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EMBO J。2016年6月15日；35(12): 1276–1297.
2016年4月21日在线发布。 数字对象标识：10.15252/embj.201593350
预防性维修识别码：项目经理4910533
PMID：27103069

C9损失ORF公司72损害自噬并与polyQ共济失调-2协同诱导运动神经元功能障碍和细胞死亡

Chantal Sellier公司,通讯作者1 玛丽亚·莱蒂齐亚·坎帕纳里,2 卡米尔·朱莉·科尔比尔,1 安吉琳·高切罗,1 伊莎贝尔·科尔布·切内尔,1 穆斯塔法·乌拉德‐阿卜杜勒加尼,1 弗兰克·拉夫纳赫（Frank Ruffenach）,1 阿德琳页面,1 索拉娜·库拉,2 埃多·卡巴希,2和尼古拉斯·查莱特·伯格兰通讯作者1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

的内向扩展GGGCC公司在C9中重复ORF公司72基因是肌萎缩侧索硬化和额颞叶痴呆最常见的遗传原因(肌萎缩性脊髓侧索硬化症‐FTD公司). 具有中等长度聚谷氨酰胺扩增的共济失调-2（共济失调2 Q30x）是该病的遗传修饰物。在这里，我们发现C9ORF公司72与西部数据报告41和SMCR公司8种蛋白质作为国内生产总值/全球技术伙伴的换算系数受监资产基础8a和受监资产基础39b，从而控制自噬流量。神经元中C9orf72的耗竭部分损害自噬并导致细胞聚集技术开发计划‐43和P62蛋白，它们是肌萎缩性脊髓侧索硬化症‐FTD公司.SMCR公司8被磷酸化TBK（待定）1和损耗TBK（待定）1可以被SMCR公司8或通过构成活性受监资产基础39b，表明TBK（待定）1,SMCR公司8、C9ORF公司72，和受监资产基础39b属于调节自噬的共同途径。C9耗尽时ORF公司72只对神经元存活有部分有害影响，它与共济失调-2 Q30x毒性协同作用，导致运动神经元功能障碍和神经元细胞死亡。这些结果表明C9的部分功能丧失ORF公司72本身并不有害，但与Ataxin‐2毒性协同作用，这表明在肌萎缩性脊髓侧索硬化症‐FTD公司.

关键词：C9级ORF公司72、自噬、神经变性，肌萎缩性脊髓侧索硬化症‐FTD公司
主题类别：神经科学

介绍

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种运动神经元退行性疾病，而额颞痴呆症（FTD）是影响额叶和颞叶脑区的一种老年前期痴呆症，两者在临床、遗传和病理上存在重叠，现在在某些情况下被视为类似疾病连续体的表现（Lomen‐Hoerth等,2002; 林霍尔茨等,2005; 诺依曼等,2006). 通过在第一个内含子中识别扩展的GGGGCC重复序列来强调的一个概念C9ORF72型基因是ALS和FTD最常见的遗传原因（DeJesus‐Hernandez等,2011; 伦顿等,2011; 吉塞林克等,2012; 马朱尼等,2012).

有人提出了三种非排他性机制，通过这三种机制扩大GGGCC重复序列导致神经元退化。首先，含有扩增GGGGCC重复序列的正反义转录物积累在核RNA聚集体中，这些聚集体招募特定的RNA结合蛋白，从而潜在地抑制其功能（Almeida等,2013; 唐纳利等,2013; 拉盖尔·图伦等,2013; 米泽林斯卡等,2013). 据报道，各种蛋白质与GGGCCC RNA重复序列结合，但其在发病机制中的作用尚待确定（Lee等,2013; 莫里等,2013年a; 库珀敲门等,2014; 海斯勒等,2014). CCGGG扩增的第二种潜在神经毒性机制是一种非标准蛋白质翻译形式，称为重复相关非ATG（RAN）翻译（Zu等,2013). 实际上，扩展的GGGGCC重复序列在所有六个正、反义框架中都被RAN翻译，导致五个不同的含有蛋白质的二肽重复序列（DPR或DRP，也称为C9RANT）的表达，这些蛋白质在C9‐ALS/FTD（Ash等,2013; Gendron公司等,2013; 莫里等,2013年b; 祖等,2013)，以及在表达扩增的CCGGGG重复序列的小鼠中（Chew等,2015; 奥鲁克等,2015; 彼得斯等,2015). 最近研究表明，这些DPR在神经细胞培养和果蝇属通过改变核质转运（Kwon等,2014; 五月等,2014; 米齐林斯卡等,2014; 文等,2014; 张等,2014,2015; 弗赖巴姆等,2015; 乔维奇等,2015; 道等,2015). 第三，表达减少C9ORF72型C9‐ALS/FTD患者（DeJesus‐Hernandez）的mRNA表达水平等,2011; 吉塞林克等,2012; 阿尔梅达等,2013; Waite（等待）等,2014; 范·布利特斯威克等,2015)以及斑马鱼C9orf72基因敲除导致的运动障碍（Ciura等,2013)，提示C9ORF72的单倍体不足可能参与神经元变性。然而，缺乏神经细胞表型的小鼠C9或f72大脑或神经元中的表达（拉盖尔·图伦等,2013; 科伯斯等,2015)以及ALS/FTD患者中无无效等位基因或错义突变C9ORF72型，强烈反对C9ORF72功能丧失是ALS‐FTD的唯一原因。

尽管取得了这些进展，但对C9ORF72的正常分子和细胞功能知之甚少。生物信息学分析预测，C9ORF72包含具有Rab GDP/GTP交换因子（GEF）（Levine等,2013; 张等,2012). Rab GTPases是单体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，在两种构象状态之间切换，一种与GDP结合的非活性形式，另一种与GTP结合的活性形式。GEF蛋白催化Rab蛋白从GDP结合形式转化为GTP结合形式，从而激活Rab功能。Rab GTPases调节膜交通的许多步骤，包括小泡形成、小泡运动和膜融合。据报道，C9ORF72与Rab1、Rab5、Rab7和Rab11相互作用，并导致内吞和自噬功能障碍（Farg等,2014).

自噬是一种分解代谢过程，将细胞质成分吞噬在一个称为自噬体的双膜囊泡中，该囊泡直接进入溶酶体进行降解和再循环。因此，自噬通过提供能量和循环细胞成分，以及促进细胞内病原体、缺陷细胞器和错误折叠蛋白聚集体的溶酶体降解，在体内平衡中发挥着重要作用。在这方面，自噬对正常的大脑功能至关重要（Hara等,2006; 小松等,2006)自噬功能障碍在各种神经退行性疾病中都有报道，包括阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病，以及ALS和FTD（Wong&Cuervo，2010; 尼克松，2013).

更好地理解C9ORF72功能对于理解其在ALS‐FTD中的可能含义至关重要。在这里，我们发现C9ORF72与WDR41和SMCR8形成复合物，这是一种以前在自噬相互作用组（Behrends）中发现的DENN蛋白等,2010). 我们发现由C9ORF72、SMCR8和WDR41形成的复合物与RAB8a和RAB39b相互作用并充当GDP/GTP交换因子，RAB8b和RAB39是参与囊泡运输和自噬（Pilli）的Rab GTP酶等,2012; Seto公司等,2013; 佐藤等,2014).

接下来，我们发现C9ORF72的表达减少部分抑制自噬，并导致P62/SQSTM1和TDP‐43的细胞质聚集体积聚，从而概括了ALS‐FTD患者的两个组织病理学特征（Neumann等,2006; 阿尔·萨拉吉等,2011). 此外，SMCR8（而非C9ORF72或WDR41）被ULK1或TBK1磷酸化，后者是调节自噬的激酶（Chan等,2007; 哈拉等,2008; 瑟斯顿等,2009; 野生等,2011; 皮利等,2012; 松本等,2015; 你好等,2015; 拉扎鲁等,2015). 重要的是，模拟TBK1依赖性磷酸化组成的SMCR8突变体或不需要GEF活性的RAB39b组成活性突变体都可以纠正TBK1或C9ORF72缺失引起的自噬改变。这些结果表明，TBK1、C9ORF72复合物和RAB39b属于调节神经元自噬的共同途径。

最后，我们发现C9ORF72的表达减少会增强具有中等长度聚谷氨酰胺扩增的Ataxin‐2的聚集和毒性（Ataxin‐2 Q30x），但不会增强具有正常polyQ长度的Ataxin‐2的聚集和毒性（Ataxin‐2 Q22x）。这是相关的，因为共济失调-2中聚谷氨酰胺扩增的中等大小是ALS‐FTD（老年性痴呆）的遗传修饰物等,2010; 达乌德等,2011; 罗斯等,2011; 范·达姆等,2011; 拉坦特等,2014).

总之，这些结果为C9ORF72作为一种调节自噬的GEF蛋白提供了分子和细胞功能，但也支持ALS-FTD的双重打击机制，其中C9ORF72型可能不足以导致神经细胞死亡，但可能会协同毒性蛋白（包括具有中间polyQ长度的共济失调蛋白-2）的积累导致的神经退化。

结果

C9ORF72与WDR41和SMCR8蛋白形成复合物

为了更好地表征C9ORF72的功能，我们进行了蛋白质组学分析，以确定C9ORF 72的潜在相互作用物。具有技术意义的是，转染Flag标记的人C9ORF72 cDNA导致C9ORF 72蛋白的低表达。生物信息学分析表明，人类或小鼠的mRNA序列C9ORF72型呈现过多的稀有密码子和负RNA顺式会损害C9ORF72表达的元素。因此，我们克隆了一个优化的人类序列C9ORF72型cDNA表达完全相同的氨基酸序列，但其中密码子使用得到优化，RNA为阴性顺式元素已删除。用HA标记的优化C9ORF72和串联标记纯化转染N2A小鼠神经细胞，然后进行纳米LC-MS/MS分析，确定各种蛋白质，包括Rab8a、Rab39b、Smcr8、Wdr41、P62、Hsc70、Hsp90和Bag3（图1A和表EV1). 使用DAVID数据库（NIAID，NIH）对这个假定的C9ORF72相互作用组进行生物信息学分析，预测与ALS疾病的潜在关联(P（P）值4.3×10−2)，并使用基因集富集分析（GSEA，Broad institute）对KEGG、GO和反应体生物途径进行分析，发现适应性免疫系统显著富集（FDR q值，2.6×10−6)，NF‐κB活化（FDR q‐值，9.8×10−5)吞噬体和自噬体的形成（FDR q‐值为8.8×10−5和1.4×10−4囊泡介导的转运（FDR q值，6.7×10−3)和蛋白酶体（FDR q值，6.3×10−3).

