneo中受体相互反应蛋白和H T R-8或SVnoo中受体互作用蛋白的聚集条形图，绘制磷脂酶D1启动子相对折叠富集图，单位增量范围从0到4；磷脂酶D1启动子相对折叠富集，范围从0到8，增量为2；信使核糖核酸相对表达，范围从0到4，增量为2；信使核糖核酸相对表达，范围从0到4，增量为2；信使核糖核酸相对表达，单位增量范围为0至3；和信使核糖核酸相对表达，在抗免疫球蛋白G和抗特异性蛋白1中以2（y轴）的增量从0到4不等；抗免疫球蛋白G和抗特异性蛋白1；抗免疫球蛋白G和抗人抗原R；抗免疫球蛋白G和抗人抗原R；抗免疫球蛋白G和抗人抗原R；载体和HZ 09的抗免疫球蛋白G和抗人类抗原R（x轴）；阴性对照和si-HZ09；矢量和HZ 09；HZ 09；阴性对照和si1-HZ09；矢量和HZ 09；阴性对照和si1-HZ09。图2G是一个western blot，显示Vector（100）、HZ 09（34）、阴性对照（100），si1-HZ09（143）、si2-HZ09的（157）柱和特异性蛋白1和小写β-微管蛋白，分别位于swan 71和H T R-8或SVneo（行）下。图2J和2M分别有一组名为Swan 71的两线图，绘制了磷脂酶D1信使核糖核酸的剩余量，范围为0.0到1.0，增量为0.5，增量为0.0至1.0，时间（小时）为0.5（y轴），矢量、HZ 09、si1,2-HZ 09和阴性对照的单位增量（x轴）范围为1到5。图2K和2N分别有一组名为H T R-8或SVneo的两线图，绘制了磷脂酶D1信使核糖核酸的剩余量，范围为0.0至1.0，增量为0.5，增量为0.0到1.0，时间（小时）为0.5（y轴），向量HZ 09、si1,2-HZ 09的单位增量（x轴）范围为1至5，和阴性对照。图2L是一个western blot，显示载体（100）、人类抗原R（147）、阴性对照（100），si1-HZ 09（41）、si2-HX 09（56）柱和磷脂酶D1和小写β-微管蛋白，分别位于swan 71和H T R-8或SVneo（行）下。图2W是生物素标记的HZ 09或磷脂酶D1信使核糖核酸下拉的蛋白质印迹，在Swan 71和H T E-8或SVneo下显示输入、HZ 09有义、HZ 09反义、输入、磷脂酶D1有义和磷脂酶D1反义（柱）以及人类抗原R。图2X是生物素标记的磷脂酶D1信使核糖核酸下拉的蛋白质印迹，显示输入、载体（磷脂酶D1反义）、HZ 09（磷脂酶D1反义）、输入、阴性对照（磷脂酶D1反义）和si1 HZ 09（磷脂酶D1反义）（柱）和人抗原R，根据Swan 71和H T E-8或SVneo。图2Y是一个通过生物素标记的HZ 09进行的名为下拉的western blot，在Swan 71和H T E-8或SVneo下显示输入、载体（HZ 09义）、HZ 09（HZ 09-反义）、输入、阴性对照（HZ-09义）和si1-HZ 09，以及人类抗原R。

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图2。

lnc-HZ09调节人滋养层细胞中PLD1/RAC1/CDC42通路成员的表达水平。（A）经BPDE处理的与未经处理的Swan 71细胞的mRNA测序数据交叉点中显著下调的mRNA，lnc-HZ09型-过度表达与对照Swan 71细胞，RM与HC绒毛组织。（B） PLD1、RAC1和CDC42的字符串分析。（C） Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中PLD1、RAC1和CDC42蛋白水平的代表性western blot分析lnc-HZ09型以GAPDH为内部标准。每个波段的相对强度被量化 $意思是 \pm 标准偏差$ 图S3A显示了三个重复的。（D）以GAPDH为内标，对SP1过度表达或敲除的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中SP1和PLD1蛋白水平进行代表性的western blot分析。每个波段的相对强度被量化 $意思是 \pm 标准偏差$ 图S3G显示了三个重复的。（E–F）SP1 ChIP分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )SP1在Swan 71（E）或HTR-8/SVneo（F）细胞中PLD1基因启动子区相对富集。（G） Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中SP1蛋白水平的代表性蛋白质印迹分析lnc-HZ09型，使用 $β -微管蛋白$ 作为内部标准。每个波段的相对强度被量化 $意思是 \pm 标准偏差$ 图S3H显示了三个重复的。（H–I）SP1 ChIP分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )SP1在Swan 71细胞中PLD1基因启动子区相对富集，过度表达（H）或敲除（I）lnc-HZ09型（J–K）PLD1的mRNA稳定性（每个 $lowercase italic n equals 3$ )在Swan 71（J）或HTR-8/SVneo（K）细胞中过度表达或敲除lnc-HZ09型（L）HuR过度表达或敲低的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中PLD1蛋白水平的代表性western blot分析 $β -微管蛋白$ 作为内部标准。量化每个条带的相对强度 $意思是 \pm 标准偏差$ 图S5E显示了三个重复的。（M–N）PLD1的mRNA稳定性（每个 $lowercase italic n equals 3$ )HuR过度表达或敲低的Swan 71（M）或HTR-8/SVneo（N）细胞。（O–R）RIP分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )的相对水平lnc-HZ09型在Swan 71（O和P）或HTR-8/SVneo（Q和R）细胞中被HuR蛋白下调的（O和Q）或PLD1 mRNA（P和R）。（S–V）RIP分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )在过度表达（S和U）或敲低（T和V）的Swan 71（S和T）或HTR-8/SVneo（U和V）细胞中，HuR蛋白降低PLD1 mRNA的相对水平lnc-HZ09型（W）生物素标记的HuR的代表性western blot分析lnc-HZ09型或下拉分析中Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中的PLD1 mRNA。（十）生物素标记的PLD1 mRNA在Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中过度表达或敲除的HuR的代表性western blot分析lnc-HZ09型在下拉分析中。（Y）生物素标记的HuR的代表性western blot分析lnc-HZ09型在下拉分析中PLD1过度表达或敲低的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中。这些条形图和图表的汇总数据显示在Excel表S1中。在所有mRNA稳定性分析中，NC或载体组的表达水平设置为“1”；在所有ChIP和RIP分析中，IgG降低的DNA或RNA水平分别设置为“1”；在所有western blot分析中，NC或Vector组的条带强度设置为“100”。C、 D、G、L、W–Y显示了三个独立实验的代表性数据。（E–F、H–K、M–V）中的数据显示 $意思是 \pm 标准偏差$ 三个独立实验的结果。双尾学生的 $t吨$ -测试（E–F、H–I、O–V）* $lowercase italic p less than 0.05$ , ** $lowercase italic p less than 0.01$ 注：BPDE，苯并（a）芘-7,8-二氢二醇-9,10-环氧；ChIP，染色质免疫沉淀；GADPH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；HC，健康对照；HuR，HuR过度表达；HZ09，过度表达lnc-HZ09型; NC，siRNA阴性对照；ns，无显著性；PLD1、磷脂酶D水解物1；RIP、RNA免疫沉淀；RM，反复流产；SD，标准偏差；si-HuR，击倒HuR；si-SP1，击倒SP1；SP1，SP1过度表达；载体，pcDNA3.1的空载体；si-HZ09，击倒lnc-HZ09。

