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.2016年9月15日；537(7620):369-373.
doi:10.1038/nature19342。 Epub 2016年9月7日。

m（6）RNA甲基化促进XIST介导的转录抑制

Deepak P Patil公司 1, 陈春坎 2, 布莱恩·菲克林 1, 周婉仪 2, 康斯坦扎·杰克逊 2, 米切尔·古特曼 2, 萨米·贾弗里 1
附属公司

m（6）RNA甲基化促进XIST介导的转录抑制

Deepak P Patil公司等。 自然. .

摘要

长非编码RNA X非活性特异转录物（XIST）介导X染色体上基因的转录沉默。这里我们表明，在人类细胞中，XIST被高度甲基化，至少含有78N6-甲基腺苷（m6A） 残基——长非编码RNA中未知功能的可逆碱基修饰。我们展示了m6XIST和细胞mRNAs中的一种形成是由RNA-结合基序蛋白15（RBM15）及其副序列RBM15B介导的，其结合mRNA和mRNA6A甲基化复合物并将其招募到RNA中的特定位点。这会导致相邻细胞中腺苷核苷酸的甲基化6共识主题。此外，我们还证明了RBM15和RBM15B的敲除，或甲基转移酶样3（METTL3）的敲除以及6甲基转移酶损害XIST介导的基因沉默。m的系统比较6A结合蛋白表明含有1的YTH结构域（YTHDC1）优先识别m6XIST上的一个残基，是XIST功能所必需的。此外，YTHDC1与XIST的人工栓系可在失去m时挽救XIST介导的沉默6A.这些数据揭示了m的途径6XIST介导的转录抑制所需的形成和识别。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

扩展数据图1
扩展数据图1。验证RBM15和RBM15B抗体用于iCLIP，构建和比较iCLIP库复制品
一、RBM15和RBM15B具有较高的序列同源性。RBM15和RBM15B包含三个RRM域（RRM1、2和3，均为紫色）和一个C端SPOC域（绿色）。这些域显示RBM15和RBM15B之间的高序列一致性（在连接比较区域的阴影区域中显示）。RRM，RNA识别基序；SPOC、Spen paralogue和orthologue C末端。b条,c（c），使用免疫沉淀法验证RBM15和RBM15B抗体对iCLIP的特异性。在每个实验中，我们根据iCLIP验证协议30（参见方法）使用高（H）和低（L）RNase。底部的western印迹是加载控制（GAPDH）。为了确认敲除，显示了RBM15和RBM15B蛋白水平。此外，我们还显示了抗RBM15或抗RBM15B下拉菜单中的蛋白质量。这些实验证实了小干扰RNA转染后RBM15和RBM15B被敲除。d日,e（电子），RBM15和RBM15B iCLIP实验所用样品的自动射线照片。所示为用于制备RBM15和RBM15B iCLIP库的样品的硝化纤维印迹的代表性放射自显影图。膜的切除部分如图所示（红色方框）。红色箭头表示高RNase处理后RBM15和RBM15B蛋白的位置，与b条和c（c）分别是。RBM15和RBM15B都显示出预期大小的特定RNA-蛋白质结合物，而其他大小的RNA-蛋白质接合物污染最小。（f）,克RBM15和RBM15B iCLIP复制品在人类基因组上显示出可复制的iCLIP标记覆盖率。为RBM15和RBM15B准备了三个iCLIP库复制品。我们在散点图上比较了人类基因组中100个核苷酸盒中重复序列的标准化标签数，并估计了皮尔逊相关系数(第页). 所示为代表性散点图（左）和热图（右），其中显示了获得的第页多对复制比较中的值。rep1–rep3，复制1–每个蛋白质复制3；RBM15英寸（f）和RBM15B英寸克. Thex个和年散点图的轴分别表示rep1和rep3中人类基因组100个核苷酸盒中uTPM的标准化标记数。相关值显示在每个平铺上。根据该分析，RBM15和RBM15B iCLIP复制品在人类基因组上显示出类似的、高度可重复的iCLIP标签覆盖率。散点图中的对角线虚线代表完美相关性的参考趋势线(第页= 1,x个=年).小时、RBM15和RBM15B在XIST公司RBM15数据集中的30个集群中的每一个都与RBM15B数据集中的集群重叠。我们还检测了RBM15和RBM15B诱导的CITS。CITS是代表这些蛋白质与XIST公司（补充表3、4）。大多数RBM15 CITS（37个中的23个）与RBM15B CITS（顶部）重叠。这种重叠具有统计学意义(P（P）<0.0001）基于排列分析，在该分析中，我们测量了XIST公司用于RBM15和RBM15B（参见方法）。最后，对每个CITS的iCLIP标签密度进行配对分析，结果表明RBM15和RBM15B结合高度相关（底部）。