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C9级ORF公司72与SMCR公司8和西部数据报告41是一个全球环境基金对于受监资产基础8和受监资产基础39

  1. 对从表达Flag‐HA标记的C9ORF72的N2A小鼠神经元细胞提取的蛋白质进行银染，并通过连续的反Flag和反HA亲和纯化步骤进行捕获。
  2. HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解产物的免疫印迹分析，共表达HA标记的C9ORF72和/或标记的SMCR8和/或WDR41。
  3. 在杆状病毒感染的昆虫细胞中共表达的HIS‐C9ORF72、SMCR8和WDR41的镍-NTA亲和纯化考马斯蓝染色。
  4. HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解物的免疫印迹分析，共表达HA标记的C9ORF72和HA标记的SMCR8与各种标记的Rab GTPases。
  5. 对照组内源性C9orf72、Wdr41、Rab8a、Rab39b、Rab5和Rab7的免疫印迹（仅IgG）或成年小鼠脑内内源性Smcr8免疫沉淀。
  6. α‐32GST标记的纯化RAB8a的放射性标记GDP释放是重组纯化C9ORF72单独或与SMCR8和WDR41复合物浓度增加的函数。
  7. 与（F）中相同的GDP释放试验，但使用重组纯化GST标记的RAB39b代替RAB8a。
  8. C9ORF72复合物作为Rab‐鸟嘌呤核苷酸交换因子的示意图。

数据信息：误差条表示SEM。实验重复3次(n个=3）。可在线获取此图的源数据。

串联标签纯化蛋白上的蛋白质印迹证实内源性Rab8a、Rab39b、Smcr8、Wdr41、P62、Hsc70和Bag3与转染HA标记的C9ORF72（图电动汽车1A） ●●●●。RAB8和RAB39是参与囊泡运输和自噬的Rab GTPase（Pilli等,2012; Seto公司等,2013; 佐藤等,2014). WDR41是一种功能未知的52‐kDa蛋白质，包含由六个WD40重复序列组成的蛋白质-蛋白质相互作用域。Smith–Magenis综合征染色体区域候选基因8（SMCR8）是一种105‐kDa蛋白，与C9ORF72类似，在正常和肿瘤（DENN）域（Zhang等,2012; 莱文等,2013). 有趣的是，已发现SMCR8与ULK1激酶复合物相互作用，后者启动自噬（Behrends等,2010). P62，由SQSTM1系列该基因与多泛素化蛋白质结合，并以这些蛋白质为目标进行自噬降解。最后，HSC70，由热休克蛋白A8基因是一种组成性表达的热休克蛋白，在各种功能中与BAG3（BCL2相关的athanogene 3）和泛素连接酶STUB1（也称为CHIP）相互作用，以启动聚集，也称为伴侣辅助选择性自噬（CASA），这是伴侣结合错误折叠或聚集蛋白质的选择性自噬（Gamerdinger等,2009; 阿恩特等,2010). 相反，我们发现C9ORF72与蛋白质组学分析确定的其他候选蛋白没有相互作用，例如Senataxin、TDP‐43、IQGAP和蛋白酶体蛋白PSMD4、PSMD8、PSMD10，而其他一些蛋白没有进行测试（DCTN、NSF、SNX、STX17、VPS16、SEC22等）。

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与C9相互作用的蛋白质的验证ORF公司72

  1. 蛋白质组分析发现内源性蛋白质的免疫印迹分析与N2A细胞中表达的对照或标记有Flag‐HA的C9ORF72相关。
  2. HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解产物的免疫印迹分析，共表达HA标记的C9ORF72的长或短剪接变体与标记的SMCR8和WDR41。
  3. HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解产物的免疫印迹分析，共表达HA标记的C9ORF72和/或HA标记的SMCR8和/或带有Flag标记的HSC70的HA标记的WDR41。
  4. 左面板，HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解物的免疫印迹分析，共表达HA标记的C9ORF72、HA标记的SMCR8或HA标记的WDR41与Flag标记的RAB8A。右面板，HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解物的免疫印迹分析，共表达HA标记的C9ORF72、HA标记的SMCR8或HA标记的WDR41与Flag标记的RAB39b。
  5. HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解产物的免疫印迹分析，这些细胞共表达HA标记的SMCR8和各种标记的Rab GTPase。
  6. Smcr8、Rab8a、Rab39b和Gapdh在小鼠成体组织和E18小鼠皮层神经元原代培养中内源性表达的免疫印迹分析。
  7. 32GST标记的纯化RAB8a、RAB39b、RAB29（也称为RAB7L1）和RAB32的放射性标记GDP释放，作为从杆状病毒感染昆虫细胞纯化的重组纯化HIS‐C9ORF72:SMCR8:WDR41复合物浓度增加的函数。误差条表示SEM，N个=3。

接下来，我们通过细胞转染和免疫共沉淀实验证实，HA标记的C9ORF72与标记的SMCR8相互作用，并且需要同时存在SMCR8和C9ORF 72才能招募标记的WDR41（图1B） ●●●●。C9ORF72与SMCR8和WDR41之间的关联是直接的，因为HIS标记的C9ORF 72能够抑制杆状病毒感染昆虫细胞中表达的重组SMCR8与WDR41（图1C） ●●●●。技术上有意义的是，我们注意到C9ORF72与SMCR8的相互作用稳定并增加了C9ORF 72和SMCR8表达。C9ORF72型也编码约30 kDa的假定短剪接形式，但免疫共沉淀分析表明，该假定短C9ORF72亚型不与SMCR8或WDR41相互作用（图电动汽车1B） ●●●●。免疫共沉淀实验也表明C9ORF72和SMCR8与HSC70结合，但与BAG3不结合（图电动汽车1C） 表明BAG3的招募不是直接的，而是由HSC70介导的。C9ORF72是HSC70和BAG3途径的客户端还是调节器仍有待确定。

C9ORF72与SMCR8和WDR41复合体与RAB8a和RAB39b相互作用

蛋白质组分析显示C9ORF72与Rab8a和Rab39b相关（图电动汽车1A） ●●●●。然而，据报道，C9ORF72与Rab1、Rab5、Rab7和Rab11（Farg等,2014). 由于我们的蛋白质组分析是使用可能不完全代表组织蛋白质组复杂性的神经2A细胞裂解物进行的，因此我们测试了C9ORF72与各种其他Rab GTPase的关联。在测试的Rab蛋白中，我们证实了C9ORF72复合物与RAB8a相互作用，与RAB39b相互作用较弱，以及与它们的同源物RAB8b和RAB39a相互作用，但程度较低（图1D） ●●●●。值得关注的是，RAB8涉及果蝇属FTD模型（西部等,2015)并与ALS中突变的OPTN和TBK1相互作用（丸山等,2010; 奇鲁利等,2015; 弗赖施密特等,2015). 此外，X连锁基因的突变RAB39b型基因导致与自闭症、癫痫和早发性帕金森综合征相关的智力残疾（Giannandrea等,2010; 威尔逊等,2014). 在其他Rab测试中，C9ORF72复合物还与RAB6a、RAB12、RAB25、RAB33a和RAB38表现出一些弱相互作用（图1D） ●●●●。相反，C9ORF72单独或与SMCR8复合时，与RAB1、RAB5、RAB7和RAB11没有相互作用或相互作用很小（图1D） ●●●●。同样，我们也没有发现RAGA/D或RALB GTPases与C9ORF72单独或与SMCR8复合物相互作用。技术上有意义的是，WDR41的联合转染消除了各种Rab cDNA的表达；因此，用C9ORF72和SMCR8蛋白进行免疫共沉淀（图1D） ●●●●。RAB8a或RAB39b与C9ORF72、SMCR8和WDR41复合物之间的相互作用不受突变的抑制，这些突变将Rab蛋白锁定在构成型GDP结合非活性或组成型GTP结合活性形式中。进一步的免疫共沉淀分析表明，C9ORF72复合物与RAB8a或RAB39b之间的相互作用主要依赖于SMCR8的存在，因为C9ORF72或WDR41单独免疫沉淀少量RAB8b或无RAB39b（图电动汽车1D） ●●●●。在这方面，SMCR8单独表达免疫沉淀RAB8a和RAB39b，也表达一些其他Rab GTPase，包括RAB24、RAB32和RAB7L1，也称为RAB29（图电动汽车1E） 。当SMCR8与C9ORF72复合时，这些相互作用消失，这表明SMCR8对Rab GTPase蛋白的特异性可能会根据SMCR8的伙伴而改变。

由于这些实验是在转染细胞中进行的，我们接下来测试内源性C9ORF72复合物是否可以免疫沉淀内源性RAB8a和RAB39b。利用从杆状病毒感染的昆虫细胞纯化的重组HIS标记的C9ORF72、SMCR8和WDR41复合物，我们免疫小鼠，但尽管多次尝试，仍未能获得C9ORF 72特异性抗体。相反，我们成功地开发了一种针对SMCR8的单克隆抗体（1D2）。免疫印迹显示Smcr8、Rab8a和Rab39b均在小鼠大脑以及原代E18小鼠皮层神经元培养物中表达（图电动汽车1F） ●●●●。由于所测试的商业抗体质量较差，我们无法检测内源性C9orf72和Wdr41的表达，但C9orf 72在小鼠大脑中的表达此前已有报道（铃木等,2013). 重要的是，从小鼠全脑裂解物中免疫沉淀内源性Smcr8成功地降低了Smcr8，也降低了内源性C9orf72和Wdr41，以及Rab8a和Rab39b（图1E） 。相反，我们在Smcr8免疫沉淀中没有检测到内源性Rab5或Rab7（图1E） 从而证实了我们的转染实验。