随后，在人类滋养层细胞中探索了该途径的功能。PLD1过度表达的细胞（Swan 71和HTR-8/SVneo）的RAC1和CDC42蛋白水平较高，而PLD1敲除的细胞RAC1和CDM42蛋白水平较低（图S2B-E）。此外，PLD1过度表达的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭较少，而PLD1敲除的细胞迁移和侵入较大（图S2F-I）。随后lnc-HZ09型进一步探讨了该途径的调控。PLD1、RAC1和CDC42的mRNA和蛋白表达水平在lnc-HZ09型-过度表达的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞，在lnc-HZ09型-沉默细胞与相关对照(图2C; S3A–B）。

lnc-HZ09对人滋养层细胞SP1介导的PLD1 mRNA转录的影响

接下来我们探讨了如何lnc-HZ09型调节PLD1表达。首先，如何lnc-HZ09型研究了受影响的PLD1 mRNA转录。有报道称SP1作为一种转录因子促进肝细胞中PLD1 mRNA的转录。⁴³根据PROMO软件分析，SP1可能识别PLD1的启动子序列（图S4）。实验上，SP1过度表达的Swan 71和HTR-8/SVneo细胞的PLD1 mRNA和蛋白表达水平较高，而SP1敲除的细胞的PLD1 mRNA和蛋白质表达水平较低(图2D，S3C–G）。SP1 ChIP分析进一步证实SP1可以与PLD1启动子区结合(图2E-F)表明SP1可能作为转录因子促进人类滋养层细胞中PLD1的转录。此外，过度表达lnc-HZ09型较低，而细胞lnc-HZ09型敲除具有较高的SP1 mRNA和蛋白质水平(图2G; 图S3H）。SP1 ChIP分析进一步显示，lnc-HZ09过度表达的细胞具有更大的表达量，而lnc-HZ09型PLD1启动子区SP1的占有率较低(图2H，I; 图S3J，K）。总的来说，这些结果支持lnc-HZ09型可能抑制SP1介导的PLD1 mRNA转录。

lnc-HZ09对人滋养层细胞PLD1 mRNA稳定性的影响

随后，我们进一步调查了lnc-HZ09型可能影响PLD1 mRNA的稳定性。对于Swan 71和HTR-8/SVneo电池，lnc-HZ09型-过度表达的细胞较低，而lnc-HZ09型-沉默细胞具有较高的PLD1 mRNA稳定性(图2J、K). 作为控制，变更lnc-HZ09型未影响两种细胞中GAPDH的mRNA稳定性（图S5A、B）。

据报道，HuR是一种RNA结合蛋白，可以与含有AUUU特异序列的RNA结合，提高其RNA稳定性。⁴⁴在此，我们探讨了HuR蛋白是否能促进人类滋养层细胞中PLD1 mRNA的稳定性。我们发现，在Swan 71和HTR-8/SVneo细胞中，HuR过表达的细胞具有更高的水平，而HuR敲低的细胞具有更低的PLD1 mRNA和蛋白质水平(图2L; S5C–F）。同样，HuR过表达细胞具有较高的mRNA稳定性，而HuR敲低的细胞具有较低的mRNA稳定(图2M，N). 作为对照，HuR的改变并不影响两个细胞中GAPDH mRNA的稳定性（图S5G，H）。此外，HuR过度表达的细胞表现得更大，而HuR敲除的细胞表现出更少的迁移和侵袭（图S5I-L）。值得注意的是lnc-HZ09型不影响两个滋养层细胞中HuR的蛋白水平（图S5M，N）。

因为HuR是一种RNA结合蛋白，HuR是否可以与lnc-HZ09型或在人滋养层细胞中检测PLD1 mRNA。RIP分析表明，HuR蛋白可下调Swan 71和HTR-8/SVneo细胞中PLD1 mRNA和lnc-HZ09的表达(图2O–R). 此外，具有lnc-HZ09型在这两种细胞中，过度表达的PLD1 mRNA水平较低，这些mRNA被HuR蛋白抑制，而lnc-HZ09型敲除后两个细胞中PLD1 mRNA水平较高，被HuR蛋白敲除(图2S–V). RNA下拉分析进一步证实，生物素标记的HuR蛋白可以被下拉lnc-HZ09型或PLD1 mRNA，但不是通过其反义RNA(图2W). 此外，过度表达lnc-HZ09型被生物素标记的PLD1 mRNA下调的HuR蛋白水平较低，而lnc-HZ09型具有较高水平的HuR蛋白，这些蛋白被生物素标记的PLD1 mRNA所降低(图2X). 类似地，PLD1过度表达的细胞被生物素标记的lnc-HZ09拉下的HuR蛋白水平较低，而PLD1敲下的细胞则被生物素标签的lnc-Hz拉下的HuR蛋白水平较高lnc-HZ09型(图2Y).

MSX1在人滋养层细胞lnc-HZ09转录中的调控作用

接下来，我们探讨了监管的内容lnc-HZ09型人类滋养层细胞中的表达水平。首先，转录lnc-HZ09型进行了研究。据报道，MSX1是一种促进小鼠成肌细胞C2C12中成纤维细胞生长因子9 mRNA转录的转录因子。⁴⁵如PROMO软件所示，MSX1可能识别lnc-HZ09型（图S6）。实验上，在Swan 71和HTR-8/SVneo细胞中，MSX1过度表达的细胞具有较高的表达水平lnc-HZ09型而那些MSX1基因敲除的人表达水平较低lnc-HZ09型(图3A–B; 图S7A）。此外，MSX1-ChIP分析表明MSX1可以与lnc-HZ09型(图3C、D)表明MSX1可能作为转录因子促进lnc-HZ09型转录。

图3A、3B、3I、3J是标题为Swan 7、H T R-8或SVneo、Swan 71和H T R-8或SVneo的条形图，绘制了核糖核酸相对表达，范围为0.0至2.0，增量为0.5，0.0至2.0，增量为0.5，0.0至1.0，增量为0.5，75至85，增量为5；0.0至1.0，在载体、同源框蛋白M S X-1、阴性对照、si1-同源框蛋白MSX-1和si2-同源框蛋白MS X-1上以0.5和75至90为增量，以5（y轴）为增量；载体、同源盒蛋白M S X-1、阴性对照、si1-同源盒蛋白MSX-1和si2-同源盒蛋白MS X-1；载体，m（6）A甲基转移酶，阴性对照，si1-m（6；Inc-HZ 09的载体、m（6）A甲基转移酶、阴性对照、si1-m（6。图3C和3D是条形图，标题为Swan 71中的染色质免疫沉淀，H T R-8或SVneo中的染色素免疫沉淀，分别绘制了Inc-HZ 09启动子相对折叠富集，范围从0到4，单位增量（y轴）穿过抗免疫球蛋白G和抗同源框蛋白M S X-1（X轴）。图3E和3F是条形图，标题为Swan 71中甲基化RNA免疫沉淀测序和H T R-8或SVneo中甲基化RNA-免疫沉淀测速，绘制了N6-甲基腺苷相对折叠富集，范围从0到6，在Inc-X非活性特异性转录物和Inc-HZ 09（X轴）中以2（y轴）为增量分别用于抗免疫球蛋白G和抗N 6-甲基腺苷。图3G和3H分别是一组两个聚类条形图，标题分别为Swan 71中的甲基化RNA免疫沉淀测序和H T R-8或SVneo中的甲基化RNA免疫沉淀序列，绘制了Inc-HZ 09 m（6）a甲基转移酶相对折叠富集，范围从0到10，增量为5（y轴）载体的抗免疫球蛋白G和抗N-6-甲基腺苷（x轴），m（6）A甲基转移酶，si1-m（6。图3K和3L是标题为Swan 71中甲基化RNA免疫沉淀测序和H T R-8或SVneo中甲基化RNA免疫沉淀测速的聚类图，绘制了Inc-HZ 09 m（6）甲基转移酶相对富集倍数，范围从0到6，增量为2（y轴）通过抗免疫球蛋白G和抗N 6-甲基腺苷（x轴）分别用于二甲基亚砜和二丙酮醇。图3M和3N是二甲基亚砜、二丙酮醇、载体、甲基化RNA免疫沉淀测序的条形图、Inc-HZ 09核糖核酸相对折叠富集度，范围从0.0到1.0，增量为0.5，单位增量为0到3（y轴），跨越天鹅71和H T R-8或SVneo x轴），甲基化RNA免疫沉淀测序加双丙酮醇。图3O是一组名为Swan 71的双线图，绘制了Inc-HZ 09核糖核酸剩余量，范围从0.0到1.0，增量为0.5（y轴），跨时间（小时），范围从0到5，增量为单位（x轴），用于甲基化RNA免疫沉淀测序，甲基化RNA免疫沉淀测序加双丙酮醇，载体，载体加二甲基亚砜。图3P是一组两个名为Swan 71的西方印迹。在左侧，western blot显示100、36、183和117（列）和磷脂酶D1、3-磷酸甘油醛脱氢酶、载体、甲基化RNA免疫沉淀测序、二甲基亚砜和二丙酮醇（行）。在右侧，western blot显示阴性对照（100）和硅甲基化RNA免疫沉淀测序（239）（列）以及磷脂酶D1和3-磷酸甘油醛脱氢酶（行）。