扩展数据图2
扩展数据图2。m基因敲除后X连锁基因沉默的量化6读者和作家
一,b条，量化Gpc4公司在…上留下斑点15卢比和15b卢比击倒（图1b、c）。数量Gpc4公司前后斑点XIST公司诱导（分别为−Dox和+Dox）(一). DAPI染色细胞核的典型RNA-FISH图像Gpc4公司斑点（绿色）和XIST公司显示染色（粉红色，最后一列）(b条). 数量Gpc4公司每个FISH图像上都会显示斑点。比例尺，5μm。中的数据一为平均值±s.e.m.NS，不显著*****P（P）<0.0001，相对于未配对双样本Dox缺乏控制t吨-测试。c（c），米6需要对XIST公司-女性pSM33细胞中介导的基因沉默。量化Gpc4公司有或无诱导作用的RNA斑点XIST公司表达式（左）。代表性RNA-FISH图像显示Gpc4公司带有DAPI染色细胞核的RNA斑点（绿色）（右）。野生型（WT）细胞显示正常XIST公司-诱导沉默，而Gpc4公司斑点部分减少（24至17个斑点）。与雄性ES pSM33细胞相似，雌性ES细胞不能显示XIST公司-基因敲除后介导的基因沉默15/15b卢比或梅特尔3每个样品50个细胞的误差条平均值为±标准偏差。NS，不显著****P（P）<0.0001，相对于非配对双样品的no-doxycline对照t吨-测试。d日,e（电子），与图3c、d类似，所示为一个siRNA池，其靶向梅特尔3图3c、d中siRNA池1的数据也显示在这里进行比较。在siControl和siMETTL3转染的细胞中，XIST公司显示与X染色体相互作用一致的聚集。因此XIST公司与X染色体的相互作用可能不需要m6答：。Gpc4公司计数(d日，top）和转录的变化，如Gpc4公司+地址/−地址。值得注意的是Gpc4公司和阿特克斯siMETTL3转染细胞中的斑点（见图3d），即使没有XIST公司表达式。蓝色DAPI核染色的典型FISH图像，Gpc4公司绿色和XIST公司粉红色的(e（电子）). Dox治疗后Gpc4公司对照转染细胞中斑点明显减少。然而，在击倒梅特尔3，数量Gpc4公司信使核糖核酸斑点保持不变。比例尺，5μm。中的数据c（c）50个单元格的平均值±标准偏差。NS，不显著*****P（P）通过未配对的两个样本，相对于no-doxycline对照（上图）和siControl（下图）<0.0001t吨-测试。（f）,克，类似于d日和e（电子），我们在中显示了一个缺陷XIST公司-沉默后的介导沉默Ythdc1号机组如图4d所示，e使用来自不同供应商的多个siRNA池。使用siRNA池（siDC1-Q）靶向DC1的不同区域可以防止XIST公司-介导的基因沉默。图4d、e中的Dharmacon siRNA池数据显示在旁边。中的数据（f）50个单元格的平均值±标准偏差。NS，不显著****P（P）通过未配对的两个样本，相对于no-doxycline对照（上图）和siControl（下图）<0.005t吨-测试。小时、DF1、DF2、DF3和DC2不介导XIST公司-介导基因沉默。量化Gpc4公司（左上角）和阿特克斯（左下角）显示RNA-FISH点。DAPI染色细胞核（蓝色）的典型FISH图像Gpc4公司（绿色）和阿特克斯（红色）斑点显示（右侧）。每幅FISH图像上都显示了这两个基因检测到的RNA斑点数量。比例尺，5μm。数据为一次实验中50个细胞的平均值±标准偏差****P（P）通过未配对的两个样品，相对于对照（−Dox）<0.0001t吨-测试。我，RBM15/15B和DC1介导XIST公司-介导分化野生型女性ES细胞的基因沉默。量化Gpc4公司通过RNA-FISH（左）对维甲酸诱导（+RA）分化的雌性小鼠ES细胞进行RNA表达。显示DAPI染色细胞核的典型FISH图像（蓝色），Gpc4公司RNA（绿色），以及XIST公司（粉红色）如图所示（右侧）。野生型细胞表现正常Gpc4公司对维甲酸治疗的反应是沉默。单次击倒任意一方15卢比或15b卢比也表现出正常的沉默Gpc4公司.两次击倒导致无XIST公司表达式（C.-K.C.和M.G.，数据未显示），令人想起缺少XIST公司METTL3缺陷ES细胞中的表达。CRISPR介导的纯合子敲除数据中心1(Ythdc1号机组−/ −)细胞无法恢复，表明该基因的缺失是致命的。然而，杂合敲除数据中心1(Ythdc1号机组−/+)受损的Gpc4公司对这些细胞中的维甲酸产生沉默反应。这些数据支持这样的观点，即在ES细胞分化过程中，需要DC1来沉默X连锁基因****P（P）<0.0001，相对于未配对双样本对照t吨-测试。j，qRT–基于PCR验证RBM15/15B和DC1对XIST公司-介导的基因沉默。之后的基因表达水平XIST公司诱导（+Dox）在之前标准化为GapdhXIST公司siControl和si中的诱导（−Dox）15卢比/硅15b卢比双击倒样品。基因转录水平变化的量化XIST公司显示的是Gpc4公司和Atrx公司.Dox诱导XIST公司表达导致对照敲除细胞中这两个基因的转录降低。然而，15卢比和15b卢比双重击倒和数据中心1击倒失败XIST公司-诱导沉默**P（P）<0.01（相对于未配对的两个样本的siControl-transfied细胞）t吨-测试。