与SMCR8和WDR41复合的C9ORF72是Rab GTP酶的全球环境基金

C9ORF72和SMCR8都包含Rab‐鸟嘌呤核苷酸交换因子（Zhang等,2012; 莱文等,2013). 因此，我们测试了由C9ORF72、SMCR8和WDR41组成的复合体是否具有任何GEF活动。纯化的重组GST标记的RAB8a预加载有32在从杆状病毒感染的昆虫细胞纯化的C9ORF72重组复合物数量增加的情况下，监测P标记的GDP和核苷酸释放。C9ORF72、SMCR8和WDR41复合物形成的复合物刺激了GDP释放，因为超过90%的40 pmol的RAB8a在25 pmol的C9ORF 72、SMCR 8和WDR 41复合物存在的情况下释放了其相关GDP（图1F） ●●●●。相比之下，单独添加重组纯化C9ORF72没有或几乎没有效果，这表明C9ORF 72只有在与SMCR8复合时才有活性（图1F） ●●●●。由于C9ORF72复合物也与RAB39b相互作用，我们测试了其GEF活性，发现与RAB8a类似，由C9ORF72、SMCR8和WDR41组成的复合物激活了重组纯化GST‐RAB39b的GDP释放（图1G） ●●●●。相反，单独添加重组纯化C9ORF72没有或几乎没有效果（图1G） ●●●●。作为对照，C9ORF72、SMCR8和WDR41形成的复合物不与RAB32或RAB29相互作用，对这些Rab GTPase没有或几乎没有GEF活性（图电动汽车1G） ●●●●。总的来说，这些结果表明，C9ORF72与SMCR8和WDR41形成一种特殊的复合物，至少对RAB8a和RAB39b起到GEF效应器的作用（图1H） 。

RAB8a和RAB39b与自噬受体P62相互作用

蛋白质组学分析表明，C9ORF72可能与P62相互作用，P62由SQSTM1系列多泛素化蛋白自噬降解的基因和靶点(表EV1). 免疫共沉淀实验证实，C9ORF72、SMCR8和WDR41形成的复合物与P62相互作用较弱，但也与类似P62的自噬受体OPTN相互作用较弱。进一步的免疫共沉淀分析指出，在C9ORF72复合物的蛋白质中，P62主要与WDR41和SMCR8相互作用（图电动汽车2A） 而OPTN主要与WDR41交互（图电动汽车2B） ●●●●。有趣的是SQSTM1系列或OPTN公司导致ALS（丸山等,2010; 费克托等,2011)、和OPTN公司是FTD的潜在修饰基因（Pottier等,2015). 我们注意到，C9ORF72复合物免疫沉淀的P62或OPTN数量较低，表明存在潜在的间接关联。由于OPTN与RAB8（Hattula&Peränen，2000; 皮利等,2012)，我们测试了C9ORF72复合物与P62的相互作用是否由中间蛋白，即RAB8或RAB39介导。事实上，HA标记的RAB8a和RAB39b很容易免疫沉淀标记的Flag标记的P62（图电动汽车2C） ●●●●。

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C9ORF72表达减少部分损害自噬

  1. HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解产物的免疫印迹分析，共表达HA标记的C9ORF72、HA标记的SMCR8或HA标记的WDR41和Flag标记的P62。
  2. HA标记的C9ORF72、HA标记的SMCR8或HA标记的WDR41与标记的OPTN共表达的HEK293细胞的HA免疫沉淀蛋白和裂解物的免疫印迹分析。
  3. HA免疫沉淀蛋白和HEK293细胞裂解产物的免疫印迹分析，这些细胞共表达HA标记的RAB8a或HA标记的带有Flag标记P62的RAB39b。
  4. 与GFP‐RFP‐LC3B共转染的小鼠GT1‐7神经元细胞的代表性图像，控制siRNA或靶向内源性siRNAC9或f72mRNA和Torin治疗或不治疗。
  5. 上面板，内源性LC3B（Map1lc3b）、C9orf72的免疫印迹分析，以及用对照siRNA或siRNA靶向转染的GT1‐7神经元细胞的Gapdh和actinC9或f72信使核糖核酸，是否用托林和/或巴非霉素A处理。下面板，内源性的实时RT-qPCR定量C9或f72mRNA表达与卢比0mRNA。
  6. 左图为转染对照siRNA或靶向siRNA的GT1‐7神经细胞内源性P62（Sqstm1）的免疫荧光标记的代表性图像C9或f72,Smcr8型，或第41周mRNA。右侧面板，P62骨料的量化。
  7. 左图，用对照siRNA或siRNA靶向转染的GT1-7神经元细胞上转染的构建体（绿色）和内源性P62（Sqstm1，红色）的免疫荧光标记的代表性合并图像C9或f72以及表达对照GFP或HA标记的C9ORF72长或短亚型的质粒。右侧面板，P62骨料的量化。

数据信息：比例尺，10μm。用DAPI对细胞核进行复染。误差条表示SEM。学生的t吨测试***P（P） < 0.001,n个=3。

C9ORF72表达减少改变自噬

C9ORF72与与自噬相关的各种蛋白质相互作用(表EV1; 贝伦兹等,2010; 法格等,2014). 因此，我们测试了C9ORF72型表达修饰神经元细胞的自噬。首先，我们评估了含有LC3B的囊泡的形成，LC3B是由地图1LC3B特异性脂化并定位于自噬小泡的基因。双标记GFP‐RFP‐LC3B在胚胎小鼠皮层神经元原代培养物中的表达显示出弥漫的细胞质定位和罕见的间断结构。相反，用抑制自噬抑制mTOR通路的都灵治疗，可诱导LC3B点的形成（图2A） ●●●●。重要的是，shRNA介导的C9或f72消除这种自噬激活（图2A） ●●●●。原代神经元培养物中GFP‐RFP‐LC3B的表达显示GFP/RFP比率没有差异。这一比率反映了自噬体的形成速率与它们与溶酶体融合的关系，表明C9ORF72作用于自噬小体的形成，而不是通过溶酶体降解。类似的抑制作用C9或f72在用雷帕霉素而不是都灵处理的原代神经元培养物中观察到siRNA对自噬激活的影响，或者当GT1‐7细胞（一种转化的小鼠神经元细胞系，表达类似水平的C9或f72与原代神经细胞培养相比，进行了测试（图电动汽车2D） ●●●●。接下来，我们通过研究脂化LC3B的比率来确认这些结果。Western blotting分析显示，在用表达shRNAs的慢病毒转导的胚胎小鼠皮层神经元原代培养物中，磷脂酰乙醇胺连接的LC3B-II水平略有下降C9或f72处于基础状态（图2B） ●●●●。由于shRNA介导的C9orf72的耗竭消除了LC3B的脂化激活，因此这种抑制作用在都灵处理的神经元中更加明显（图2B） ●●●●。雷帕霉素替代都灵治疗的神经元或GT1‐7神经元细胞也观察到相同的结果（图电动汽车2E） 。通过蛋白质印迹证实了至少50%的C9orf72表达的缺失，并且由于所使用的商业抗体的质量差，通过RT–qPCR进一步证实了这一点（图2B和电动汽车2E） 。此外，我们还发现C9orf72的表达减少，但并没有完全消除经巴非霉素A1（一种自噬体降解抑制剂）处理的神经元细胞中LC3B‐II的积累（图电动汽车2E） 。总的来说，这些数据表明C9ORF72的缺失对自噬有部分有害影响。

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C9的减少表达ORF公司72部分损害自噬

  1. 左图，用GFP‐RFP‐LC3B转染并用表达对照shRNA或shRNA靶向的慢病毒转导的E18小鼠皮层神经元的器官型培养物的代表性图像C9或f72mRNA和Torin处理或不处理。右侧面板，LC3B点的量化。
  2. 上面板，内源性LC3B（Map1lc3b）、C9orf72和用表达控制shRNA或靶向shRNA的慢病毒转导的E18小鼠皮层神经元的控制肌动蛋白的免疫印迹分析C9或f72mRNA和Torin处理或不处理。下面板，实时RT-qPCR定量内源性C9或f72mRNA表达与卢比mRNA。
  3. 左面板，内源性P62（Sqstm1）在E18小鼠皮层神经元器官型培养物上的免疫荧光标记的代表性图像，用表达对照shRNA或靶向shRNA的慢病毒颗粒转导C9或f72右侧面板，P62骨料的量化。
  4. 左面板，转染siRNA靶向转染GT1‐7神经元细胞的转染构建物（绿色）和内源性P62（Sqstm1，红色）的免疫荧光标记的代表性图像C9或f72以及表达对照GFP和HA标记的野生型或突变型RAB39b（CA、Q68L或CN、S22N）、RAB8a或RAB7的质粒。右侧面板，P62骨料的量化。

数据信息：比例尺，10μm。用DAPI对细胞核进行复染。误差条表示SEM。学生的t吨‐测试*P（P） < 0.05, ***P（P） < 0.001,n个 = 3.可在线获取此图的源数据。

自噬是清除错误折叠或聚集蛋白质的关键机制。因此，我们测试了C9ORF72的缺失是否对蛋白质聚集体的降解有任何影响。P62蛋白，由SQSTM1系列该基因将多泛素化蛋白质的聚集体桥接到LC3B，从而将这些蛋白质靶向自噬。此外，P62阳性聚集物是ALS‐FTD患者的组织学特征，GGGCCC重复序列在C9ORF72型（Al‐Sarraj）等,2011). P62的免疫荧光标记表明，在耗尽C9或f72在胚胎小鼠皮层神经元的原代培养中（图2C） ●●●●。对于GT1‐7神经元细胞或C9orf72的伴侣，即Smcr8和Wdr41，当siRNA缺失时，获得了相同的结果（图电动汽车2F） ●●●●。作为对照，优化HA标记的C9ORF72的表达，其核苷酸序列对靶向内源性小鼠的siRNA具有耐药性C9或f72mRNA，完全挽救了siRNA介导的C9orf72缺失引起的自噬功能障碍（图电动汽车2G） ●●●●。有趣的是，虽然C9ORF72的长亚型挽救了自噬功能障碍，但短型C9ORF 72在这方面是无效的（图电动汽车2G） ●●●●。这些结果表明，C9ORF72的短亚型要么是一个空变体，要么具有与自噬无关的细胞功能。

RAB39b纠正C9ORF72耗竭引起的自噬功能障碍

C9ORF72的耗竭改变了自噬，与SMCR8复合的C9ORF72相互作用并促进RAB8a和RAB39b的GDP/GTP交换，这是两种参与自噬的Rab GTP（Pilli等,2012; Seto公司等,2013). 这对C9ORF72与RAB8a或RAB39b相互作用的相关性提出了质疑，尤其是对控制自噬。重要的是，RAB39b的组成活性（Q68L，突变CA）形式的表达被锁定在其GTP构象中，因此不需要任何GEF活性，完全纠正了C9orf72表达减少引起的自噬改变（图2D） ●●●●。野生型HA标记的RAB39b的表达仅对自噬补救产生部分影响，而GDP锁定的构成性阴性（S22N，突变CN）RAB39c不能补救由siRNA介导的C9orf72缺失引起的自噬改变。作为RAB39b特异性的对照，RAB7、RAB29、RAB32或野生型、组成性活性或非活性RAB8A的表达并不能挽救C9或72缺失引起的自噬改变（图2D） ●●●●。这些结果表明，C9ORF72复合物对RAB39b的GEF活性对控制神经元细胞的自噬很重要。