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图3。

人类滋养层细胞中lnc-HZ09的表达水平受MSX1和m6A RNA甲基化的调节。（A–B）RT-qPCR分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )的级别lnc-HZ09型在过度表达或敲除MSX1的Swan 71（A）或HTR-8/SVneo（B）细胞中。（C–D）MSX1 ChIP分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )MSX1在lnc-HZ09型在Swan 71（C）或HTR-8/SVneo（D）细胞中。（E–F）MeRIP分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )lnc-XIST或lnc-HZ09型在Swan 71（E）或HTR-8/SVneo（F）细胞中。（G–H）MeRIP分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )m6A RNA甲基化水平lnc-HZ09型METTL3过度表达或敲除的Swan 71（G）或HTR-8/SVneo（H）细胞中。（I–J）RT-qPCR分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )的水平lnc-HZ09型METTL3过度表达或敲低的Swan 71（I）或HTR-8/SVneo（J）细胞。（K–L）MeRIP分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )m6A RNA甲基化水平lnc-HZ09型DAA处理的Swan 71（K）或HTR-8/SVneo（L）细胞。（M） RT-qPCR分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )的级别lnc-HZ09型用DAA处理Swan 71或HTR-8/SVneo细胞。（N） RT-qPCR分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )的水平lnc-HZ09型在Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中，METTL3过表达或METTL3+DAA处理过表达。（O） RNA稳定性（每个 $lowercase italic n equals 3$ )第页，共页lnc-HZ09型在Swan 71细胞中，METTL3过度表达或被击倒，或METTL3+DAA治疗过度表达。（P） METTL3过表达或敲除，或METTL3+DAA处理的Swan 71细胞中PLD1蛋白水平的代表性western blot分析，以GAPDH为内部标准。每个波段的相对强度被量化 $意思是 \pm 标准偏差$ 图S7F显示了三个重复的。这些条形图和图表的汇总数据显示在Excel表S1中。在所有RT-qPCR和mRNA稳定性检测中，NC或载体组的表达水平均设为“1”；在所有ChIP和MeRIP分析中，IgG降低的DNA或RNA水平设置为“1”；在所有western blot分析中，NC或Vector组的条带强度设置为“100”。（P）显示了三个独立实验的代表性数据。（A–O）中的数据显示 $意思是 \pm 标准偏差$ 三个独立实验的结果。双尾学生的 $t吨$ -测试（A–M）；（A，B，I，J，N）的单因素方差分析* $lowercase italic p less than 0.05$ , ** $lowercase italic p less than 0.01$ 、和*** $lowercase italic p less than 0.001$ 注：方差分析，方差分析；ChIP，染色质免疫沉淀；DAA，3-去氮腺苷；GADPH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；IgG、免疫球蛋白G；甲基化RNA免疫沉淀；METTL3，METTL3的过度表达；MSX1，MSX1的过度表达；NC，siRNA阴性对照；ns，无显著性；PLD1，磷脂酶D水解物1；RT-qPCR，定量逆转录聚合酶链反应；SD，标准偏差；si-METTL3，击倒METTL3；si-MSX1，击倒MSX1；向量，pcDNA3.1的空向量。

METTL3介导的m6A RNA甲基化对人滋养层细胞lnc-HZ09稳定性的影响

随后，lnc-HZ09型研究了RNA的稳定性。研究表明，对lncRNA进行m6A修饰可能会调节lncRNA的稳定性。⁴⁶M6A改造现场（5′-GGACU-3′⁴¹)在中识别lnc-HZ09型使用SRAMP软件进行排序（表S11）。随后，MeRIP分析证实了m6A RNA修饰在lnc-HZ09型(图3E、F). 含有m6A RNA修饰的LncRNA XIST⁴⁷作为阳性对照。

METTL3是一种重要的RNA甲基转移酶，在RNA上产生m6A RNA甲基化。⁴⁸在此，在Swan 71和HTR-8/SVneo细胞中，METTL3过度表达的细胞在lnc-HZ0型9，而METTL3基因敲除的细胞m6A RNA修饰水平较低lnc-HZ0型9 (图3G，H; 图S7B）和表达水平lnc-HZ09型(图3I，J)分别通过MeRIP分析和RT-qPCR分析确定。添加3-去氮腺苷（DAA），m6A RNA甲基化抑制剂，⁴⁹导致上的m6A修改水平降低lnc-HZ09型(图3K、L)和更低lnc-HZ09型表达水平(图3M). 此外lnc-HZ09型由于METTL3的过度表达，DAA的加入使其减少(图3N). 此外，RNA稳定性分析也表明，在Swan 71和HTR-8/SVneo细胞中，过度表达METTL3的细胞lnc-HZ09型稳定性，而METTL3敲低的细胞lnc-HZ09型稳定性(图3O; S7C）。作为对照，METTL3的改变不影响两种细胞中GAPDH mRNA的稳定性（图S7D，E）。此外lnc-HZ09型用DAA处理滋养层细胞会降低METTL3过度表达的稳定性(图3O; 图S7C）。

随后，还探讨了METTL3对PLD1表达水平和滋养层细胞功能的影响。在Swan 71和HTR-8/SVneo细胞中，METTL3过表达细胞的PLD1蛋白水平较低，而METTL4被敲除或经DAA处理的细胞PLD1蛋白质水平较高(图3P; 图S7F–H）。此外，METTL3过度表达的细胞迁移和侵袭较少，用DAA处理细胞可以减轻这种影响（图S7I）。相反，METTL3敲低的细胞具有更大的迁移和侵袭（图S7J）。

lnc-HZ09通过PLD1/RAC1/CDC42途径对BPDE暴露的人滋养层细胞迁移和侵袭的影响

为了揭示BPDE影响人类滋养层细胞迁移和侵袭的潜在机制lnc-HZ09型在BPDE暴露的滋养层细胞中研究PLD1/RAC1/CDC42通路。首先，我们发现该PLD1/RAC1/CDC42通路成员的mRNA和蛋白质的表达水平均较低(图4A; 图S8A–D），而lnc-HZ09型都比较高(图1A–B)随着BPDE处理的Swan 71或HTR-8细胞中BPDE浓度的增加。在BPDE处理的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中，那些过度表达lnc-HZ09型迁移和侵袭较少，而细胞lnc-HZ09型有更大的迁移和入侵(图4B–E; 图S8E–F）。在PLD1/RAC1/CDC42通路中，mRNAs和蛋白质水平均低于lnc-HZ09型过度表达，并且lnc-HZ09型BPDE处理的两种滋养层细胞的敲除(图4F; 图S8G–N）。