扩展数据图3
扩展数据图3。METTL3–RBM15/15B复合物的交互免疫共沉淀，验证WTAP公司,RBM15型和RBM15B型击倒及其对XIST公司水平
一,b条，通过相互免疫共沉淀确认WTAP依赖的METTL3–RBM15/15B相互作用。在自然条件下，使用抗siControl和siWTAP转染的HEK293T细胞核提取物内源性蛋白的抗体免疫沉淀METTL3。western blot检测METTL3免疫沉淀物中RBM15和RBM15B。在siWTAP转染的细胞中，这两种蛋白的结合显著降低，表明METTL3以WTAP依赖的方式与RBM15/15B相互作用，形成RBM15/15 B–WTAP–METTL 3复合物。IgG重链信号妨碍WTAP可视化；然而，在输入示例中可以看到击倒。c（c），RBM15/15B–METTL3联合免疫沉淀实验的相对蛋白带强度。这里显示的是RBM15/15B–METTL3蛋白印迹和相互免疫共沉淀实验中获得的相对蛋白带强度，分别如图2a和扩展数据图3a和b所示。对于RBM15 IP中的METTL3，n个= 3; RBM15B IP中的METTL3，n个= 3; METTL3-IP中的RBM15，n个= 7; METTL3中的RBM15B，n个= 3.d日，确认WTAP公司,RBM15型、和RBM15B型击倒。使用western blot分析检测用于图2b、3b中分析的siRNA-转染HEK293T细胞裂解物的蛋白质水平。敲除导致相应蛋白质的显著减少。siRNA均不影响METTL3水平。RBM15B的抗体识别一个双链，但在击倒后只有较低的带丢失。该抗体对iCLIP的特异性在扩展数据图1b–e中得到证明。e（电子），击倒WTAP公司,RBM15型和RBM15B型以及两次击倒RBM15型和RBM15B型不影响XIST公司RNA水平。量化XIST公司从siRNA-转染细胞纯化的RNA经qRT-PCR检测，其水平在XIST公司RNA水平。（f），抗m验证6甲基化物下拉的抗体方法XIST公司RNA。要验证XIST公司图3b中使用的量化，我们使用了一个带有单个m的RNAs的对照峰6A、 和A电子GFP无m的控制RNA6残留物。与m不同6一种RNA（左），非甲基化RNA（右）在免疫沉淀样品中去富集。NS，不显著。克，RBM15/15B绑定XIST公司单位：m6A独立的方式。RBM15/15B绑定XIST公司在m组分缺乏的细胞中6图中显示了甲基化机器（METTL3和WTAP）。RBM15和RBM15B被免疫沉淀XIST公司通过qRT-PCR在三个区域（区域1-3参见图2b、3a和扩展数据图4a）测定水平。XIST公司对RBM15和RBM15B的约束力在梅特尔3和WTAP公司在区域1和区域2击倒，RBM15/15B均显示绑定。因此，RBM15和RBM15B对XIST公司单位：m6依赖于A的方式，而不是m6读者。在这两种蛋白均未显示任何结合的区域3，扩增的基本水平与IgG对照中检测到的水平相似。NS，相对于未配对的两个样品转染的siControl细胞不显著t吨-测试。
扩展数据图4
扩展数据图4。上miCLIP、RBM15和RBM15B iCLIP轨迹的放大视图XIST公司
一，米6A残留物广泛分布于XIST公司所示为m6图中的残基XIST公司使用miCLIP17；这些地点用红线表示。每个基因组位置的总RNA以紫色显示。RNA-seq读取分布以灰色显示。m中的许多6A位点聚集在围绕A-repeat（黄色）区域的2kb域中。放大区域显示m6最靠近A-repeat区域的1-kb区域中的站点（红线）和miCLIP标记分布。还显示了包含RBM15/15B-结合位点的区域1（见图2b）。b条,c（c）、RBM15和RBM15B绑定XIST公司接近m6A站点。确定RBM15/15B-结合位点是否接近已知m6一个站点，我们将iCLIP标签簇与m进行了比较6上的A站点XIST公司。如所示b条是上的RBM15和RBM15B iCLIP以及miCLIP标记分布XIST公司.米6A站点在XIST公司基因模型。