TBK1磷酸化SMCR8

C9ORF72的串联标签纯化鉴定出与TANK结合激酶1（TBK1）的假定弱相互作用(表EV1). 有趣的是TBK1型导致ALS（Cirulli等,2015; 弗赖施密特等,2015)与C9ORF72复合物相互作用的RAB8通过激酶TBK1（Pilli）参与细胞内病原体的自噬清除等,2012). 因此，我们测试了C9ORF72复合物是否会与TBK1激酶复合物相互作用。免疫共沉淀实验表明，C9ORF72和SMCR8形成的复合物并不直接与TBK1结合，而是与所有三种TBK1衔接蛋白相互作用（图三A） 即TANK、SINTBAD(TBKBP1型)和NAP1(AZI2型). 这些衔接蛋白对于将TBK1导向特定的细胞成分和功能至关重要，尤其是自噬（Goncalves等,2011). 这些相互作用质疑TBK1是否磷酸化C9ORF72。体外激酶分析表明TBK1磷酸化SMCR8，而不是C9ORF72或WDR41（图三B） ●●●●。我们使用从HEK293细胞中过度表达的纯化TBK1和从杆状病毒感染的昆虫细胞中纯化的重组HIS‐C9ORF72、SMCR8和WDR41复合物重复了该实验。质谱分析确定SMCR8丝氨酸402和苏氨酸796为TBK1磷酸化位点（图三C） ●●●●。与TBK1（Ma）其他底物中确定的一致基序一致等,2012)，SMCR8丝氨酸402和苏氨酸796之后都是亮氨酸。

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SMCR公司8被磷酸化TBK（待定）1

  1. 共同表达HA标记C9ORF72和HA标记SMCR8的HEK293细胞的HA免疫沉淀蛋白和裂解物的免疫印迹分析，以及标记TBK1、NAP1、TANK或SINTBAD的标志物。
  2. HEK293中表达的免疫沉淀HA标记的C9ORF72、HA标记的SMCR8和HA标记的WDR41受到在体外γ‐存在下的TBK1激酶测定32P‐放射性标记ATP。蛋白质通过SDS-PAGE迁移分离，通过放射自显影术检测磷酸化（上面板），而通过Western blotting检测表达（下面板）。
  3. 质谱法鉴定SMCR8磷酸化位点在体外HIS标记的C9ORF72:SMCR8:WDR41复合物的TBK1激酶检测从杆状病毒感染的昆虫细胞中纯化。
  4. 上面板，转染构建物（绿色）和内源性P62（Sqstm1，红色）的免疫荧光标记的代表性图像，在转染了靶向3′UTR的siRNA的GT1‐7神经元细胞上Smcr8型表达对照GFP和HA标记的野生型或突变体SMCR8（TA、S402A和T796A；TD、S402D和T796D；UD、S400D、S492D、S562D和T666D）的mRNA和质粒。下部面板，P62骨料的量化。
  5. 上面板，转染siRNA靶向转染GT1‐7神经元细胞的转染构建物（绿色）和内源性P62（Sqstm1，红色）的免疫荧光标记的代表性图像Tbk1型以及表达对照GFP和HA标记的野生型或突变型SMCR8或RAB39b的质粒。下部面板，P62骨料的量化。

数据信息：比例尺，10μm。用DAPI对细胞核进行复染。误差条表示SEM。学生的t吨‐测试*P（P） < 0.05, ***P（P） < 0.001,n个 = 3.可在线获取此图的源数据。

SMCR8的TBK1磷酸化对自噬很重要

我们构建了SMCR8的TBK1磷酸化死亡（S402A，T796A）和磷酸化拟态（S402D，T796 D）突变体，并注意到这些突变体在转染的神经元细胞中正常定位和表达。此外，SMCR8免疫沉淀C9ORF72和WDR41以及野生型SMCR8的磷酸死亡和磷酸模拟突变体，表明SMCR8 S402和T796的突变不会改变SMCR8形成复合物的表达、稳定性、结构和能力。接下来，我们测试了SMCR8磷酸化对其细胞功能是否重要。Smcr8的耗竭改变了自噬，如P62聚集体在转染siRNA靶向3′UTR的神经元GT1‐7细胞中的积累所示Smcr8型mRNA（图三D） ●●●●。免疫印迹法证实内源性Smcr8表达缺失（图电动汽车3A） ●●●●。作为对照，联合转染siRNA抗性HA标记的SMCR8 cDNA可纠正SMCR8表达减少导致的自噬功能障碍（图三D） ●●●●。重要的是，HA标记的SMCR8的S402D和T796D双突变体（突变TD）的表达，模拟了SMCR8组成性TBK1磷酸化，也纠正了由siRNA介导的SMCR8缺失引起的自噬功能障碍（图三D） ●●●●。相比之下，磷酸化死亡（S402A，T796A；突变TA）SMCR8不能挽救自噬改变（图三D） 证明了SMCR8磷酸化对其功能的重要性。作为进一步的对照，SMCR8的一个与TBK1无关的磷酸化突变体（SMCR8 S400D，S492D，S562D，T666D；突变体UD）没有纠正由siRNA介导的SMCR8缺失引起的自噬改变（图三D） ●●●●。

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SMCR8被ULK1磷酸化

  1. 转染对照siRNA或靶向3′UTR的siRNA的GT1‐7细胞内源性Smcr8或Gapdh的免疫印迹分析Smcr8型.
  2. 转染对照siRNA或靶向siRNA的GT1‐7细胞内源性Tbk1或Gapdh的免疫印迹分析Tbk1型.
  3. 共同表达HA标记C9ORF72和/或HA标记SMCR8和/或带有Flag标记ULK1的HA标记WDR41的HEK293细胞的HA免疫沉淀蛋白和裂解物的免疫印迹分析。
  4. HA标记的C9ORF72、HA标记的SMCR8和HA标记的WDR41在HEK293中共同表达，免疫沉淀在体外γ‐存在下的ULK1激酶测定32P‐放射性标记ATP。通过SDS-PAGE凝胶上的迁移分离蛋白质，并通过放射自显影术检测磷酸化（上图），而通过Western blotting检测表达（下图）。
  5. 重组HIS标记的C9ORF72:SMCR8:WDR41复合物从杆状病毒感染的昆虫细胞中纯化后磷酸化在体外通过ULK1和SMCR8磷酸化位点通过质谱鉴定。
  6. 上面板，用对照siRNA或siRNA靶向转染的GT1‐7神经元细胞上内源性P62（Sqstm1，红色）免疫荧光标记的代表性图像Tbk1型或乌尔克1和Ulk2公司下面板，P62骨料的量化。

数据信息：误差条表示SEM，n个=3。比例尺，10μm。用DAPI对细胞核进行复染。

然后我们研究SMCR8磷酸化对TBK1细胞功能是否重要。siRNA介导的Tbk1缺失促进了神经元GT1‐7细胞中P62聚集体的积累（图三E） 。免疫印迹证实Tbk1表达降低（图电动汽车3B） ●●●●。有趣的是，野生型HA标记的SMCR8的表达仅部分缓解了Tbk1缺失引起的自噬功能障碍（图三E） 。相反，转染SMCR8的S402D和T796D突变体（突变体TD），其模拟组成型TBK1磷酸化，完全纠正了由TBK1缺失引起的自噬改变（图三E） 。作为对照，一个磷酸化死亡（S402A，T796A；突变TA）以及一个与TBK1无关的SMCR8磷酸化突变体（SMCR8 S400D，S492D，S562D，T666D；突变UD）无法挽救由siRNA介导的TBK1耗竭引起的自噬改变（图三E） 。重要的是，Tbk1的缺失也可以通过组成活性GTP锁定的HA标记的RAB39b的表达来纠正，但不能通过组成活性RAB8A来纠正（图三E） 。总的来说，这些结果表明TBK1对SMCR8的磷酸化对控制自噬很重要，而且TBK1、C9ORF72复合物和RAB39b属于调节神经元细胞自噬的共同途径。

ULK1磷酸化SMCR8

我们注意到，SMCR8最初被鉴定为ULK1激酶复合物的相互作用物，其启动自噬（Behrends等,2010). 类似地，我们对C9ORF72的串联标签纯化发现了与ULK1激酶复合物的一个成分，即Fip200的潜在弱相互作用，该复合物由1卢比基因(表EV1). 免疫共沉淀实验证实，C9ORF72、WDR41和SMCR8形成的复合物与ULK1的相互作用较弱，这种相互作用主要依赖于SMCR8的存在（图电动汽车3C） ●●●●。与TBK1类似，在体外激酶分析表明，ULK1单独或以复合物磷酸化SMCR8，但不磷酸化C9ORF72或WDR41（图电动汽车3D） ●●●●。质谱分析确定SMCR8丝氨酸400、丝氨酸492、丝氨酸562和苏氨酸666或丝氨酸667为ULK1磷酸化位点（图电动汽车3E） 。然而，与siRNA介导的Tbk1耗竭相比，神经元GT1‐7细胞中使用siRNA耗竭Ulk1或Ulk1-Ulk2只能导致P62聚集体的部分积累（图电动汽车3F） ●●●●。此外，模拟ULK1激酶对SMCR8构成性磷酸化的SMCR8的磷酸化突变体（S400D，S492D，S562D，T666D；突变体UD）没有纠正SMCR8缺失引起的自噬改变（图三D） ●●●●。总的来说，这些结果表明，与ULK1相比，在GT1‐7神经元细胞和我们研究的时间范围内，TBK1激酶对SMCR8的磷酸化在调节自噬方面起着关键作用。

C9ORF72表达减少促进TDP‐43的聚集

ALS‐FTD患者的脑切片特征是存在含有TAR DNA结合蛋白43（TDP‐43）的神经细胞质内含物，该蛋白异常泛素化、磷酸化和截断（Arai等,2006; 诺依曼等,2006). 由于TDP‐43的聚集物通过自噬（Filimonenko等,2007; 朱等,2009; 乌什塔尼语等,2010; 王等,2012; 巴尔马达等,2014; 苏格兰人等,2014)，我们测试了C9或f72对TDP‐43有任何影响。重要的是，Western blotting分析表明shRNA介导的C9或f72在小鼠胚胎皮层神经元中，诱导Tdp‐43截短片段~30 kDa的积累（图4A） ●●●●。同样，针对Tdp‐43磷酸化丝氨酸409/410的免疫荧光分析证实，在C9orf72缺失的神经元中，Tdp‐43的细胞质聚集体积聚（图4B） ●●●●。请注意，在用C9orf72 shRNA慢病毒转导7天后，在原代神经元培养物中明显存在Tdp‐43聚集体的积累，而在用C9 orf72 siRNA处理24小时的GT1‐7神经元细胞中，我们没有检测到Tdp­43聚合体的积累，这表明Tdp−43的积累可能是细胞或时间依赖性的。最后TARDBP公司，编码TDP-43，导致TDP-43蛋白聚集并导致ALS‐FTD（Gitcho等,2008; 卡巴夏等,2008; 卢瑟福等,2008; 斯里达兰等,2008; 范·德林等,2008; 横滨等,2008). 我们发现C9ORF72的过度表达降低了TDP‐43的D169G突变体的聚集（图4C） ●●●●。这些结果与先前的研究一致，表明增强自噬可以纠正突变TDP‐43的聚集和毒性（Wang等,2012; 巴尔马达等,2014).