图4A是一组两个western blot，分别在Swan 71下显示100、85、73、1和17，在H T R-8或SVneo（列）下显示100，80，61，22和11，在磷脂酶D1，Ras-related C3肉毒杆菌毒素底物1，细胞分裂控制蛋白42同源物，3-磷酸甘油醛脱氢酶（行）下显示。苯并（a）芘二醇环氧化合物的摩尔范围为0至1.5，增量为0.5。图4B是名为苯并（a）芘二醇环氧处理的Swan 71的染色组织，显示了载体和HZ 09（列）以及迁移和入侵（行）。图4C是名为苯并（a）芘二醇环氧处理的Swan 71的染色组织，显示阴性对照、si1-HZ 09和si2-HZ 09（列）以及迁移和侵袭（行）。图4D是标题为苯并（a）芘二醇环氧化物处理的H T R-8或SVneo的染色组织，显示载体和HZ 09（列）以及迁移和侵袭（行）。图4E是标题为苯并（a）芘二醇环氧化物处理的H T R-8或SVneo的染色组织，显示阴性对照、si1 HZ 09和si2 HZ 09（列）以及迁移和侵袭（行）。图4F是一组名为苯并（a）芘二醇环氧处理的两个western blot，显示载体（100）、HZ 09（72）、阴性对照（100），si1-HZ 09[187]、si2-HZ 09[219]和载体（100，Ras相关C3肉毒杆菌毒素底物1、细胞分裂控制蛋白42同源物和3-磷酸甘油醛脱氢酶（行）。图4G是一个western blot，显示100、93、86、28和15（列）以及特异性蛋白1和3-磷酸甘油醛脱氢酶，分别位于Swan 71和H T R-8或SVneo（行）下。苯并（a）芘二醇环氧化合物的摩尔范围为0至1.5，增量为0.5。图4H、4I、4J、4K、4Q、4R、4T、4V是簇状条形图，Swan 71中的染色质免疫沉淀，H T R-8或SVneo中的染色素免疫沉淀，苯并（a）芘二醇环氧化物处理的Swan 71的染色质免疫沉淀，苯并芘二醇环氧化物处理的H T R-8或SVnee中的染色蛋白免疫沉淀，苯并（a）芘二醇环氧处理的Swan 71中的受体相互作用蛋白，苯并（b）芘二元醇环氧处理的H T R-8或SVneo中的受体交互作用蛋白，Swan 71的染色质免疫沉淀，Swan 71中的甲基化RNA免疫沉淀测序，绘制磷脂酶D1启动子相对折叠富集图，磷脂酶D1启动子相对折叠富集，单位增量从0到4，磷脂酶D2启动子的相对折叠富集，信使核糖核酸相对表达，以2为增量从0到4不等，信使核糖核酸相对表达量，以2的增量从0至4不等，lnc-HZ09启动子相对折叠富集，以2递增从0到8不等，以及lnc-HZ09信使核素核酸相对折叠富集，范围从0到10，在抗免疫球蛋白G和抗特异性蛋白1、抗免疫球素G和抗特异性蛋白1、抗免疫球蛋白G和抗特异性蛋白1，抗免疫球蛋白质G和抗特殊性蛋白1以及抗免疫球蛋白酶G和抗人类抗原R之间以5（y轴）为增量，分别针对二甲基亚砜、苯并（a）芘二醇环氧化物、载体和HZ 09的抗免疫球蛋白G和抗人类抗原R、抗免疫球素G和抗同源框蛋白MSX-1以及抗免疫球蛋白质G和抗N6-甲基腺苷（x轴）。图4L、4M、4O分别为标题为苯并（a）芘二醇环氧化物处理的Swan 71、苯并（a）芘二醇环氧化物处理的H T R-8或SVneo和苯并（a）芘二醇环氧化物处理的Swan 71的两组折线图，绘制了在时间（小时）内以0.5（y轴）增量从0.0到1.0的剩余磷脂酶D1信使核糖核酸，Vector、HZ 09、Si1,2 HZ 09，阴性对照和人类抗原R的单位增量（x轴）范围分别为0至5。图4N是一个名为苯并（a）芘二醇环氧化物处理的西方印迹，显示载体（100）、HZ 09（134）、阴性对照（100），si1-HZ 09、si2-HZ 09和磷脂酶D1以及小写的β-微管蛋白，分别位于Swan 71和H T R-8或SVneo下（行）。图4P是一个蛋白质印迹，显示100、92、83、45和23（列）以及人类抗原R和3-磷酸甘油醛脱氢酶，分别位于Swan 71和H T R-8或SVneo（行）下。苯并（a）芘二醇环氧化合物的摩尔范围为0至1.5，增量为0.5。图4S是一个western blot，显示100、156、198、216和374（列）以及Homeobox蛋白MSX-1和甘油醛3-磷酸脱氢酶，分别位于Swan 71和H T R-8或SVneo（行）下。苯并（a）芘二醇环氧化合物的摩尔范围为0至1.5，增量为0.5。图4U是一个western blot，显示100、113、187、173和219（柱）和m（6）a甲基转移酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶，分别位于Swan 71和H T R-8或SVneo（行）下。苯并（a）芘二醇环氧化合物的摩尔范围为0至1.5，增量为0.5。图4W和4X是标题为Swan 71、Lnc-HZ09信使核糖核酸剩余量的折线图，增量为0.5，范围从0.0到1.0；磷脂酶D1信使核酸剩余量，在时间（小时）内增量为0.5（y轴），范围从0.05到1.0，单位增量为0到5（x轴）。

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图4。

lnc-HZ09调控BPDE暴露的人类滋养层细胞中的PLD1/RAC1/CDC42通路。（A）以GAPDH为内标，对BPDE处理的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中PLD1、RAC1和CDC42的蛋白质水平进行代表性蛋白质印迹分析。对每个条带的相对强度进行量化 $意思是 \pm 标准偏差$ 图S8A，B显示了三个重复的迁移和入侵。（B–E） $0.5 micromolar$ BPDE诱导的Swan 71（B和C）或HTR-8/SVneo（D和E）细胞过度表达或敲除lnc-HZ09型（比例尺， $200 micrometers$ ). （F） SP1、PLD1、RAC1和CDC42蛋白水平的代表性western blot分析 $0.5 micromolar$ BPDE诱导的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞过度表达或敲除lnc-HZ09型以GAPDH为内部标准。每个波段的相对强度被量化 $意思是 \pm 标准偏差$ 图S8G–J显示了三个重复中的一个。（G）以GAPDH为内标物，对BPDE处理的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中SP1蛋白水平进行代表性western blot分析。对每个条带的相对强度进行量化 $意思是 \pm 标准偏差$ 图S8O显示了三个重复的。（H–I）SP1 ChIP分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )未经处理或 $0.5 micrometer$ BPDE处理的Swan 71（H）或HTR-8/SVneo（I）细胞。（J–K）SP1 ChIP分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )SP1在PLD1基因启动子区的相对富集 $0.5 micrometer$ BPDE诱导的Swan 71（J）或HTR-8/SVneo（K）细胞过度表达lnc-HZ09型（L–M）PLD1的mRNA稳定性（每个 $lowercase italic n equals 3$ )英寸 $0.5 micrometer$ BPDE诱导的Swan 71（L）或HTR-8/SVneo（M）细胞过度表达或敲除lnc-HZ09型（N）PLD1蛋白水平的代表性western blot分析 $0.5 micrometer$ BPDE诱导Swan 71或HTR-8/SVneo细胞过度表达或敲除HuR $β -微管蛋白$ 作为内部标准。每个波段的相对强度被量化 $意思是 \pm 标准偏差$ 图S9C显示了三个重复的。（O） PLD1的mRNA稳定性（每个 $lowercase italic n equals 3$ )英寸 $0.5 micrometer$ BPDE诱导Swan 71细胞过度表达或抑制HuR。（P） HuR蛋白水平的代表性western blot分析 $0 to 1.5 micrometers$ BPDE处理的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞，带有 $β -微管蛋白$ 作为内部标准。每个波段的相对强度被量化 $意思是 \pm 标准偏差$ 图S9H显示了三个重复的。（Q–R）RIP分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )被HuR蛋白下调的PLD1 mRNA相对水平 $0.5 micrometer$ BPDE处理的Swan 71（Q）或HTR-8/SVneo（R）细胞lnc-HZ09型（S）MSX1蛋白水平的代表性western blot分析 $0 to 1.5 micrometers$ BPDE处理的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞，以GAPDH作为内部标准。每个波段的相对强度被量化 $意思是 \pm 标准偏差$ 图S9L显示了三个重复的。（T） MSX1 ChIP分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )MSX1在lnc-HZ09型未经处理或 $0.5 micrometer$ BPDE处理的Swan 71细胞。（U）以GAPDH为内标物，对BPDE处理的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中METTL3蛋白水平进行代表性western blot分析。对每个条带的相对强度进行量化 $意思是 \pm 标准偏差$ 图S9O显示了三个重复的。（五） MeRIP分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )m6A RNA甲基化的相对水平lnc-HZ09型未经处理或 $0.5 micrometer$ BPDE处理的Swan 71细胞。（W） RNA的稳定性lnc-HZ09型（每个 $lowercase italic n equals 3$ )未经处理或 $0.5 micrometer$ BPDE处理的Swan 71细胞。（十） PLD1的mRNA稳定性（每个 $lowercase italic n equals 3$ )未经处理或 $0.5 micrometer$ BPDE处理的Swan 71细胞。这些条形图和图表的汇总数据显示在Excel表S1中。在所有mRNA稳定性分析中，NC组或载体组的RNA水平均设为“1”；在所有ChIP、RIP和MeRIP分析中，IgG组的DNA或RNA水平设为“1”；在所有western blot分析中，NC或Vector组的条带强度设置为“100”。（A–G，N，P，S，U）显示了三个独立实验的代表性数据。（H–M、O、Q、R、T、V–X）中的数据显示 $意思是 \pm 标准偏差$ 三个独立实验的结果。双尾学生的 $t吨$ -测试（H–K、Q–R、T、V）* $lowercase italic p less than 0.05$ , ** $lowercase italic p less than 0.01$ 、和*** $lowercase italic p less than 0.001$ 注：BPDE，苯并（a）芘-7,8-二氢二醇-9,10-环氧；染色质免疫沉淀；甘油醛-3-磷酸脱氢酶；HuR，HuR过度表达；HZ09，过度表达lnc-HZ09型; IgG、免疫球蛋白G；甲基化RNA免疫沉淀；NC，siRNA阴性对照；ns，无显著性；PLD1，磷脂酶D水解物1；RIP、RNA免疫沉淀；SD，标准偏差；si HuR，HuR的击倒；si-HZ09，击倒lnc-HZ09型; 向量，pcDNA3.1的空向量。