垂直绿色阴影框标记miCLIP和RBM15/15B iCLIP标记簇对齐的区域。一个高标记丰度区域（左下）和另一个低标记丰度（右下）的放大视图显示了m6靠近RBM15B和RBM15B标签集群的A站点。标准化标签显示在uTPM中。在c（c）、RBM15（左）和RBM15B（右）CITS的中位数距离，精确到m6上的站点XIST公司测定并与RBM15-和RBM15B-结合位点的随机排列数据集进行比较。RBM15/15B-结合位点明显接近m6A与随机定位的RBM15/15B站点（RBM15**P（P）=0.0026，排列数，10000；RBM15B中***P（P）=0.0001，排列数，10000）。这种接近性不是因为RBM15或RBM15B本身绑定m6A作为其绑定到XIST公司不受影响梅特尔3或WTAP公司击倒（扩展数据图3g）。红色虚线表示m的位置6A站点。
扩展数据图5
扩展数据图5。RBM15和RBM15B在m附近绑定6mRNA上的A位点
一，RBM15/15B在耳鼻间结合6转录组中的一个位点，包括m6中的A站点XIST公司和ACTB公司信使核糖核酸。图中所示为每基平均装订量约为m的曲线图6A（红色曲线）或非m6RBM15（左上）和RBM15B（右上）的DRACH（绿色曲线）站点。底部的两个面板显示了每基约m的标签数6A或非m6DRACH站点作为热图。热图中的每一行都是m6A或非m6一个网站。RBM15和RBM15B在m处或附近的结合力增加6A位点比非甲基化DRACH位点高（约3-4倍）。b条、RBM15和RBM15B在m附近绑定6mRNA上的A位点。显示的是RNA-seq读数（灰色）、iCLIP（浅蓝色，RBM15；深蓝色，RBM15B）和miCLIP（紫色）标签在ACTB公司信使核糖核酸。iCLIP CITS站点显示在其各自的轨道下方。miCLIP识别m6站点用红色条表示。这两种蛋白质（浅蓝色和深蓝色轨道）在ACTB公司mRNA，miCLIP标签在序列的不同区域有相当大的重叠（垂直绿色阴影）。标签分布的放大视图显示在底部面板中。放大区域的感觉DNA序列显示在基因模型上方。穿过轨道中间的垂直黑色虚线将RBM15/15B结合位点与指示结合位点序列的DNA序列连接起来（突出显示的黄色）。在单核苷酸分辨率下，RBM15/15B在m附近结合富U序列6mRNA上的A位点。结合位点与假定的m有明显的分离（5个核苷酸）6包含GAC序列的A（红色条）。RNA-seq读取以绝对读取计数显示，iCLIP和miCLIP标记以uTPM显示。c（c）,d日，RBM15-和RBM15B-RNA结合位点的基因组和转录组分布。为了确定包含结合RBM15和RBM15B的RNA序列类型，前1000个iCLIP CITS(P（P）<0.0001），iCLIP标签覆盖率最高（在uTPM中），映射到人类基因组的不同特征，并确定总体分布。映射到mRNA的位点（蓝色）约占所有蛋白质结合位点的同等比例（约35%）。为了确定RNA结合位点在mRNA中的总体分布，我们进一步绘制了所有RBM15-和RBM15B-结合位点在虚拟转录物上的分布（如d日). RBM15-和RBM15B-结合位点的转移基因在mRNA的不同特征上显示出类似的结合位点分布6A、 这个分布与m不匹配6后基因。CDS，编码序列；UTR，未翻译区域。e（电子）、RBM15和RBM15B结合富铀RNA共识基序。图中显示了RBM15-和RBM15B-结合位点中丰富的基序，每个基序下方显示了包含已识别基序的位点的百分比分布。富含U的RNA结合基序（在基于基因组的比对中显示为T）在iCLIP识别的RBM15-和RBM15B-结合位点处或附近的序列中显著富集(P（P）< 0.0001). 缺少m6这两种蛋白的A-like DRACH基序表明RBM15/15B不直接结合m6A或DRACH序列。值得注意的是，RBM15/15B中的富铀基序类似于富尿嘧啶的HNRNPC结合基序，这可能解释了之前观察到的m6A和HNRNPC绑定站点。（f）,克，击倒RBM15B型和RBM15B型减少的m6细胞mRNA水平。2D-TLC示意图（左，（f）)显示了TLC分离后单磷酸核苷酸的迁移模式。所示为m的相对位置6A（橙色圆点）和腺苷（A）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）（黑色圆点）。箭头指示溶剂在二维中的迁移方向。中间和右侧面板显示了从对照组和RBM15型/RBM15B型双敲除HEK293T细胞。双重击倒RBM15型和加拿大皇家银行15b导致m显著减少6mRNA水平（中间和右侧面板中用黑色箭头标记的斑点）。m的量化6用m计算的A级6A： 两个独立生物复制中单核苷酸强度的A+C+U比率(克).