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C9的减少表达ORF公司72促进技术开发计划‐43

  1. 用表达对照shRNA或靶向shRNA的慢病毒转导的E18小鼠皮层神经元内源性Tdp‐43、C9orf72和对照Gapdh的免疫印迹分析C9或f72mRNA。
  2. 左面板，内源性磷酸化Ser409/410‐Tdp‐43在E18小鼠皮层神经元原代培养物上的免疫荧光标记的代表性图像，用表达对照shRNA或shRNA靶向的慢病毒颗粒转导C9或f72右面板，细胞质Tdp‐43聚集体的量化。
  3. 左面板，D169G突变GFP标记TDP‐43在转染HA标记对照或HA‐C9ORF72质粒的E18小鼠皮层神经元原代培养物上的免疫荧光标记的代表性图像。右侧面板，含TDP‐43细胞质聚集物的细胞定量。

数据信息：比例尺，10μm。用DAPI对细胞核进行复染。误差条表示SEM。学生的t吨‐测试***P（P） < 0.001,n个 = 3.可在线获取此图的源数据。

由于SMCR8、C9orf72或Tbk1的缺失，SMCR8和组成活性GTP锁定的RAB39b的类磷酸突变体纠正了自噬改变，表明这些蛋白质属于同一途径。由于TDP‐43间接调节自噬（Bose等,2011; 夏等,2016)，我们测试了C9ORF72或RAB39b是否可以挽救由表达减少引起的自噬失调Tardbp公司Tdp‐43的耗竭部分改变了自噬，如用siRNA靶向转染的神经元GT1‐7细胞中P62聚集体的积累所示Tardbp公司（图电动汽车4). 然而，我们发现C9ORF72、SMCR8或野生型或组成活性RAB8A或RAB39b转染后，自噬没有得到纠正（图电动汽车4). 这些阴性结果强调了RAB39b对TBK1和C9ORF72的特异性，但也表明，虽然TDP‐43调节自噬，但这种调节独立于TBK1、C9ORF 72和RAB39b通路或其下游。这与最近的报告一致，即TDP‐43的缺失下调了Dynactin 1 mRNA，这在自噬体与溶酶体融合的后期损害了自噬（Xia等,2016).

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C9ORF72的表达减少促进TDP‐43的聚集

上面板，转染siRNA靶向转染GT1‐7神经元细胞的转染构建物（绿色）和内源性P62（Sqstm1，红色）的免疫荧光标记的代表性图像Tardbp公司以及表达对照GFP和HA标记的C9ORF72或野生型或突变型RAB8a或RAB39b的质粒。下部面板，P62骨料的量化。误差条表示SEM，n个 = 3.

C9ORF72表达降低协同Ataxin‐2 Q30x毒性

由于C9ORF72的表达减少抑制了自噬并促进TDP-43聚集物的积累，因此我们寻找了其他可能在C9ORF 72耗尽时积累的易于聚集的蛋白质。共济失调-2（由基因编码ATXN2型)是一种细胞质RNA结合蛋白，与聚（a）结合蛋白（PABP）相互作用并调节mRNA稳定性（Kozlov等,2001; 横须等,2014). 34种谷氨酰胺的异常膨胀ATXN2型导致脊髓小脑共济失调2型（SCA2）（Imbert等,1996; 普尔斯特等,1996; 三币等,1996)而polyQ的中度扩张（27–33重复）增加了ALS‐FTD（老年人等,2010; 达乌德等,2011; 罗斯等,2011; 范·达姆等,2011; 拉坦特等,2014). 我们发现，具有控制长度（Q22x）和中等大小（Q30x）polyQ的HA标记的Ataxin‐2广泛定位于胚胎小鼠皮层神经元原代培养物的细胞质中（图5A） ●●●●。重要的是，shRNA介导的C9orf72表达减少促进了原代培养神经元中具有中间polyQ长度的共济失调-2聚集体的积累（图5A） ●●●●。在GT1‐7神经元细胞或C9orf72的伴侣，即Smcr8和Wdr41，siRNA缺失时，也观察到类似的结果（图电动汽车5A） ●●●●。作为对照，用巴非霉素A1（一种阻止自噬的药物）治疗神经元细胞也促进了共济失调-2 Q30x聚集物的积累（图电动汽车5A） ●●●●。相反，C9orf72、Smcr8、Wdr41或bafilomycin处理的缺失对Ataxin‐2的扩散定位没有影响，而对照（Q22x）polyQ大小（图5A和电动汽车5A） ●●●●。免疫印迹证实，与对照siRNA相比，siRNA介导的C9orf72、Smcr8、Wdr41或bafilomycin治疗的缺失后，HA标记的Ataxin‐2 Q22x表达相同（图电动汽车5B） ●●●●。类似地，HA标记的Ataxin‐2 Q30x在对照组和siRNA处理的C9orf72、Smcr8或Wdr41之间的表达是相同的，但在巴非霉素A1处理后略有增加（图电动汽车5B） ●●●●。与先前观察到的具有中等大小polyQ（Elden）的Ataxin‐2稳定性增加一致等,2010)，我们注意到HA标记的Ataxin‐2 Q30x的表达水平是HA标记的Antaxin‐）2 Q22x的两到三倍（图电动汽车5B和C）。作为进一步的对照，C9orf72缺失对Ataxin‐2 Q30x聚集的影响是特定的，因为我们没有观察到突变SOD1、突变FUS、huntingtin或Ataxin­3在siRNA介导的缺失后随着polyQ扩增而聚集增加C9或f72表达，至少在转染细胞和我们研究的时间范围内（图电动汽车5D） ●●●●。

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C9的减少表达ORF公司72协同Ataxin‐2毒性

  • A类
    左面板，共转染HA标记的E18小鼠皮层神经元器官型培养的代表性图像ATXN2型带有对照（Q22x）或中间（Q30x）polyQ大小，并用表达对照shRNA或shRNA靶向的慢病毒转导C9或f72mRNA。右侧面板，Ataxin‐2聚集体的量化。比例尺，10μm。用DAPI对细胞核进行复染。
  • B类
    与HA标记基因共转染的GT1‐7神经元细胞的细胞活力（四氮唑分析）ATXN2型带有控制（Q22x）或中间（Q30x）polyQ大小并控制siRNA或siRNA靶向C9或f72mRNA。误差条表示SEM，n个=3。
  • C
    轻触斑马鱼受精后48小时幼体游泳轨迹的追踪。
  • D–F型
    触摸诱发游泳距离（D）、平均速度（E）和达到的最大速度（F）的量化显示注射HA标记的斑马鱼的功能严重受损ATXN2型具有polyQ（Q30x）和反义吗啉寡核苷酸（AMO）的中间长度C9或f72与对照HA标记相比ATXN2型（Q22x）或针对C9或f72.
  • G公司
    用抗-Sv2免疫组化显示的运动神经元的代表性图像显示，注射这两种药物的鱼出现严重的轴突病变ATXN2型Q30x和AMO对比C9或f72与注射对照药物的斑马鱼相比ATXN2型Q22x或AMOC9或f72独自一人。
  • H（H）
    运动神经元轴突长度的量化显示，受精后48小时注射这两种药物的斑马鱼幼鱼轴突长度显著减少ATXN2型Q30x和AMO对比C9或f72与对照组相比。

数据信息：误差条表示SEM。学生的t吨‐测试***P（P）<0.001（A，B）或单向方差分析**P（P）<0.01（D–F，H），n个 = 3.

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C9ORF72表达减少协同共济失调-2毒性

  • A类
    HA标记的GT1‐7神经细胞共转染的代表性图像ATXN2型控制（Q22x）或中间（Q30x）polyQ大小，并控制siRNA或靶向内源性siRNAC9或f72mRNA。
  • B、 C类
    内源性Gapdh或转染HA标记的Ataxin‐2的免疫印迹分析，带有GT1‐7细胞中polyQ的（B）对照（Q22x）长度或（C）中间（Q30x）长度。
  • D类
    用GFP标记的突变体SOD1、FUS、HTT或Ataxin-3和对照siRNA或靶向内源性siRNA共转染的GT1-7神经元细胞的代表性图像C9或f72mRNA。
  • 电子
    RT-qPCR定量内源性C9或f72表达式相对于Gapdh公司mRNA不匹配或C9或f72注射反义吗啉寡核苷酸（AMO）的斑马鱼。
  • F类
    RT–qPCR定量外源HA标记ATXN2型polyQ相对于内源性的正常长度（Q22x）或中间长度（Q30x）Gapdh公司斑马鱼中注射对照或HA标记的ATXN2构建物以及与之匹配的AMO或AMO的mRNAC9或f72.
  • G公司
    轻触斑马鱼受精后48小时幼体游泳轨迹的追踪。
  • H–J型
    触摸诱发的游泳距离（H）、平均速度（I）和达到的最大速度（J）的量化显示，单独注射HA标记后没有损伤ATXN2型带有控制（Q22x）或polyQ的中间长度（Q30x）。同样，注射不匹配的反义吗啉寡核苷酸（AMO）C9或f72单独或带有HA标签ATXN2型Q22x或Q30x未显示功能改变。

数据信息：比例尺，10μm。用DAPI对细胞核进行复染。误差条表示SEM，n个 = 3.