lnc-HZ09对BPDE-Exposed人滋养层细胞PLD1 mRNA转录和mRNA稳定性的影响

怎么lnc-HZ09型在BPDE处理的滋养层细胞中进一步研究PLD1 mRNA转录的调节。BPDE处理的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中转录因子SP1的mRNA和蛋白水平较低(图4G; 图S8O–P）。SP1 ChIP分析表明，经BPDE处理后，SP1在PLD1启动子区的占有率均较低(图4H-I). 在BPDE处理的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中lnc-HZ09型过度表达的SP1 mRNA和蛋白水平较低，而lnc-HZ09型敲除具有较高的SP1 mRNA和蛋白质水平(图4F; 图S8G–J，Q–R）。此外，SP1 ChIP分析表明，在BPDE处理的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中，lnc-HZ09过表达的细胞在PLD1启动子区的SP1占有率较低，而在PLD1lnc-HZ09型PLD1启动子区SP1的占有率较高(图4J–K; 图S8S–T）。

此外lnc-HZ09型还研究了BPDE处理的滋养层细胞中PLD1 mRNA的稳定性。在BPDE处理的滋养层细胞中lnc-HZ09型有较低的，而细胞敲除lnc-HZ09型PLD1 mRNA稳定性更强(图4L–M). 作为控制，变更lnc-HZ09型未影响BPDE处理的两种细胞中GAPDH mRNA的稳定性（图S9A，B）。在BPDE处理的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中，HuR过度表达的细胞具有较高的PLD1 mRNA和蛋白质水平，而HuR敲除的细胞具有较低的PLD1mRNA和蛋白水平(图4N; 图S9C–F）。此外，BPDE处理的过表达HuR的Swan 71细胞也具有更大的PLD1 mRNA稳定性；BPDE处理的HuR敲除的Swan 71细胞PLD1 mRNA稳定性较差(图4O). 然而，HuR的改变并不影响GAPDH mRNA的稳定性（图S9G）。此外，经BPDE处理的细胞（Swan 71和HTR8/SVneo）HuR蛋白表达水平较低(图4P; 图S9H）。然而，HuR水平不受lnc-HZ09型在BPDE处理的滋养层细胞中（图S9I，J）。此外，过度表达lnc-HZ09型BPDE处理的滋养层细胞中，HuR蛋白降低了PLD1 mRNA的水平，而lnc-HZ09型在BPDE处理的滋养层细胞中，HuR蛋白降低了PLD1 mRNA的水平(图4Q、R; 图S9K，L），表明lnc-HZ09型与PLD1 mRNA竞争以与HuR结合。

BPDE-E暴露的人滋养层细胞lnc-HZ09转录和稳定性检测

随后，lnc-HZ09型研究了BPDE处理的滋养层细胞的转录。BPDE处理的滋养层细胞中MSX1的mRNA和蛋白水平较高(图4S; 图S9M，N）。ChIP分析显示MSX1在启动子区的占有率lnc-HZ09型在BPDE处理的Swan 71或HTR-8/SVneo细胞中更大(图4T; 图S9O）。

最后，lnc-HZ09型还研究了BPDE处理的滋养层细胞的稳定性。METTL3的mRNA和蛋白水平(图4U; 图S9P，Q）以及m6A RNA甲基化水平lnc-HZ0型9 (图4V; 图S9R），在BPDE处理的滋养层细胞中均较高。Lnc-HZ0公司9在BPDE处理的Swan 71细胞中，RNA的稳定性更强，而PLD1 mRNA的稳定性则更低(图4W、X). 作为对照，BPDE治疗不会影响GAPDH mRNA的稳定性（图S9S，T）。

RM绒毛组织中lnc-HZ09与PLD1/RAC1/CDC42通路的相关性

了解lnc-HZ09型在滋养层细胞中，进一步探讨了其在绒毛组织中的作用。我们从未解释的RM组和匹配的健康对照组（每组）收集绒毛组织样本 $lowercase italic n equals 15$ ). RM组和HC组之间的参数，如体重指数、年龄、孕日，没有显示出显著差异（表S12）。然而，RM组的BPDE-DNA加合物水平显著高于HC组（表S12；图S10A）。我们还发现lnc-HZ09型与HC组相比，RM组显著高表达(图5A)这种趋势与BPDE处理的人类滋养层细胞中观察到的趋势一致，表明lnc-HZ09型可能同时调节BPDE诱导的人类滋养层细胞功能异常和流产的发生。RM组织中PLD1/RAC1/CDC42的mRNA和蛋白水平均低于HC组织(图5B、C; 图S10B，C）。相关分析表明，PLD1、RAC1和CDC42水平均与lnc-HZ09型在RM组织中(图5D、E; 图S10D–G）。HC组和RM组中大多数数据点的位置相对分离，表明该途径受到差异调节。