扩展数据图6
扩展数据图6。YTH蛋白iCLIP的验证实验：抗YTH抗体和文库构建
一，人类YTH蛋白结构域的示意图：DF1、DF2、DF3、DC1和DC2。YTH结构域（蓝色）位于DC1内部，而它位于其他蛋白质的C末端区域。DC1与DC2和类似的DF蛋白具有不同的结构域组织。低复杂性和富含谷氨酸的区域，以及R3H、DEXDc、锚蛋白重复序列（ANK）、HELICc、HA2和OB-fold域。蛋白质的长度显示在每个蛋白质名称的旁边。b条，通过western blot验证DF1、DF2和DF3抗体特异性。全长DF1、DF2和DF3在大肠杆菌IPTG被用作蛋白质表达的诱导剂（-，非IPTG处理；+，IPTG治疗）。对于抗DF1，His6-DF1是检测到的主要波段，但在较长的曝光时间内可以检测到His6-DFS2和His6-DF3的痕量。因此，抗DF2和抗DF3抗体具有高度特异性，而抗DF1相对于其他DF蛋白表现出对DF1的强烈偏好。c（c）–克，确认iCLIP抗体下拉特异性。的自动射线照片32DF1硝化纤维素膜上的P标记RNA-交联蛋白偶联物（顶部）(c（c）)，DF2(d日)，DF3(e（电子）)，DC1(（f）)和DC2(克)如图所示。根据iCLIP验证协议30（参见方法）使用高（H）和低（L）RNase。红色箭头表示YTH蛋白的预期大小。在每种情况下，YTH蛋白mRNA（第3和第4通道）的敲除都会消除RNA的下拉。GAPDH被用作负荷控制。为了证实敲低，显示了输入样品和抗YTH下拉中的YTH蛋白水平。补充表1提供了靶蛋白上的抗体及其抗原肽区域。补充表9列出了mRNA中的siRNA和shRNA靶序列。小时–我，每个iCLIP库复制所用样品的硝化纤维印迹的自动射线照片。对于每个YTH蛋白，制备四个生物复制品（rep1-4）。红色箭头确定了高RNase处理后YTH蛋白的位置，并与c（c）–克通常，紫外线交联会导致32P信号位于YTH蛋白的预期大小（红色箭头），表示RNA-蛋白结合物的形成（所有面板中的通道1对3）。在DC1的情况下32即使在没有紫外线交联的情况下P信号（通道1与3英寸k个). 这种背景信号是由于蛋白质或磷酸化DC1的共同免疫沉淀蛋白激酶的自磷酸化活性引起的。获得了所有YTH蛋白的核糖核酸酶敏感涂片（比较第4–7道和第3道小时–我). 使用不含抗体的蛋白A/G珠（通道2）的实验在感兴趣区域没有显示任何信号。总的来说，每个YTH蛋白的所有复制品都显示出预期大小的高度特异性RNA-蛋白质结合物，而其他大小的RNA-蛋白质接合物污染最小。洗脱的RNA材料用于构建iCLIP文库。下图所示为西区负荷对照（GAPDH和每个YTH蛋白）以及确认免疫沉淀物中存在YTH蛋白质的对照。
扩展数据图7
扩展数据图7。iCLIP法比较内源性YTH蛋白转录组宽RNA结合位点
一–e（电子），YTH iCLIP库复制再现性。对于每个YTH蛋白（DF1、DF2、DF3、DC1和DC2），构建了四个独立的生物复制iCLIP库。如扩展数据图1f所示，对iCLIP标签覆盖率的再现性进行了评估。g。在散点图和皮尔逊相关系数上比较了来自不同重复的uTPM中标准化的iCLIP标记计数(第页)已确定。比较rep1和rep2的平均标记数的散点图(x个轴）、rep3和rep4(年轴）如图所示（左侧）。对所有iCLIP复制品进行了类似的配对比较分析。获得的相关系数显示在热图（右侧）上。热图中瓷砖的颜色表示第页值。YTH iCLIP复制显示出类似且高度重复的iCLIP标签覆盖率。对角线虚线代表完美相关性的参考趋势线(第页= 1,x个=年).（f），基于转录全iCLIP结合数据的每个YTH蛋白的丰富基序。对iCLIP数据中DF1、DF2、DF3和DC1蛋白识别的结合位点进行的基序分析表明，DRACH序列是最显著的基序，它与已知的一致性基序匹配6转录组中的A。DC2还显示了DRACH基序以及其他基序，这可能反映了其众多的RNA结合域（扩展数据图6a）。DC1在各种转录组和基因组特征中主要结合DRACH（补充表10）。这些数据表明YTH蛋白结合m6单元格中的A。使用MEME分析鉴定RNA结合基序（参见方法）。右上角显示了包含已识别基序的分析位点的百分比。P（P）使用MEME CentriMo工具通过单尾二项检验获得值。克、YTH结合位点和m分布的全球比较6mRNA上的一个位点。我们将每个YTH蛋白结合位点的后基因与之前报道的单核苷酸分辨率miCLIP识别的后基因进行了比较6mRNA17上的A位点（YTH蛋白，绿色；miCLIP，橙色）。每条曲线代表一个内核密度(年轴）虚拟成绩单上CITS分布图(x个轴）。转录起始位点、5′UTR、起始密码子（AUG）、CDS、终止密码子和3′UTR显示在虚拟转录物上。垂直虚线标记UTR-CDS边界。由于少量DC2位点映射到mRNA，因此未显示DC2的后基因。小时，m处YTH iCLIP标签覆盖率的成对比较6站点显示DC1的不同绑定首选项。确定YTH蛋白是否识别类似的m6在iCLIP标签覆盖率的基础上，我们估计了每11530米iCLIP标记覆盖率的相关系数6miCLIP的两个YTH iCLIP文库的成对比较转录组中的一个位点确定为m6A站点。皮尔逊相关系数显示为热图。为了识别具有类似结合偏好的YTH蛋白，根据获得的相关系数对文库进行分层聚类（参见热图下方的树状图）。