MEK和PI3K联合抑制小鼠胰腺癌模型

高通量细胞活力测定

化合物从商业来源获得或由阿斯利康提供（补充表1）。小分子抑制剂以3种浓度10倍间隔使用（见补充表2）。如前所述测定细胞活力²⁸简单地说，细胞接种在含有5%FBS的培养基中，密度确保细胞在整个药物治疗过程中生长（大多数细胞系约为15%）。接种后24小时开始药物治疗，持续72小时。细胞固定并用Syto60（Invitrogen）红色荧光DNA染色。相对细胞数是通过减去背景后（没有接种细胞）来自药物处理的孔与未处理的孔的相对荧光强度的比率来计算的。数值为三口井的平均值。

Annexin V凋亡检测

细胞在约30%至40%的汇合处接种在6 cm的板中。隔夜培养后，抽吸培养基，并用含有或不含不同浓度指示药物的培养基替换。72小时后，收集培养基。细胞用PBS洗涤并胰酶化。在单管中将PBS洗涤和胰蛋白酶消化的细胞加入到收集的培养基中。细胞造粒，用PBS清洗一次，然后在约1×10的Annexin结合缓冲液（BD Biosciences）中重新悬浮⁶细胞/mL。根据制造商的方案，用碘化丙啶（BD Biosciences）和Annexin V Cy5（Biovision）对细胞进行染色，并在LSRII流式细胞仪（BD bioscience）上进行分析。

统计分析

通过比较PDAC细胞系和非PDAC细胞株对每种化合物的活性，评估这些化合物对PDAC细胞的相对效力。采用Fisher精确检验确定统计显著性。对于每种化合物，分别评估三种测试浓度。使用与细胞存活率为10-80%相对应的敏感阈值，以10%的增量重复进行统计测试（第一次测试是将存活率为10%或以下的细胞系划分为敏感细胞系，将存活率>10%的细胞系分类为耐药细胞系）。使用给定化合物在所有浓度和活性阈值（每个化合物24次测试）下获得的最小P值（单尾）来比较所有化合物对PDAC线的相对敏感性。Fisher精确检验的所有结果（双尾值）见补充表2。利用Compusyn（ComboSyn Inc.）分析了测量组合活性的组合指数。为了测试AZD6244的组织特异性活性，采用Fisher精确试验确定2μM时AZD5244对不同来源细胞系的活性的统计意义。对于每个来源组织，将细胞系的活力与来自其他来源组织的所有系的活力进行比较。使用了60%的生存率阈值，其他生存率阈值测试得出了类似的结果。对于每个组织，我们计算其影响：影响=Ln（所有其他细胞系的平均存活率/组织系的平均生存率）。对于生存研究，使用Prism统计软件4.0a版于2003年5月11日进行统计分析。使用Kaplan-Meir方法确定存活率，使用Logrank检验确定治疗组之间的比较。在尸检中发现有疾病迹象和晚期癌症的动物被列为事件。非晚期癌症死亡的动物被审查。

小鼠菌株与组织学分析

这个Pdx1-芯；LSL-KRAS公司^G12D系列；第53页^洛克斯/+鼠标PDAC模型已经过描述(18). 小鼠被安置在马萨诸塞州总医院比较医学中心（CCM）维持的无病环境中。按照马萨诸塞州总医院研究动物护理小组委员会（SRAC）的定义，严格按照良好的动物实践处理小鼠，所有小鼠工作均经SRAC批准（方案2005N000148）。

化学抑制剂

我们从商业来源（Otava Chemicals）购买了MEK抑制剂ARRY-142886（AZD6244）和GDC-0941。PI3K抑制剂BKM-120和双PI3K-mTOR抑制剂NVP-BEZ235-AN来自诺华生物医学研究院。我们将BKM-120和AZD-6244重组为一体积的N-甲基-2-吡咯烷酮（69118，Fluka），然后添加九体积的PEG300（81160，Fluko），并分别以50 mg/kg和25 mg/kg的剂量每日经口灌胃给药。GDC-0941溶于0.5%甲基纤维素和0.2%吐温-80中，并以每天75mg/kg的剂量经口灌胃给药。将NVP-BEZ235-AN在0.5%甲基纤维素（Fluka）和0.4%聚山梨酯（Tween 80；Fluka）中重组，并以25mg/kg的剂量每天口服给药。