图5A、5B、5F、5N是标题为Inc-HZ 09的误差条形图，磷脂酶D1信使核糖核酸，特异性蛋白1，m（6）A甲基转移酶，绘制核糖核酸相对表达，单位增量范围为0至3，核糖核酸相关表达，单位增长范围为0到2，信使核糖核酸相对表达（单位增量为0至2）和信使核糖核酸相对表达（跨H C和R M（x轴）分别为5（y轴）增量为0到10）。图5D、5E、5G、5I、5M是标题为磷脂酶D1信使核糖核酸-Inc-HZ 09、磷脂酶D1蛋白质-Inc-HZ09、磷化酶D1蛋白质-特异性蛋白质1蛋白质、特异性蛋白质1-IncHZ 09、In HZ 09-同源框蛋白MSX-1蛋白质的图，绘制磷脂酶D2信使核核酸相对表达，范围从0.0到2.5，增量为0.5；磷脂酶D1蛋白相对表达，从0到300，增量为100；磷脂酶D_1蛋白相对表示，从0至800，增量为200；特异性蛋白1蛋白相对表达量，增量为0至200；同源框蛋白MSX-1蛋白相对表示，在Inc-HZ 09相对表达式中，范围从0到250，增量为200（y轴），单位增量为0到4；Inc-HZ 09相对表达，范围从0.5到2.5，增量为0.5；特异性蛋白1蛋白相对表达，范围从0到250，增量为50；Inc-HZ 09相对表达，以0.5为增量从0.5到2.5，HZ 09的相对表达，分别以0.5（x轴）为增量从0.0到2.5。图5C是一组两个western blots。在顶部，western blot在H C下显示124、147、89、100、163，在R M（列）下显示94、36、21、92、24，以及特异性蛋白1、磷脂酶D1、Ras-related C3肉毒杆菌毒素底物1、细胞分裂控制蛋白42同源物和3-磷酸甘油醛脱氢酶（行）。在底部，H C下为73、193、96、125、159，P M下为14、19、23、148、100（列），特异性蛋白1、磷脂酶D1、Ras-related C3肉毒杆菌毒素底物1、细胞分裂控制蛋白42同源物和3-磷酸甘油醛脱氢酶（列）。图5H、5L、5O是一个聚集条形图，组织中染色质免疫沉淀、组织中染色素免疫沉淀和组织中甲基化RNA免疫沉淀测序，绘制磷脂酶D1启动子相对折叠富集，范围从0到4，增量为2；Inc-HZ 09启动子相对折叠富集，范围为0至6，增量为2，Inc-HZ09 m（6）A甲基转移酶相对折叠富集范围为0到9，跨抗免疫球蛋白G和抗特异性蛋白1，抗免疫球蛋白质G和同源框蛋白MSX-1，H C和R M分别为抗免疫球蛋白G和抗N6-甲基腺苷（x轴）。图5K是一组两个western blots。在左侧，western blot在H C下显示196、153、108、100、93，在R M（列）下显示21、46、130、31、87，在人类抗原R、同源框蛋白MSX-1、M（6）A甲基转移酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶（列）中显示。右侧为92、100、126、131、149（H C）和74、79、43、25、98（R M）（列）以及人类抗原R、同源框蛋白MSX-1、M（6）A甲基转移酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶（列）。

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图5。

lnc-HZ09在人类绒毛组织中的调节作用。（A–B）RT-qPCR分析lnc-HZ09型（A）或PLD1 mRNA（B）在HC（健康对照，圆形）和RM（反复流产，方形）组织中的表达 $lowercase italic n equals 15$ ). （C） HC和RM组织中SP1、PLD1、RAC1和CDC42蛋白水平的蛋白质印迹分析（每个 $lowercase italic n equals 10$ )，以GAPDH作为内部标准。每个波段的相对强度被量化，其水平如图S10C所示。（D） PLD1 mRNA水平与lnc-HZ09型HC（圆形）和RM（方形）组织中的水平（每个 $lowercase italic n equals 15$ ). （E） PLD1蛋白水平与lnc-HZ09型HC（圆形）和RM（方形）组（每个组 $lowercase italic n equals 10$ ). （F） RT-qPCR分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )HC（圆形）和RM（方形）组织中SP1的mRNA水平 $lowercase italic n equals 15$ ). （G） HC（圆形）和RM（方形）组（每个组）中PLD1和SP1蛋白水平的相关性 $lowercase italic n equals 10$ ). （H）在HC和RM组织中PLD1基因启动子区SP1相对富集的SP1 ChIP测定分析（每个 $lowercase italic n equals 6$ ). （一） SP1蛋白水平与lnc-HZ09型HC（圆形）和RM（方形）组（每个组 $lowercase italic n equals 10$ ). （J） HC和RM组织MSX1 mRNA水平的RT-qPCR分析 $lowercase italic n equals 15$ ). （K） HC和RM组织中HuR、MSX1和METTL3蛋白水平的Western blot分析 $lowercase italic n equals 10$ )以GAPDH为内部标准。每个谱带的相对强度被量化，其水平如图S10H，J，K所示lnc-HZ09型HC和RM组织（每个 $lowercase italic n equals 6$ ). （M） lnc-HZ09型HC（圆形）和RM（方形）组（每个组）MSX1的蛋白质水平 $lowercase italic n equals 10$ ). （N） RT-qPCR分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )HC和RM组织中METTL3的mRNA水平（每个组织 $lowercase italic n equals 15$ ). （O） MeRIP分析（每个 $lowercase italic n equals 3$ )m6A RNA甲基化水平lnc-HZ09型HC和RM组织（每个 $lowercase italic n equals 6$ ). 这些条形图和散点图的汇总数据显示在Excel表S1中。在所有ChIP和MeRIP分析中，IgG组的DNA或RNA水平设置为“1”，在所有western blot分析中，中间强度值设置为“100”。（C–E，G，I，K，M）显示了三个独立实验的代表性数据。（H，L，O）中的数据显示 $意思是 \pm 标准偏差$ 六个独立实验的结果。双尾学生的 $t吨$ -测试（A–B、F、H、J、L、N–O）；皮尔逊分析（D，E，G，I，M）* $lowercase italic p less than 0.05$ , ** $lowercase italic p less than 0.01$ ，以及*** $lowercase italic p less than 0.001$ 注：ChIP，染色质免疫沉淀；GADPH；甘油醛-3-磷酸脱氢酶；健康对照组；IgG、免疫球蛋白G；甲基化RNA免疫沉淀；n、生物独立样本的数量；ns，无显著性；PLD1，磷脂酶D水解物1；RM，反复流产组。

lnc-HZ09对RM绒毛组织PLD1 mRNA转录和mRNA稳定性的影响

随后lnc-HZ09型在绒毛组织中研究PLD1 mRNA转录。与HC组织相比，RM组织中PLD1及其转录因子SP1的mRNA和蛋白水平均较低(图5B、C、F; 图S10C）。RM组织中PLD1和SP1水平呈正相关(图5G). SP1 ChIP分析表明，与HC组织相比，RM组织中SP1在PLD1启动子区的占有率较低(图5H)表明SP1介导的PLD1转录在RM组织中受到抑制。此外lnc-HZ09型与RM组织中SP1水平呈负相关(图5I).

那么lnc-HZ09型还研究了绒毛组织中PLD1 mRNA的稳定性。与HC组织相比，RM组织中的HuR水平较低(图5K; 图S10H）。RM组织中HuR和PLD1的蛋白水平呈正相关（图S10I）。

RM组织中lnc-HZ09转录和RNA稳定性的测定

在组织中，RM组织中MSX1的mRNA和蛋白水平高于HC组织(图5J、K; 图S10J）。MSX1-ChIP测定显示MSX1在lnc-HZ09型与HC组织相比，RM组织中的含量更高(图5L). MSX1水平与lnc-HZ09型在RM组织中(图5M).