这表明DF蛋白聚集在一起并显示出类似的结合模式，这些蛋白以类似的分子为靶点6A站点。DC1和DC2均具有非典型m6A站点首选项；DC2与已知m的相关性较弱6A站点。用于此比较的散点图如扩展数据图8a所示。我，RNA结合位点的基因组分布。为了确定优选YTH蛋白-RNA结合位点的基因组分布，统计显著的前1000个iCLIP CITS(P（P）<0.0001），iCLIP标签覆盖率最高（在uTPM中），映射到人类基因组的不同特征。DC1与ncRNAs具有显著的结合性（占前千个CITS的19%），而DF1、DF2或DF3 CITS中不到2%属于注释的ncRNAs，包括lncRNAs。大多数DF1-、DF2-和DF3-结合位点位于mRNA和内含子中。DC2在mRNA中的覆盖率可以忽略不计，并且主要与内含子和基因间序列结合。
扩展数据图8
扩展数据图8。DC1优先绑定到m的子集6主要本地化到的站点XIST公司和其他ncRNA
一、YTH iCLIP库的成对比较，以及DC1首选m的识别6A站点。所示为用于生成扩展数据图7h中的热图的数据。在每次成对分析中，比较两种YTH蛋白与每种基质的结合情况6使用标准化标记计数的残留物（参见方法），为每m提供首选绑定伙伴的估计值6每个YTH蛋白比较的位置。每米周围的窗口中的标签计数6测定每个YTH蛋白的基因组坐标（上游和下游10bp）。散点图显示了每对指定的YTH蛋白。米6将场地绘制为点，其中x个和年坐标表示比较库中的标记计数。DF蛋白家族表现出高度相似的结合偏好，这由其高Pearson相关系数表示(第页，每个图的右上角）。如扩展数据图7h所示的层次聚类支持DF蛋白结合偏好的总体相关性。然而，DC1和DC2显示出与DF蛋白不同的模式。DC2在大多数m上显示标签覆盖率低6A站点，因此产量低第页值。值得注意的是，DC1显示了DF1、DF2和DF3首选站点的全球去富集结合，如扁平趋势线（绿色）所示。此外，DC1在一组独特的m处显示富集6一个站点（在DC1和DF1、DF2和DF3之间的比较中，距离趋势线最远的1%的站点用红色虚线椭圆突出显示）。b条维恩图显示了DC1优于DF1、DF2和DF3的首选站点数量。绝大多数（105，白色阴影区）在每次比较中是相同的，这意味着这些位点是DC1优先于任何DF蛋白的。向右投影显示，这些m中的大多数6A位点位于ncRNA中，主要由XIST公司米6A站点。c（c），序列标志分析表明DC1首选m6A站点符合DRACH-like m6在转录组中发现的共有基序，而不是新的DC1特异基序。d日，放大iCLIP标记分布的视图XIST公司五种YTH蛋白XIST公司。miCLIP标签分布还标识了富含m的区域6A.只有DC1（蓝色）在XIST公司而其他YTH蛋白则没有。垂直绿色阴影标记的区域XIST公司密度最高的6A站点。RNA-seq读数显示在读数计数中，iCLIP和miCLIP标签显示在uTPM中。区域1和2包含RBM15/15B结合位点，区域3不包含。这些地点用彩色方框表示。DC1在区域1和区域2显示了更多的iCLIP标记，这些区域包含数个m6A站点。尽管区域3（灰色）显示假定m6站点DC1显示出较差的绑定，可能是由于XIST公司.e（电子），HNRNPA2B1不绑定m6上的A站点XIST公司.HNRNPA2B1先前显示绑定m6初级微RNA（pri-miRNA）转录本上的A位点35。我们比较了HNRNPA2B1 HITS-CLIP和miCLIP17标记覆盖率（uTPM中±10 bp）在11530注释m6A站点，并确定m的相关系数6mRNA（红色）和ncRNA（蓝色）中的A位点。HNRNPA2B1未显示与m的任何显著结合6mRNA和ncRNA上的一个位点。值得注意的是，miCLIP识别了m6本分析中使用的站点17缺少m6来自pri-miRNAs的站点。
扩展数据图9
扩展数据图9。DC1绑定XIST公司米6A以METTL3-、RBM15-和RBM15B-依赖方式
一，DC1与XIST公司以RBM15/15B相关方式。量化XIST公司在DC1区域1和2（左）通过RNA免疫沉淀和qPCR进行免疫沉淀。siRNA-转染细胞蛋白质的Western blot分析（右）。击倒梅特尔3,WTAP公司,RBM15型和RBM15B型导致XIST公司用DC1免疫沉淀物富集RBM15型/RBM15B型两次击倒表现出最大的下降。这些数据表明DC1结合XIST公司RNA以METTL3/RBM15/15B依赖方式存在。区域3没有显示可重复和可检测的扩增，可能是因为DC1结合不良。在扩展数据图8d中，区域3显示了非常低的DC1 iCLIP标签覆盖率。数据为三个独立实验的平均值±标准偏差***P（P）<0.0001相对于XIST公司非配对双样本在siControl-transfied细胞中的水平t吨-测试。b条，DC1抗体免疫荧光验证。shLacZ-和shDC1-转染HEK293T细胞的图像用DC1抗体探测。DC1显示核定位（红色）。在eGFP表达的shDC1转染细胞中（箭头所示），DC1抗体信号大大低于同一区域中未转染细胞的抗体信号（比较红色信号，底行）。用表达shLacZ的质粒进行对照敲除，在相同的视图中显示类似于未转染细胞的DC1染色（红色通道，箭头）。