蛋白质印迹分析

使用标准方法进行蛋白质印迹。用冷PBS清洗细胞，并在以下裂解缓冲液中进行裂解：20 mM Tris pH 7.4、150 mM NaCl、1%Nonide P-40、10%甘油、1 mM EDTA、1 mM-EGTA、5 mM焦磷酸钠、50 mM NaF、10 nMβ-甘油磷酸、1 mM钒酸钠、0.5 mM DTT、4 mg/mL亮肽、4 mg/mL胃蛋白酶抑制素、4 mg/mL抑肽酶、，1 mM苯甲基磺酰氟。以16000 x的速度离心裂解液克在4°C下保持5分钟。使用均质机将胰腺组织（100-200mg）切碎，但也按上述方法处理。蛋白质浓度通过BCA分析（Thermo Scientific）测定。通过SDS-PAGE解析蛋白质，并将其转移到聚偏二氟乙烯膜（Hybond-P，Amersham）上。按照抗体制造商的规范进行免疫印迹。

免疫荧光和免疫组织化学

样品固定在10%福尔马林中并嵌入石蜡中。脱蜡后，用9.83%NaCl清洗载玻片3分钟，然后用PBS清洗和蒸馏水清洗5分钟。用压力锅（2100 Retriever，PickCell Laboratories B.V.）和R-Buffer a（pH6.0，Electron Microscopy Sciences）进行热诱导抗原回收。用2%H培养切片₂O（运行）₂在甲醇中放置15分钟，进行内源性过氧化物酶淬灭，并在PBS-Triton 0.3%v/v（PBST）中清洗并封闭1%BSA中的非特异性结合1小时。随后，根据试剂盒手册，用1:100稀释度的一级抗体、1:250稀释度的二级过氧化物酶山羊抗兔IgG抗体（载体）和酪氨酸钠信号放大（TSA）荧光素系统（Perkin Elmer，类别：NEL701A）依次孵育切片。用带有DAPI（Vector）的Vectashield安装介质安装载玻片，用尼康C2共焦显微镜系统拍照，然后用苏木精和伊红染色。p-AKT（Thr308）p-ERK（Thr202/Tyr204）、p-S6（Ser235/236）和CC3（Asp 175）从Cell Signaling，Inc.获得。如前所述进行Ki67染色(19). 通过对至少十个高倍视野中发现的每种病变类型的细胞核进行评分，对Ki67染色进行量化。

器官型组织培养

使用先前描述的方法从初级PDAC制备器官型组织培养物(20). 简而言之，使用Vibratome VT1200（徕卡微系统）从新鲜组织上切下薄片（300–500μm）。组织切片在器官型插入物（具有0.4μm孔的聚四氟乙烯膜）上培养长达120 h（每个插入物两片；Millipore）。在37°C的5%CO2湿化培养箱中，使用1 ml添加20%灭活FBS（GIBCO）、100 U/ml青霉素（Invitrogen）、100μg/ml链霉素（GIBCO）、2.5μg/ml两性霉素B和100μg/ml卡那霉素（Sigma-Aldrich）的火腿F-12培养基进行组织培养。培养基每2天更换一次。在基线时间（T0）采集组织切片，然后每隔24小时采集一次；切片用福尔马林固定，石蜡包埋，用于形态学（H&E）和IHC评估。

MEK和PI3K双重抑制对PDAC细胞凋亡的联合作用

对于许多药物来说，诱导细胞凋亡的能力在体外是更好的预测体内疗效优于细胞周期阻滞(21,22). 由于我们的高通量分析无法区分生长停滞和细胞死亡诱导，我们直接检测了AZD-6244对PDAC细胞系中细胞凋亡的影响。尽管有效下调磷酸化ERK水平，但该化合物在大多数细胞系中诱导了与载体相关的适度凋亡(图2A、B和补充图1A）。之前的研究表明，PI3K生存途径抑制剂可以增强MEK抑制在其他KRAS突变癌症中的疗效(12,13)，我们还研究了PI3K抑制剂BKM-120和GDC-0941的凋亡潜力。这两种化合物在PDAC细胞系中作为单一药物导致细胞凋亡的轻微增加，但当与MEK抑制剂结合时，它们或是相加或是协同作用，显著增加了大多数PDAC细胞株的凋亡水平(图2A、B和补充图1A），支持这些化合物的组合使用。

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图2

细胞系和体外器官型培养分析支持PDAC中MEK和PI3K的联合靶向性

A、 B）用载体对照或用1μ#使用的指定药物（AZD:AZD-6244；BKM:BKM-120；GDC:GDC-0941）处理PDAC细胞系。A）显示PI/AnnexinV染色的FACS图。显示凋亡细胞的百分比。B）Western blot显示抑制剂对p-AKT（Thr308）和p-ERK（Thr202/Tyr204）水平的影响。