Lnc-HZ09号还研究了绒毛组织的稳定性。METTL3的mRNA和蛋白水平(图5K，N; 图S10K），以及m6A RNA甲基化水平lnc-HZ09型(图5O)RM组织中的，均高于HC组织中的。METTL3水平与lnc-HZ09型在RM组织中（图S10L）。

B（a）P诱导流产小鼠胎盘组织中Sp1介导的Pld1 mRNA转录的评估

研究B（a）P导致流产的机制体内，我们用0、0.05或 $0.2 milligram per kilogram$ B（a）P诱发流产，如前所述。^28,29,31考虑到B（a）P在生物体内代谢为BPDE，我们直接用B（a”P治疗小鼠。序列比对后，我们发现人类、恒河猴、大象、狗和小鼠的PLD1、RAC1、CDC42和SP1基因在进化上是保守的（图S11A–D；表S13），这意味着这种迁移和入侵途径可能在这些物种中是保守的。然而，lnc-HZ09型该序列仅在人类和恒河猴中保存，但在小鼠中未保存（图S11E）。使用这种流产模型，我们发现随着B（a）P浓度的增加，小鼠胎盘组织中Pld1、Rac1和Cdc42的mRNA和蛋白水平均降低(图6A–C、E; 图S11F）。这种变化趋势与BPDE处理的人类滋养层细胞和RM组织中的变化趋势一致。

图6A至6D是误差条形图，绘制信使核糖核酸的相对表达，范围从0.0到1.0，增量为05；0.0至1.0，增量为0.5；磷脂酶D1、Ras-related C3肉毒杆菌毒素底物1、细胞分裂控制蛋白42同源物、，特异性蛋白1。图6E是一组两个western blot，绘制了特异性蛋白1、磷脂酶D1、Ras-related C3肉毒杆菌毒素底物1、细胞分裂控制蛋白42同源物和生物膜相关蛋白的3-磷酸甘油脱氢酶（行）（毫克/千克），范围从0到0.05，增量为0.05；0.05到0.2，增量为0.15（列）。图6F是一个名为组织中染色质免疫沉淀的聚类条形图，绘制磷脂酶D1启动子相对折叠富集，范围从0到6，在0和生物膜相关蛋白的抗免疫球蛋白G和抗特异性蛋白1（x轴）中以2（y轴）为增量。图6H是包含八个步骤的示意流程图。步骤1：生物膜相关蛋白或苯并（a）芘二醇环氧化合物与Msh Homeobox 1相互作用以激活启动子和转录，生物膜相关蛋白质或苯并。甲基转移酶导致Inc-HZ09。步骤2：苯并（a）芘二醇环氧化合物将滋养层细胞暴露于Inc-HZ09（不同程度）导致降解。步骤3：Inc-HZ09和特异性蛋白1的相互作用导致启动子和转录。步骤4：启动子和转录导致磷脂酶D1信使核糖核酸。步骤5：信使核糖核酸导致磷脂酶D1、Ras-related C3肉毒杆菌毒素底物1或细胞分裂控制蛋白42同源物。步骤6：磷脂酶D1或Ras-related C3肉毒杆菌毒素底物1或细胞分裂控制蛋白42同源物有助于入侵和迁移。第七步：入侵和迁移导致了误航。步骤8：磷脂酶D1信使核糖核酸（或多或少）导致降解。图6G是一个名为磷脂酶D1蛋白相对表达的图表，在特异性蛋白1蛋白相对表达（x轴）中以50（y轴）为增量从0到150不等。

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图6。

BaP诱导流产小鼠胎盘组织中的Pld1/Rac1/Cdc42通路。（A–D）RT-qPCR分析每个B（A）P处理小鼠组（每个组）中Pld1（A）、Rac1（B）、Cdc42（C）和Sp1（D）的mRNA水平 $lowercase italic n equals 8$ ). （E）每个B（a）P处理小鼠组（每个组）中Sp1、Pld1、Rac1和Cdc42蛋白水平的Western blot分析 $lowercase italic n equals 6$ )以GAPDH为内部标准。每个波段的相对强度被量化，其水平如图S11F所示。（F）对照组和对照组Pld1基因启动子区Sp1相对富集的Sp1 ChIP分析 $0.2 milligram per kilogram$ B（a）P处理小鼠组（每组 $lowercase italic n equals 6$ ). （G）对照组（圆形）Pld1和Sp1蛋白水平与 $0.2 milligram per kilogram$ B（a）P处理（方形）组（每个 $lowercase italic n equals 6$ ). （H）拟议的监管机制lnc-HZ09型.Lnc-HZ09型通过竞争性抑制PLD1 mRNA与HuR的结合，抑制SP1介导的PLD1mRNA转录，降低PLD1的mRNA稳定性lnc-HZ09型转录和增强lnc-HZ09型通过上调m6A甲基化修饰的RNA稳定性。因此，BPDE暴露可能会增加lnc-HZ09型表达水平，抑制PLD1/RAC1/CDC42通路，抑制迁移和侵袭，并可能进一步诱发流产。这些条形图和散点图的汇总数据显示在Excel表S1中。在ChIP试验中，IgG组的DNA水平设置为“1”，在western blot试验中，中间强度值设置为“100”。（A–E，G）显示了来自三个独立实验的代表性数据。（F）中的数据显示 $意思是 \pm 标准偏差$ 六个独立实验的结果。双尾学生的 $t吨$ -测试（F）；（A–D）的单因素方差分析，（G）的皮尔逊分析。（H）由Microsoft Office PowerPoint生成* $lowercase italic p less than 0.05$ , ** $lowercase italic p less than 0.01$ ，以及*** $lowercase italic p less than 0.001$ 注：B（a）P，苯并（a）芘；BPDE，苯并（a）芘-7,8-二氢二醇-9,10-环氧；ChIP，染色质免疫沉淀；GADPH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；IgG、免疫球蛋白G；n、生物独立样本的数量；ns，无显著性；RT-qPCR，定量逆转录聚合酶链反应；SD，标准偏差。

此外，在B（a）P处理的小鼠模型中也研究了Pld1的转录。随着B（a）P浓度的增加，小鼠转录因子Sp1的mRNA和蛋白水平降低(图6D、E). 此外，Sp1 ChIP分析表明，与未处理组相比，B（a）P处理组小鼠Pld1启动子区的Sp1占有率较低(图6F). Sp1水平与Pld1水平呈正相关 $0.2 milligram per kilogram$ 组(图6G). 这些组中大多数数据点的位置相对分散。

讨论

环境致癌物和人类生殖健康日益受到重视。B（a）P是传播最广且不可避免的环境致癌物之一，可导致各种不良妊娠结局。⁵⁰新的研究表明，lncRNA可能调节流产的发生。^26,51在我们最近的工作中，我们鉴定了几种新的lncRNA，它们通过不同的途径调节滋养层细胞增殖、凋亡和其他细胞功能。^28,29然而，lncRNA在B（a）P暴露条件下调节滋养层的侵袭和迁移，从而影响流产的证据仍然缺乏。在这项工作中，我们在体外细胞实验、人体组织实验和小鼠模型实验，我们发现lnc-HZ09型在BPDE处理的人类滋养层细胞和相对于HC组织的RM组织中高表达(图6H). 在BPDE处理的人类滋养层细胞、RM（相对于HC组织）和B（a）P处理的小鼠胎盘组织中，PLD1/RAC1/CDC42通路成员的mRNA和蛋白质水平较低。所有这些结果都表明lnc-HZ09型通过下调BPDE暴露的人类滋养层细胞和RM组织中的PLD1/RAC1/CDC42通路，抑制滋养层细胞的侵袭和迁移。然而，通过搜索NCBI数据库，我们没有找到lnc-HZ09型在鼠标系统中，这意味着lnc-HZ09型可能在人类系统中具有特定的表观遗传调控作用。