细胞核用DAPI染色。比例尺，10μm。c（c）,d日，DC1优先本地化为XIST公司亚核室。3D-SIM用于检测XIST公司DC1免疫荧光标记后HEK293T细胞亚核室与常染色体结构域的比较XIST公司RNA-鱼类。HEK293T细胞是三倍体，因此显示出两条不活跃的X染色体,。左侧是显示DC1（绿色）的代表性图像，XIST公司（红色）和DAPI（细胞核，灰白色）染色。右侧，高亮区域（正方形）放大2倍。DC1在XIST公司相似致密常染色体间隔上的域（右，顶部两行与底部两行）。中对DC1信号执行的三维对象计数的分布分析XIST公司常染色体域也显示出显著的富集(d日，核数=5，总计XIST公司域=10，总常染色体域=10）。区域A和B（黄色方块）突出显示了两个DAPI染色的失活X染色体区域，标记为存在XIST公司（红色）。C区和D区（蓝色方块）标记DAPI染色的常染色体域。比例尺，5μm。在d日, **P（P）=0.0023，使用双尾Mann–Whitney检验。e（电子），中DC1的本地化XIST公司该地区依赖METTL3和RBM15/15B。要确定DC1是否本地化为XIST公司am中的亚核室6依赖于A的方式XIST公司之后的域梅特尔3和RBM15型/RBM15B型通过3D-SIM评估击倒情况，然后进行图像分析。击倒梅特尔3和RBM15型/RBM15B型导致XIST公司-本地化DC1。方框图显示了DC1分子（绿色物体）在XIST公司来自不同敲除细胞的域。每次击倒10个核***P（P）= 0.0011, ****P（P）=0.0147相对于双尾Mann-Whitney检验中的对照击倒。
扩展数据图10
扩展数据图10。m角色的模型6A英寸XIST公司-介导的转录沉默和DC1蛋白-蛋白质相互作用网络分析
一，m的模型6依赖A的XIST公司-介导的基因沉默。RBM15/RBM15B是m的一部分6结合的甲基化复合物（即RBM15/RBM15B–WTAP–METTL3）XIST公司这种结合使DRACH共识位点中相邻腺苷残基甲基化。m6残基作为DC1的募集位点，可以促进和稳定沉默蛋白在XIST公司.b条，蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析确定可能介导高效的多组分途径XIST公司-介导的基因沉默。DC1没有可直接介导基因转录抑制的已知蛋白结构域。我们挖掘了PINA2数据库28中DC1的PPI网络，以及与DC1结合蛋白相互作用的蛋白质和调节蛋白XIST公司-介导的基因沉默（SHARP、HDAC3、HNRNPK、HNRNPU、NCOR2（也称SMRT）、LBR、PRC1和PRC2）。图中显示了与DC1相互作用的蛋白质网络，以及这些蛋白质的相互作用（子网络）。与XIST公司-介导沉默用粉红色（PRC成分）或橙色表示。c（c）–e（电子），子网络显示参与转录抑制的蛋白质的存在。基因本体术语从主网络中过滤b条.英寸c（c），显示了DC1-BMI子网络。这种相互作用是基于DC1与BMI1的免疫共沉淀，BMI1是维持基因抑制所需的PRC复合物的一种成分。BMI1可以招募SHARP，SHARP直接绑定XIST公司并调节X染色体上HDAC3的募集。EMD（emerin）子网络如所示d日，在参与转录抑制的蛋白质中显著富集（错误发现率<0.05，P（P）<0.05）（补充表7）。DC1与EMD相互作用，EMD与已知对XIST公司-介导的基因沉默（用粗体红线表示相互作用）。通过串联免疫沉淀和质谱分析鉴定的DC1共免疫沉淀蛋白的单独分析也显示了SHARP和LBR蛋白的存在（用红色虚线表示的相互作用）。另一种DC1相互作用蛋白KHDRBS1（参考文献52）的蛋白结合伙伴如e（电子）.KHDRBS1（也称为SAM68）是一种众所周知的转录抑制因子。此处显示KHDRBS1与PRC组分蛋白SUZ12、EZH2和RNF2相互作用。SUZ12和EZH2是PRC2/EED-EZH2复合物的组成部分，它介导组蛋白在K9和K27残基上的甲基化，导致转录抑制。KHDRBS1还与XIST公司5.RNF2是PRC1复合体的组成部分。RNF2具有E3泛素蛋白连接酶活性，可介导组蛋白H2A（H2AK119Ub）Lys119的单泛素化。发现PRC1/2和的组分富集在灭活的X染色体4上。
图1
图1。RBM15和RBM15B对于XIST公司-介导基因沉默
一、RBM15和RBM15B在XIST公司所示为归一化RBM15和RBM15B iCLIP标签的分布（单位为每百万个唯一标签，uTPM）和具有统计意义的CITS。浅蓝色垂直线，RBM15；深蓝色垂直线，RBM15B；P（P）< 0.0001.b条,c（c），二者的淘汰15卢比和15b卢比（siRBM15/15B）损害XIST公司-介导的基因沉默。XIST公司表达是由强力霉素和X连锁基因诱导的Gpc4公司（绿色）和阿特克斯（红色）通过RNA-FISH定量(b条). 代表性FISH图像显示DAPI核复染（蓝色）(c（c）). 每幅图像上都显示了这两个基因检测到的RNA斑点数量。比例尺，5μm。数据为一次实验中50个细胞的平均值±标准偏差***P（P）< 0.001, *****P（P）<0.0001，相对于未配对双样本siControlt吨-测试。NS，不显著。