接下来，我们研究了C9ORF72表达的减少是否会导致神经元活性的降低。与之前的报告一致（温等,2014)siRNA或shRNA介导的C9或f72在神经元原代培养中，至少在我们研究的条件和时间范围内，诱导了显著的细胞死亡（图5B） ●●●●。类似地，具有控制（Q22x）或中间（Q30x）大小polyQ的共济失调-2的表达对神经元的存活率几乎没有影响（图5B） ●●●●。相比之下，C9orf72的表达减少和具有中等大小polyQ（Q30x）的Ataxin‐2的同时表达诱导了神经元细胞死亡（图5B） ●●●●。作为对照，siRNA介导的C9orf72缺失与对照Ataxin‐2（Q22x）的伴随表达并没有降低神经元细胞活力（图5B） ●●●●。

确认这些结果体内，我们建立了C9orf72表达减少的斑马鱼模型，该模型表达具有正常或中等大小polyQ的共济失调-2。技术上有意义的是，与之前的研究（Ciura）相比，我们使用了少量（50%）已知的反义吗啉寡核苷酸（AMO）来阻断斑马鱼C9ORF72同源基因的翻译等,2013). 在这些情况下，我们观察到几乎没有毒性，也没有与C9orf72减少相关的异常运动表型（图5C） ●●●●。内源性斑马鱼的定量C9或f72RT-qPCR证实，与对照条件相比，注射反义AMO后C9orf72的表达部分（50-60%）降低（图电动汽车5E） 。我们还通过RT–qPCR控制注射斑马鱼中HA标记的Ataxin‐2 Q22x或Q30x的相等表达（图电动汽车5F） ●●●●。与之前的结果一致（Elden等,2010)，我们注意到与Ataxin‐2 Q22x相比，Ataxin­2 Q302x的表达更高（图电动汽车5F） ●●●●。重要的是，我们没有观察到与Ataxin-2的唯一表达相关的毒性，该表达具有正常（Q22x）或中间（Q30x）长度的polyQ（图电动汽车5G） ●●●●。相反，C9orf72的表达减少与中等大小polyQ（Q30x）的共济失调-2的表达相关，导致运动行为异常，特别是触摸诱发的逃避反应减少（图5C） ●●●●。事实上，通过轻触鱼尾刺激后，C9orf72敲倒的斑马鱼胚胎的游动距离、平均速度和最大速度都显著降低，并用30种谷氨酰胺表达共济失调-2（图5D–F）。作为对照，C9orf72的表达减少，伴随着Ataxin‐2的表达，控制长度为polyQ（Q22x），对逃避反应后的游泳发作没有显著的致病作用（图5D–F）。此外，通过注射相同浓度的对照组错配吗啉酸来证实表型的特异性，该吗啉酸不会引起任何运动表型（图电动汽车5G–J）。作为进一步的对照，Ataxin-2与对照或中间长度的polyQ单独或与错配的反义吗啉寡核苷酸的表达也不会引起任何运动表型（图电动汽车5G–J）。

最后，我们用免疫荧光法检测突触囊泡标记物Sv2，分析了脊髓运动神经元轴突投射的形态。与上述结果类似，C9orf72的单独敲除或Ataxin‐2的单独表达（Q22x或Q30x）与对照非注射或错配AMO注射鱼相比没有任何影响（图5G） ●●●●。此外，敲除C9orf72并伴随表达Ataxin‐2和polyQ的对照大小（Q22x）没有毒性作用（图5G和H）。相反，C9orf72的表达减少，同时Ataxin-2的表达和中等大小的polyQ（Q30x）的表达导致运动神经元轴突的树枝化和缩短（图5G和H）。总的来说，这些结果表明，部分敲除C9ORF72不会导致主要神经细胞死亡，但会与中等长度polyQ的Ataxin‐2的毒性协同作用，导致运动神经元和运动表型的改变体内.

讨论

总之，我们发现C9ORF72属于包含SMCR8和WDR41蛋白的复合物。该复合物被TBK1和ULK1激酶磷酸化，是RAB8a和RAB39b GTPases的GDP/GTP交换因子，并调节自噬（图6). 这些结果让人想起由卵泡蛋白（FLCN）、卵泡蛋白相互作用蛋白-1和卵泡蛋白交互作用蛋白-2（FNIP1和FNIP2）形成的复合物，它们包含不同的DENN模块，分别与SMCR8和C9ORF72有一些同源性（张等,2012; 莱文等,2013). FLCN是一种在各种癌症和Birt–Hogg–Dubé综合征中被破坏的肿瘤抑制蛋白，它对RagC/D调节mTORC1活性表现出GTPase激活活性（Petit等,2013; Tsun（村）等,2013). 此外，与C9ORF72复合物类似，FLCN是Rab GTPases的GEF，被ULK1磷酸化，并参与控制自噬（Nookala等,2012; 邓洛普等,2014).

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C9的暂定模型ORF公司72功能

  1. C9ORF72与SMCR8和WDR41复合体作为RAB39b GTPase的GDP/GTP交换因子，与P62自噬受体相互作用。TBK1对SMCR8的磷酸化可能促进C9ORF72 GEF活性，并增强具有中间polyQ大小的蛋白质（如TDP-43或Ataxin‐2）的自噬周转。在缺乏C9ORF72的情况下，这些蛋白质的自噬清除率降低，具有中间长度polyQ的TDP‐43、P62或Ataxin‐2积聚成细胞质聚集物。
  2. 自噬受体（如P62或OPTN）作为中枢，将Rab GTPase与其GEF效应器和激酶调节器聚集在一起，在受损细胞器、蛋白质聚集体或细胞内病原体的位置准确启动自噬。

然而，我们的结果表明，C9ORF72与SMCR8复合物与RAB8a和RAB39b的相互作用与之前的报告不同，之前的报告发现C9ORF 72与RAB1、RAB5、RAB7和RAB11（Farg等,2014). 这些差异是这两项研究中使用的不同方法所固有的。值得注意的是，我们在复合物中测试了C9ORF72，而Farg和同事则单独研究了C9ORF72。同样，在我们的研究中，Farg和同事中的50 mM Tris与150 mM NaCl中的50 mmM Tris相比，免疫沉淀洗涤缓冲液的组成有所不同。此外，我们发现针对C9ORF72的商业抗体对携带内源性蛋白免疫沉淀的特异性较差。这两项研究之间的第二个分歧是，Farg及其同事观察到siRNA介导的C9orf72缺失增加了基础状态下的LC3B-II水平。相反，在基础状态下，我们观察到siRNA或shRNA介导的C9ORF72耗竭对LC3B的影响很小，但在研究自噬通量时观察到LC3B脂质过氧化的显著抑制。这些差异可能源于不同程度的siRNA介导的C9ORF72耗竭和/或所用的不同细胞（我们研究中的初级E18皮层神经元和GT1-7细胞与Farg及其同事中的SH-SY5Y细胞），因为已知基础自噬和LC3B水平因细胞类型而异。

重要的是，C9ORF72在自噬中的作用与P62的积累增加以及从C9ORF 72 iPS细胞（Almeida等,2013). 同样，C9ORF72表达减少后TDP‐43和P62阳性蛋白聚集体的积累使人联想到自噬功能障碍，并重现了ALS‐FTD患者的主要组织病理学特征（诺依曼等,2006; Al‐Sarraj公司等,2011). 在这方面，值得注意的是，在参与蛋白质清除途径的基因中发现了导致ALS‐FTD的各种突变，包括UBQLN2号机组,CHMP2B、VCP,OPTN公司,SQSTM1系列、和TBK1型（斯基宾斯基等,2005; 约翰逊等,2010; 丸山等,2010; 邓等,2011; 费克托等,2011; 奇鲁利等,2015; 弗赖施密特等,2015). 因此，我们的工作将C9ORF72表达减少与部分自噬缺陷联系起来，为ALS‐FTD蛋白清除机制受损提供了进一步支持。然而，值得注意的是，我们的siRNA方法导致75%或更多的C9或f72而ALS‐FTD患者大脑中C9ORF72水平降低50%或更少。类似地TBK1型通过单倍充足机制引起疾病，而我们的siRNA使Tbk1的表达减少了近80%。因此，我们只能推测，患者体内C9ORF72或TBK1活性的部分降低可能导致次优的自噬途径，这反过来可能有助于疾病的发病机制。

本研究的第二个重要结论是，组成性活性GTP锁定的RAB39b可以纠正TBK1或C9ORF72缺失引起的自噬改变。因此，我们认为TBK1、C9ORF72复合物和RAB39b属于调节神经元细胞自噬的共同途径（图6A） ●●●●。该模型类似于ULK1介导的鸟嘌呤核苷酸交换因子DENND3磷酸化，该因子激活Rab12并促进自噬（Xu等,2015)这表明GDP/GTP交换因子磷酸化可能是一种广泛而新颖的激活Rab GTPase自噬的途径。由于RAB39b和RAB8a与P62和OPTN相互作用，我们的结果也支持一个模型，即自噬受体，如P62或OPTN，作为重要枢纽，利用LC3B和特定的Rab GTPases及其GEF效应器和激酶调节器收集自噬底物，以便在蛋白质聚集体、功能失调细胞器或细胞内病原体的位置准确启动自噬（图6B） ●●●●。该模型得到了TBK1对P62或OPTN的相互作用和磷酸化的支持（野生等,2011; 皮利等,2012)此外，最近有报道称OPTN和TBK1对PINK1‐Parkin有丝分裂途径的重要性，在帕金森氏病（Heo等,2015; 拉扎鲁等,2015; 松本等,2015). 在这方面，X连锁基因的突变RAB39b型基因导致早发性帕金森病（威尔逊等,2014)而在GGGCC扩张的罕见病例中观察到非典型帕金森综合征C9ORF72型（威尔克等,2016).