lnc-HZ09的调节机制

的调节机制lnc-HZ09型在人类滋养层细胞中(图6H). 基于这些数据，我们假设MSX1是lnc-HZ09型，已升级lnc-HZ09型转录。此外，我们认为METTL3促进了m6A甲基化修饰lnc-HZ09型增强其RNA稳定性。因此，MSX1和METTL3都可以积极调节lnc-HZ09型表达式级别。随后，我们假设lnc-HZ09型抑制SP1的表达，SP1是PLD1的转录因子，从而抑制SP1介导的PLD1转录并降低PLD1表达水平。此外，lnc-HZ09型PLD1 mRNA可能与HuR竞争性结合，HuR是一种RNA结合蛋白，可以维持RNA的稳定性。我们假设lnc-HZ09型损害了PLD1mRNA与HuR的结合，从而降低了PLD1mRNA的稳定性及其表达水平。因此，我们建议lnc-HZ09型最后下调PLD1表达水平，进一步抑制PLD1/RAC1/CDC42通路，抑制人类滋养层细胞的迁移和侵袭。一旦滋养层细胞暴露于环境B（a）P或BPDE中，MSX1和METTL3的表达水平将增加，随后增加lnc-HZ09型水平，下调PLD1/RAC1/CDC42通路，抑制滋养层细胞的迁移和侵袭，可能进一步导致流产。

lnc-HZ09在调节PLD1表达中的作用

一般来说，PLD1在各种癌症中异常上调，并与肿瘤恶性程度、肿瘤干细胞自我更新的维持以及对放疗和化疗的抵抗有关。⁵²PLD1可促进胶质母细胞瘤细胞系的侵袭、迁移和增殖。⁵³在胶质母细胞瘤中，异常升高的转录因子SP1增强了PLD1的转录和PLD1表达水平，从而进一步增强了胶质母细胞癌细胞的耐药性。⁵³有人提出，早期胚胎发育和肿瘤转移可能具有相似的生物学表现。⁵⁴在我们的工作中，我们发现lnc-HZ09型抑制SP1介导的人类RM组织和BPDE处理的人类滋养层细胞中的PLD1转录，这可能与癌症细胞系中的情况类似。此外，lnc-HZ09型还抑制了PLD1 mRNA与HuR的结合，降低了PLD1mRNA的稳定性。最后，由于lnc-HZ09型，PLD1转录被抑制，其降解被增加，因此PLD1的表达水平最终降低。然而lnc-HZ09型PLD1在特定癌细胞系中的表达有待进一步研究。

m6A改性在弹道调整中的作用

M6A修饰调节各种生理和病理过程。⁵⁵据报道，linc1281通过作为ceRNA减弱let-7 miRNAs的功能，在胚胎干细胞的正确分化中发挥了重要作用。⁵⁶linc1281-mediated ceRNA模型需要在linc1281上富集m6A。在我们最近的工作中，我们发现m6A修改lnc-HZ01型增强lnc-HZ01型RNA稳定性，进一步调节滋养层细胞增殖，并与流产发生相关。²⁹在这项工作中，我们发现lnc-HZ09型还包含m6A修饰，这与lnc-HZ09型稳定性和较高的表达水平。在BPDE处理的滋养层细胞和RM组织中，m6A修饰水平lnc-HZ09型较高，这与较高lnc-HZ09型表达水平，滋养层细胞迁移和侵袭较少。

环境致癌物对滋养细胞相关不良妊娠结局的上游影响

为了研究不明原因RM的可能原因和机制，我们收集了RM和HC组的绒毛组织样本，排除了已知的流产原因。我们发现RM组的BPDE-DNA加合物水平显著高于HC组。这种效应可能是因为B（a）P是一种普遍存在的环境致癌物，^57,58一些女性可能不可避免地摄入更多的B（a）P。据报道，女性吸烟者的BaP水平明显较高( $1.32 \pm 0.68 纳克 / 毫升$ )与不吸烟的卵泡液比较( $0.03 \pm 0.01 纳克 / 毫升$ ).¹³本研究中检测到的RM和HC绒毛组织中BPDE-DNA加合物的水平也与之前的流产病例对照研究一致，在该研究中，流产组的母体血液中检测到的BPDE-DNA加合物比健康对照组多2.2倍。¹⁴在这项研究中，我们的数据表明，BPDE暴露可能会上调lnc-HZ09型水平，抑制PLD1/RAC1/CDC42通路，抑制迁移和侵袭，最终导致流产。值得注意的是，可能是滋养层细胞的侵袭和迁移受到抑制，而不是BPDE或B（a）P暴露直接导致流产。当PLD1/RAC1/CDC42通路被抑制时，上游BPDE暴露对最终流产的重要性可能降低。在更大的意义上，不仅BPDE或B（a）P，而且其他环境因素或途径也可能抑制滋养层细胞的侵袭和迁移。例如，双酚A和对甲苯酚抑制HTR-8/SVneo细胞的迁移和侵袭。⁵⁹重金属镉（Cd）以剂量依赖性方式诱导HTR-8/SVneo细胞凋亡并抑制其迁移和侵袭。⁶⁰除流产外，滋养层细胞功能异常也可能导致其他与滋养层细胞相关的不良妊娠结局，如子痫、子痫前期、宫内生长受限和妊娠糖尿病。流行病学研究表明，多环芳烃接触可能与这些不良妊娠结局相关。^15,62BPDE抑制滋养层细胞的侵袭和迁移，这意味着BPDE可能是导致这些不良妊娠结局的一种可能化合物。从更大的意义上讲，其他环境致癌物，如空气污染物，⁶³有毒金属（镉和钯），^64,65或饮用水中的三卤甲烷，⁶³也可能导致人类滋养层细胞功能异常，这表明这些环境致癌物也可能导致这些与滋养层相关的不良妊娠结局。从上游环境致癌物接触到最终不良妊娠结局，这是一条长线，为诊断和治疗这些与滋养层细胞相关的不良妊娠结局提供了多种潜在的生物靶点或生物标记物。

本工作的局限性

在这项工作中，我们收集了绒毛组织( $lowercase italic n equals 15$ )以验证蜂窝结果。应收集更多样本，以排除可能的人口统计学差异。因为lnc-HZ09型在小鼠系统中没有发现对应物，在小鼠模型中只研究了Pld1/Rac1/Cdc42通路。然而，在小鼠模型中对该途径的表观遗传调控有待进一步研究。在这些组织样本中，我们通过检测RM和HC绒毛组织基因组DNA中的BPDE-DNA加合物来评估B（a）P的内部暴露水平，这可能反映了B（a检测到RM组的P水平高于HC组，我们不能排除其他致癌物或基因差异也可能导致流产的可能性。其他可能导致流产的致癌物质应进一步研究。

结论

RM是一个全球性问题，给社会经济发展带来了严峻挑战。尽管许多研究表明，各种危险因素可能会导致妊娠早期流产，但大约一半的RM患者有未知的临床原因。⁶⁶在这项工作中，我们确定了一部小说lnc-HZ09型抑制人类滋养层细胞的迁移和侵袭，影响流产的发生。在机制方面lnc-HZ09型抑制SP1介导的PLD1 mRNA转录并降低PLD1的mRNA稳定性。BPDE暴露促进MSX1介导lnc-HZ09型转录也增加了lnc-HZ09型通过上调其m6A甲基化修饰的稳定性。因此，BPDE暴露上调了lnc-HZ09型水平，抑制PLD1/RAC1/CDC42通路，抑制迁移和侵袭，并可能进一步导致流产。总之，这项工作对lnc-HZ09型调节BPDE诱导的人类滋养层细胞功能异常和不明原因流产的发生。

补充材料

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致谢

作者承认《科学》杂志的科学编辑K.Inman环境健康观点，以便仔细全面地修改这份手稿。作者感谢国家自然科学基金（自然科学基金委第82073589号）、中央高校基本科研业务费专项资金、深圳市科技计划（JCYJ20210324114814038号）和福田市卫生保健研究项目（FTWS2021009号）的资助。作者还感谢中山大学第八附属医院中心实验室的设施支持。

M.D.、W.H.和H.Z设计了这项研究。医学博士和卫生博士完成了大部分实验。M.D.、W.H.和H.Z写了草稿。X.H.和C.M.负责动物实验。R.W.和P.T.有助于组织制备。W.C.、Y.Z.和C.M.进行了部分实验。

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文章来自环境健康观点由以下人员提供国家环境健康科学研究所