图2
图2。RBM15和RBM15B招募METTL3XIST公司
一、RBM15和RBM15B以WTAP依赖的方式与METTL3相互作用。从HEK293T核提取物中免疫沉淀RBM15（左）和RBM15B（右）。在转染siWTAP的细胞中，METTL3的共免疫沉淀减少。IgG重链（H链）阻止WTAP可视化；然而，在输入示例中可以看到击倒。NE，核提取物。b条，METTL3-结合的量化XIST公司甲基化机器组件击倒后。XIST公司使用根据RBM15-和RBM15B-结合位点的存在与否选择的区域（分别用浅蓝色和蓝色线表示）通过qRT-PCR进行量化。数据为三个独立实验的平均值±标准误差**P（P）< 0.001, ***P（P）<0.0001，相对于未配对双样本siControlt吨-测试。
图3
图3。N个6-腺苷甲基化对于XIST公司-介导基因沉默
一，米6通过miCLIP识别的残基（红线）广泛分布于XIST公司。标准化的miCLIP17标记以紫色显示。b条，甲基化XIST公司需要RBM15和RBM15B。米6中的A级别XIST公司用m量化6A-RNA免疫沉淀后qRT-PCR检测3 m6A地区XIST公司数据是来自两个生物复制品的三个技术复制品的六个样品的平均值±标准偏差***P（P）< 0.0001, **P（P）<0.001（相对于siControl，通过未配对的两个样本）t吨-测试。c（c）,d日，米6A推广XIST公司-介导的基因沉默。XIST公司表达由Dox和X连锁基因诱导Gpc4公司（绿色）和阿特克斯（红色）通过RNA-FISH定量(c（c）). 显示了具有代表性的FISH图像(d日). 检测到的RNA斑点数量显示在每张图像上。比例尺，5μm。数据是来自一个实验的50个细胞的平均值±s.e.m****P（P）通过未配对的两个样本，相对于siControl<0.005t吨-测试。
图4
图4。DC1绑定XIST公司米6A残留并促进XIST公司-介导基因沉默
一，YTH iCLIP标签覆盖率为11530，注释为m6残留物。mRNA m的相关系数6A（灰色）和非编码RNA（ncRNA）m6显示A（洋红色）。DF1、DF2和DF3在m6mRNA（蓝线）和ncRNAs（品红线）的丰度和YTH结合。DC1表现出对ncRNA m的偏好6A、 DC1-bound m的前1%6指示的（点椭圆）。b条，DC1结合mRNA的前1%mRNA/ncRNA分布6A站点。检测到最多的ncRNA m6A存在于XIST公司（以绿色表示）。c（c），上每个YTH蛋白的标准化标记分布XIST公司主要显示DC1绑定。高密度m6区域由绿色阴影表示。d日,e（电子）,第1年击倒（siDC1）损伤XIST公司-介导的基因沉默。XIST公司由Dox和X连锁基因诱导Gpc4公司（绿色）和阿特克斯（红色）通过RNA-FISH定量。显示了代表性的FISH图像(e（电子）). 检测到的RNA斑点数量显示在每张图像上。比例尺，5μm。数据为平均值±标准误差****P（P）通过未配对的两个样本，相对于siControl<0.005t吨-测试。
图5
图5。米6DC1的A-独立系绳XIST公司足以发挥作用XIST公司-介导基因沉默
一，栓系方法示意图。的3′端XIST公司用三个BoxB序列进行了基因组修饰(XIST公司–（方框B）三). 米6甲基化缺陷细胞中DC1的A依赖性募集被阻断；然而，使用DC1–λN可以实现人工系绳，它与中的BoxB元件相结合XIST公司–（方框B）三.b条,c（c），Dox诱导的表达XIST公司–（方框B）三在siControl-transfered细胞中导致基因沉默，但在siMETTL3或siRBM15和siRBM15B联合转染细胞中没有。DC1–λN拯救了这些细胞中的沉默，表明m的主要功能6A英寸XIST公司-介导的基因沉默是招募DC1XIST公司.量化Gpc4公司表达式如所示b条.显示DAPI染色细胞核的典型FISH图像（蓝色），Gpc4公司RNA（绿色），以及XIST公司（粉红色）如所示c（c）.比例尺，5μm。数据为平均值±标准误差b条从一个实验中取50个细胞*****P（P）<0.0001，通过未配对的两个样本t吨-测试。
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中的注释

  • m6A RNA修饰的功能解剖。
    Huisman B、Manske G、Carney S、Kalantry S。 Huisman B等人。 生物化学科学趋势。2017年2月；42(2):85-86. doi:10.1016/j.tibs.2016.12.004。Epub 2017年1月4日。 生物化学科学趋势。2017 PMID：28063638 免费PMC文章。 没有可用的摘要。
  • 上转录时代的兴起：对心血管疾病的影响。
    斯特洛斯·K。 斯特洛斯·K。 2017年4月1日心血管研究；113（5）：e2-e3。doi:10.1093/cvr/cvx030。 2017年心血管研究。 PMID：28384367 没有可用的摘要。

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