C-D）治疗反应分析体外原发性PDAC的器官型培养。C）用所示化合物（每种化合物的浓度为1μM）处理新鲜衍生的有机型培养物24小时，然后用H&E或p-ERK（Thr202/Tyr204）、p-AKT（Thr308）、p-S6（Ser235/236）、Ki-67和裂解Caspase 3的抗体进行染色。D）24小时时细胞凋亡定量（裂解caspase-3染色）和增殖定量（Ki-67染色）。显示了统计显著性；p<0.01（*），p<0.0001（**）。

原发性PDAC离体器官型模型中MEK和PI3K双重抑制的疗效

接下来，我们试图测试单一或双重MEK/PI3K抑制对原发性肿瘤的影响。与以往研究一致^25-28人PDAC的IHC分析显示，肿瘤上皮中的磷酸-ERK和磷酸-AKT染色，表明这些通路正在激活（补充图1B）。我们首先测试了AZD-6244和BKM-120在体外器官型模型(20). 该模型采用了使用振捣器获得的原发性肿瘤薄片（300–500μm）（见材料和方法），能够在保存的肿瘤-基质相互作用和三维结构的背景下评估治疗效果。用AZD-6244或BKM-120处理同一肿瘤的切片，分别熄灭p-ERK染色和p-AKT染色，两者的结合导致两种信号的丢失(图2C). 虽然这些化合物作为单一药物使用时可诱导细胞凋亡（裂解caspase-3染色）和减少增殖（Ki-67染色），但它们的联合使用可显著提高疗效(图2C; 数据被量化图2D). 这些变化在肿瘤上皮而非基质中最为显著。

在KRAS-p53小鼠模型中，双重MEK/PI3K抑制延迟PDAC的启动和进展

接下来，我们试图确定MEK/PI3K抑制对原发性PDAC的影响体内我们使用了由KRAS激活和p53失活驱动的PDAC基因工程小鼠模型（GEMM）(Pdx1-芯；LSL公司-克拉斯^G12D系列; 第53页^洛克斯/+，指定为KRAS-p53小鼠），以同步和可预测的方式重述人类疾病的遗传和组织病理学进展(18). 首先，我们研究了AZD-6244和BKM-120在弗兰克肿瘤发病前给药时限制PDAC发生和发展的潜力。如中的研究设计示意图所示图3A，小鼠从8周龄开始使用这些化合物进行治疗，此时只有浸润前的胰腺导管病变（胰腺上皮内瘤变；PanINs）存在(18). 将这些药物的影响与溶媒对照和吉西他滨进行比较。这些药物作为单一药物和联合药物耐受性良好，与使用其他MEK和PI3K抑制剂的报告一致(12). 在这种情况下，AZD-6244和BKM-120联合使用具有最强的保护作用，与对照组相比，存活时间几乎延长了一倍（中位数为131.5天，而对照组为71天）(图3B). AZD-6244、BKM-120或吉西他滨单药治疗可使生存期延长(图3B). 如补充图2所示，在使用AZD-6244和双特异性PI3K/mTOR抑制剂BEZ-235进行的预防研究中，我们还观察到生存期显著延长（85.2天，而对照组为44.5天，p<0.001）。在这些研究中，当疾病稍微加重时，在10周开始治疗，由更高级别的PanIN或早期PDAC组成。尽管抑制剂延长了小鼠的寿命，但所有小鼠最终都发展成了胰腺肿瘤。组织学检查显示，所有组的肿瘤具有可比的病理组织学特征，包括侵袭性、高分化和低分化PDAC（数据未显示）。因此，MEK/PI3K双重抑制显著延迟PDAC的发生和恶性进展，同时不会强烈改变最终出现的肿瘤的固有恶性表型。

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图3

在KRAS-p53小鼠模型中，MEK和PI3K联合靶向可延缓PanIN病变引起的PDAC进展

A）预防研究的实验设计示意图。在PDAC发病前对小鼠进行治疗，并监测肿瘤进展的证据。

B）生存曲线（Kaplan-Meier分析）计算为治疗开始和牺牲之间的时间长度。图表显示了生存数据的统计分析。

N.B.是Andrew L.Warshaw胰腺癌研究所的成员，并担任马萨诸塞州总医院胃肠道癌症研究的Gallagher主席。

拨款支持：

这项工作得到了AACR/胰腺癌行动网络、NIH（NCI 2P01CA117969-06）和Dana-Farber/哈佛癌症中心胃肠道癌症SPORE（给N.B.和J.A.E.）向N.B.提供的资助。R.B.C得到了NIH培训拨款T32 CA071345的支持。G.C.得到了Fondazione Umberto Veronesi、Associazione Italiana per la ricerca sul Cancro和美国意大利癌症基金会的支持。