这项工作还提出了几个问题。首先，我们注意到C9ORF72复合体对RAB8a和RAB39b起着全球环境基金的作用；然而，我们并没有测试所有现有的Rab蛋白，C9ORF72复合物可能潜在地调节各种其他Rab GTPase。同样，尚不清楚哪些Rab蛋白在哪些组织、发育时间或条件下启动和调节自噬。在这方面，RAB8和RAB39在自噬中的确切分子功能仍有待阐明。RAB8a和RAB39b与P62的结合表明，这些Rab GTPases可能作用于自噬体的形成。然而，这些Rab GTPase是否也可以调节自噬体向多泡体或溶酶体的运输或融合尚待确定。此外，我们发现TBK1对SMCR8的磷酸化对控制神经元细胞的自噬很重要。然而，仍需测试SMCR8磷酸化对C9ORF72复合物的GDP/GTP交换活性的重要性。同样，激活TBK1的信号通路尚不清楚。事实上，TBK1激活可能需要上游激酶（Heo等,2015)而第二个非排他性模型提出，通过OPTN募集TBK1的局部浓度可以通过反式自动磷酸化（Matsumoto）自动激活TBK1等,2015). 此外，SMCR8还与ULK1、mTOR和AMPK激酶复合物的蛋白质相互作用(表EV1)据报道，SMCR8被mTOR磷酸化（Hsu等,2011)和AMPK（霍夫曼等,2015; 夏弗等,2015)，但后果未知。

同样有趣的是，在E18小鼠皮层神经元的原代培养中，但在GT1‐7细胞中，当C9ORF72耗尽时，TDP‐43聚集体的积累。这种差异可能源于GT1‐7细胞分析的时间框架（24–48小时）与用shRNA慢病毒转导的原代神经元培养物相比缩短了7天。为了支持我们的工作，TDP‐43自噬改变和细胞质聚集物积累之间的因果关系早已确立（Filimonenko等,2007; 朱等,2009; 乌什塔尼语等,2010; 王等,2012; 巴尔马达等,2014; 苏格兰人等,2014)并且与ALS‐FTD患者中观察到的TDP‐43阳性神经元内含物相一致，这些患者的自噬或蛋白清除途径相关基因发生突变，包括UBQLN2号机组,TBK1型,OPTN公司,SQSTM1系列,VCP公司，或GRN公司（胡等,2010; 布雷迪等,2013; Majcher审查等,2015在泰勒，2015). 然而，这对绝大多数散发性ALS‐FTD病例中观察到的TDP‐43聚集体是否也由自噬和/或蛋白质清除机制的某些缺陷引起提出了疑问，如果是，潜在的致病机制是什么。在这方面，最近有证据表明TDP‐43聚集体在衰老的人脑（Uchino等,2015)可能与已知的自噬随年龄下降有关（Sun等,2015).

最后，我们发现C9ORF72的部分损失促进了P62在团聚体中的积累，但对LC3B水平的影响不大。同样，C9orf72的表达减少对神经元细胞存活率几乎没有影响。这与在缺乏C9或f72表达式（Lagier‐Tourenne等,2013; 科伯斯等,2015). 这些结果可能表明，C9ORF72的活性与其他蛋白质冗余，或者C9ORF 72对基础自噬并不重要，但可能在特定的自噬亚通路中发挥更为有限的作用。为了支持后一种假设，我们发现C9ORF72的表达减少专门促进具有中间长度polyQ的共济失调-2的聚集。这些结果支持了GGGGCC重复序列在C9ORF72型ALS‐FTD患者（老年人等,2010; 达乌德等,2011; 罗斯等,2011; 范·达姆等,2011; 拉坦特等,2014). 然而，为什么C9ORF72的表达减少促进了Ataxin‐2的聚集和毒性，而不是Ataxin­3或Huntingtin的聚集和polyQ的膨胀，这是很有趣的，这种特异性的原因仍有待探索。在这方面，TDP‐43和Ataxin‐2都是RNA结合蛋白，因此质疑RNA蛋白颗粒（RNA噬菌体）的选择性自噬是否由C9ORF72控制，并在ALS‐FTD（Buchan等,2013; 藤原等,2013). 由于我们研究的时间框架缩短或细胞培养的其他固有限制，我们也可能错过了C9ORF72缺失对其他polyQ蛋白的有害影响。同样，具有聚谷氨酰胺控制长度（22Q）的Ataxin‐2可能会形成微团聚体，在较长的分析时间内具有毒性。该假设得到了以下观察结果的支持：Ataxin‐2与正常长度和中等长度的polyQ协同增效了TDP‐43对苍蝇的毒性，但正常polyQ大小的毒性小于中等长度polyQ（Kim等,2014). 因此，小鼠模型将有助于测试C9ORF72在共济失调-2或其他具有聚谷氨酰胺扩张的蛋白质存在下丢失的病理后果。还需要测试C9ORF72表达减少是否会协同其他应激的毒性，尤其是一些GGGGCC重复序列扩增所固有的毒性，例如GGGCCC RNA焦点和/或RAN翻译的DPR的积累。鉴于C9ORF72 mRNA表达与患者生存率的相关性，这一假设尤其有吸引力（van Blitterswijk等,2015)以及最近关于C9orf72正常表达但GGGGCC重复序列过度表达的BAC转基因小鼠模型中无明显神经退行性表型的报道。这些小鼠呈现RNA焦点和二肽重复蛋白聚集体，但只发展出微妙的行为表型（O’Rourke等,2015; 彼得斯等,2015). 同样，耗尽C9或f72大脑或神经元中的表达没有明显的神经退行性表型（拉盖尔·图伦等,2013; 科伯斯等,2015). 这些结果表明，C9ORF72的单独缺失或GGGCC RNA和DPR的分离表达不足以致病，但C9ORF 72的表达减少是否会协同GGGCC-RNA或DPR的毒性仍有待测试。这种协同模型与ALS/FTD患者中无无效等位基因或错义突变的情况一致C9ORF72型，以及通过越来越多的ALS‐FTD低原性的遗传证据（Ferrari等,2012; 范·布利特斯威克等,2012; 范·布利特斯威克等,2013; 凯迪等,2015; 拉坦特等,2015年a; 波蒂埃等,2015).

总之，我们的结果支持ALS‐FTD中的双重打击机制，其中C9ORF72的唯一表达减少并不能单独解释扩增GGGCC重复序列的致病性，但可能会与其他应激协同作用，例如具有中间polyQ长度的Ataxin‐2，而与GGGCC RNA foci或Ran翻译的DPR等其他应激的相关性尚待正式测试。最后，如果C9ORF72缺失导致部分自噬功能障碍，人们可能希望激活自噬的药理化合物可能有助于缓解ALS‐FTD的某些病理特征。

材料和方法

结构

从OriGene购买含有SQSTM1（P62）、OPTN、SMCR8、WDR41、ULK1、NAP1、SINTBAD、TANK和RAB GTPases的C末端标记人类cDNA的PCMV6。优化人类N末端HA标记的cDNAC9ORF72型和标记的标志TBK1型克隆到pcDNA3的是从GenScript购买的。人类cDNAATXN2型与22或30个谷氨酰胺融合到N端HA标记并克隆到pcDNA3中。通过反向PCR构建N末端HA标记RAB39b的组成活性Q68L和阴性S22N突变体。类似地，丙氨酸或天冬氨酸中C末端HA标记的SMCR8磷酸化位点（S400、S402、S492、S562、T666和T796D）的突变通过反向PCR构建。

HA‐标记串联亲和纯化

12 × 106使用Fugene HD（Promega）将48μg对照或C9ORF72‐Flag‐Ha质粒转染神经2A细胞24小时，并根据制造商的说明（Sigma‐Aldrich）使用Ha‐Flug串联纯化试剂盒纯化蛋白质。在4–12%双三凝胶（NuPAGE）上分离后，通过银染色（SilverQuest，Invitrogen）显示结合蛋白，并使用NanoESI_Ion Trap（Thermo Fisher）鉴定相互作用蛋白。

免疫荧光

盖玻片在含有4%多聚甲醛的PBS中培养10分钟，用PBS清洗，并在PBS和0.5%Triton X‐100中培养10 min。用PBS清洗细胞三次，用HA标签的一级抗体将盖玻片培养1小时（26183，Pierce）。P62/Sqstm1（ab56416，Abcam）或抗磷-TDP-43（pS409/410，Cosmo Bio）。用PBS洗涤后，将盖玻片与与Alexa 488（Interchim SA）缀合的山羊抗小鼠第二抗体孵育1小时，用PBS洗涤两次，并在PBS/DAPI（1/10000稀释液）中孵育2分钟。将盖玻片在Pro-Long介质（分子探针）中安装之前冲洗两次，并使用共焦显微镜进行检查。

免疫沉淀

6.25 × 105使用Fugene HD（Promega）将HEK293细胞（6孔板的1孔）与1μg表达HA标记cDNA的质粒和1μg表示Flag标记cDNA质粒共转染24小时。将细胞刮入RIPA缓冲液（50 mM Tris–HCI pH 7.6，150 mM NaCl，1%NP‐40）中，并在18000下离心15分钟克4°C时；添加20μl预洗HA磁珠（Dynabeads），并在4°C下以恒定旋转进行免疫沉淀1h。用50 mM Tris–HCI pH 7.6、150 mM NaCl、0.05%吐温洗涤三次后，将结合蛋白在SDS–PAGE负载缓冲液中洗脱，并使用针对Flag标签（PA1‐984B，Pierce）或HA标签（26183，Pierce）的抗体通过Western印迹进行分析。对于内源性免疫沉淀，SMCR8 1D2小鼠单克隆抗体与小鼠脑提取物在RIPA缓冲液中孵育过夜。添加预先清除的A/G磁珠（Life Technologies），并在4°C下以恒定旋转进行免疫沉淀1h。用50 mM Tris–HCI、150 mM NaCl、0.05%吐温洗涤珠子三次，然后在95°C下在SDS–PAGE加载缓冲液中煮沸5分钟。使用针对SMCR8（1D2）、C9ORF72（22637-1-AP，Proteintech）、WDR41（NBP1-83812，Novus Biological）、Rab8a（11792-1-AP，Proteitech）、Rap39b（12162-1-AP，Proceintech(阿布137029，Abcam）。

体外GDP/GTP交换分析

用1μ居里α32在30°C下，在10μl缓冲液分析（150 mM NaCl，50 mM Hepes，1 mg/ml BSA，2.5 mM EDTA，pH 7.5）中30分钟，P标记的GDP（哈特曼分析）。添加更多数量的重组纯化C9ORF72或C9ORF 72/SMCR8/WDR41复合物，并在30°C下进一步培养30分钟。添加20微升预清洗的GST磁珠（Dynabeads），并在4°C下下拉30分钟。在反应缓冲液中清洗三次后，用闪烁计数器（贝克曼·库尔特）测量放射性。

体外磷酸化

将8微克重组纯化C9ORF72/SMCR8/WDR41复合物在30°C下与10μ居里γ射线孵育30分钟3220μl激酶缓冲液分析中的P标记ATP（150 mM NaCl，20 mM HEPES，2 mM MgCl2，25 mMβ‐甘油磷酸，100μM原钒酸盐，pH 7.5），含或不含2μg重组纯化ULK1或TBK1蛋白（OriGene）。通过添加SDS–PAGE加载缓冲液停止反应，在90°C下煮沸3分钟，并在4–12%双Tris凝胶（NuPAGE）上运行。然后将凝胶用于Western blotting分析或干燥并成像（台风扫描仪，GE Healthcare）。

神经细胞培养、转染和治疗

从C57Bl/6 E18胚胎中制备初级皮层神经元，并在添加有1×B27、0.5 mM L-谷氨酰胺和100 IU/ml青霉素/链霉素的神经基础培养基（NBM）中的聚赖氨酸涂层24孔板上生长，37°C，5%CO2在第3天用表达控制shRNA或shRNA的重组慢病毒转导神经元C9或f72（SK02‐040236‐00‐10 SMARTvector 2.0 hEF1a慢病毒小鼠3110043O21Rik shRNA，Thermos）。过夜培养后，去除慢病毒并添加新鲜培养基。5-7天后，用免疫荧光或Western blot分析神经元。GT1‐7细胞在37°C、5%CO、10%胎牛血清、庆大霉素和青霉素中生长2，在DMEM和0.1%胎牛血清中电镀，并使用Lipofectamine 2000（Fisher Scientific）和/或RNAimax（Fisher-Scientistic）转染24–48小时，以siRNA控制或靶向C9或f72,Smcr8型3′UTR，或Tbk1型（ON‐TARGETplus，Dharmacon）。在分析前，用10μM雷帕霉素（Millipore）处理神经元15小时，或用100 nM巴非霉素（Sigma）处理神经元15小时，或用250 nM托林-1（Tocris）处理神经元2小时。

重组蛋白的生产和纯化

对于RAB GTPases，大肠杆菌用pet28‐GST‐RAB GTPase载体转化BL21（RIL）pRARE活性细胞（Invitrogen），在37°C的400 ml LB培养基中添加卡那霉素培养至OD600=0.5，添加0.5 mM IPTG，并在30°C下进一步培养4 h。收集的细胞在300 mM NaCl、50 mM Tris–Cl pH 7.5、1 mM DTT、5 mM EDTA中进行超声处理，并在20000下离心20分钟克使用GST纯化试剂盒（Novagen）纯化重组GST‐RAB GTPase蛋白，量化、透析并存储在150 mM NaCl、20 mM HEPES、2 mM MgCl中2，20%甘油。关于C9ORF72复合体，2×106SF9的(食果夜蛾)细胞（一个T25烧瓶）共转染500 ngBsu36I型线性化的BAC10:KO1629 DNA和2μg含有HIS‐C9ORF72、SMCR8或WDR41的pMF‐双载体，并在27°C下孵育6天。然后对采集的杆状病毒进行测试、扩增，并使用HIS纯化试剂盒（Novagen）感染2 l SF9细胞培养物，以进行蛋白质生产和纯化，该试剂盒在500 mM NaCl、50 mM Tris–Cl pH 7.5和50 mM咪唑中进行超声处理和洗涤，用150 mM NaCl、50 mmM Tris-Cl pH 7.5,1 mM DTT和5 mM EDTA洗脱，200 mM咪唑，透析，储存在150 mM NaCl、20 mM HEPES、2 mM MgCl中2，20%甘油。

单克隆抗体生产

为了产生抗SMCR8单克隆抗体，8周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射100μg重组纯化SMCR8:C9ORF72复合物和200μg聚（I/c）作为佐剂。每隔2周进行三次注射，在杂交瘤融合前4天，再次注射血清反应阳性的小鼠。如De StGroth和Scheidegger所述，脾细胞与Sp2/0.Agl4骨髓瘤细胞融合(1980). 杂交瘤培养上清在第10天通过ELISA检测与重组纯化C9ORF72:SMCR8复合物的交叉反应。然后在HA标记的SMCR8和HA标记的C9ORF72转染的COS‐1细胞上通过免疫荧光和Western blot检测阳性上清液。在软琼脂上克隆了两次特定培养物。建立特异性杂交瘤，注射2×10制备腹水6将杂交瘤细胞导入弗氏佐剂引发的BALB/c小鼠。所有动物实验程序均按照欧洲权威机构指南进行。

蛋白质印迹

蛋白质在95°C下变性3分钟，在4–12%双Tris凝胶（NuPAGE）上分离，在硝化纤维素膜（Whatman Protran）上转移，在Tris缓冲盐水（TBS）缓冲液中用5%的非脂肪干乳封闭，与反旗帜培养（PA1‐984B，Pierce），HA（26183，Pierse），C9ORF72（22637‐1‐AP，Proteintech），TBS中的LC3B（ab51520，Abcam）、GAPDH（ab125247，Abcam）、TDP‐43（3449S，细胞信号）、SMCR8（1D2，1/200）加上5%的脱脂奶粉，清洗三次，并在TBS中与抗兔或抗鼠过氧化物酶抗体（1:3000，Cell Signaling）孵育1小时，然后清洗和ECL化学发光显示（Amersham ECL Prime）。

斑马鱼研究

成年斑马鱼和幼体斑马鱼(达尼奥雷里奥)饲养于ICM鱼类设施，并根据国家和欧洲动物福利指南进行饲养。对AB和TL菌株的野生型胚胎进行了实验。Hb9:GFP-Tg（Mnx1:GFP）转基因细胞系用于标记运动神经元及其轴突投射。斑马鱼实验的所有程序都得到了ICM研究中心机构伦理委员会以及法国和欧洲立法的批准。这个ATXN2型在本文所述的所有实验中，构建物的最终DNA浓度为75 ng/μl。胚胎保持在28°C，并在24 hpf的条件下使用细镊子手动脱绒毛。只选择了没有发育异常（合格为畸形）的斑马鱼和受精后48小时的游泳轨迹，并适当追踪了它们的游泳轨迹。对于百分比分析、行为分析和轴突投射，针对本文所述的每种条件进行了三次以上的独立实验。反义吗啉寡核苷酸（AMO）被设计成与上游ATG结合的互补物，该ATG将阻断斑马鱼的两种转录物C9或f72（C9orf72）并由GeneTools合成。这个C9或f72AMO序列为ATTGGGAGGACAGGCTGAAGACAT，已知与C9或f72mRNA：[（ATG）TCTTCAGCCTTCCCACAAT]。对照AMO（错配）包含五个与C9orf72 AMO序列不匹配的核苷酸，在斑马鱼基因组中任何地方都不结合，用于评估观察到的表型的特异性（ATTcTcGAGcACAGcCTcAAGACAT）。对于遗传相互作用实验，C9orf72‐AMO和C9orf 72‐mis分别在0.2 mM和0.2 mM下进行微注射。在这些浓度下，C9orf72和错配AMO不会导致与游泳不足或形态异常相关的表型特征（Ciura等,2013; 拉坦特等,2015年a,b条). 对于百分比分析、行为分析和轴突投射，针对每种情况进行了三次以上的独立实验，包括联合注射ATXN2型Q22x和ATXN2型Q30x和C9orf72以及不匹配的AMO。斑马鱼胚胎在48 hpf时进行形态异常分析，并用吸管尖端在尾部水平轻轻触摸，对其运动行为进行评分。因此，对于每个注射组，幼虫和胚胎被分为以下组：死亡组、卷曲组和怪物组（发育异常鱼类）。TEER发作仅在形态正常（观察到正常的TEER）的斑马鱼中进行，并使用蚱蜢2号相机（点灰色研究）以30 Hz的频率记录每种情况。然后使用ImageJ 1.45r软件的手动跟踪插件对视频进行分析，并按照之前的描述计算鱼类的游泳持续时间、游泳距离和最大游泳速度（Ciura等,2013; 拉坦特等,2015年b). 为了将基因表达与细胞形态相关联，选定的HB9斑马鱼胚胎中运动神经元的轴突投射在48 hpf时呈GFP阳性。此外，如前所述，使用突触囊泡标记SV2标记轴突投射（卡巴希等,2010). 使用配备哈马松ORCA‐flash 2.8数码相机的荧光自动倒置显微镜系统Olympus IX83拍摄固定胚胎的荧光图像。使用Olympus cellSens软件进行图像采集。在体间节段的一个确定位置测定了初级运动神经元的轴突投射。通过荧光显微镜对每只动物的三到四个轴突投影进行Z堆栈分析。通过使用ImageJ追踪标记的轴突从脊髓到其分支点，确定轴突到第一分支的长度。这些值是在不同条件下分析的每只动物（每种条件下至少15条斑马鱼）的平均值。HA标记RT-qPCR定量引物ATXN2型斑马鱼体内注射的药物为F-TGGTTCCAGCTCCCTGTCT和R-TGACCCATGACCACGTT。ATXN2型水平归一化为内源性Gapdh公司（QuantiTect引物分析，Dr_gapdh_1_SG）。

统计分析

所有细胞实验均表示为平均值±标准平均误差（SEM），显著性使用Student’st吨‐测试。斑马鱼实验的所有数据值均表示为平均值±标准平均误差（SEM），显著性通过单向方差分析确定。

作者贡献

实验由CS、MLC、AG、IKC、CJC、MOA、FR和SC进行。数据由CS、AP、SC、EK和NCB收集和分析。该研究由CS、SC、EK和NCB设计、协调和编写。

利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突。

支持信息

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表EV1

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致谢

我们感谢Pamela Mellon（美国加州大学圣地亚哥分校）赠送GT1‐7细胞；泰耶·约翰森（挪威特罗姆瑟大学），赠送P62、OPTN和LC3B质粒；Jochen Weishaupt（德国乌尔姆大学）捐赠了TBK1载体；以及Aaron Gitler（美国斯坦福大学医学院）和Daisuke Ito（日本东京庆应义塾大学），以获得Ataxin‐2质粒的礼物。这项工作得到了法国基金会Thierry Latran#57486“ALS模型”、AFM拨款#18605“C9ORF72在ALS‐FTD中的作用”、ERC‐2012‐StG#310659“RNA疾病”、ANR‐10‐LABX‐0030‐INRT和ANR-10‐IDEX‐0002‐02（NCB）的支持；来自Inserm的Atip/Avenir，职业整合奖助金（玛丽·居里行动），罗伯特·帕卡德基金会，罕见的ERA‐NET项目，AFM，ARSLA，法国阿尔茨海默病协会，以及“Avenir投资”项目ANR‐10‐IAIHU‐06（EK）。SC由AFM博士后奖学金资助，M‐LC由Cognacq‐Jay基金会博士后研究员资助。

笔记

欧洲分子生物学组织(2016)35: 1276–1297[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

笔记

另请参见：S Almeida&F‐B Gao公司（2016年6月）

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团