层粘连蛋白B1缺失是衰老相关的生物标志物

拉明B1的丢失与p38 MAPK、NF-κB、共济失调毛细血管扩张症突变激酶和ROS信号无关

已经确定了几种在衰老表型方面起致病作用的途径。p38 MAPK通路对衰老生长停滞和SASP都很重要(王等。，2002;我是Iwasa等。，2003;广等。，2009;弗伦德等。，2011). 为了确定p38 MAPK是否介导层粘连蛋白B1的下降，我们用特性良好的小分子SB203580（SB；库恩达等。，1995;威尔逊等。，1997;年轻等。，1997)，可有效抑制衰老相关白细胞介素-6（IL-6）分泌（补充图S2A；弗伦德等。，2011). 当加入SEN（XRA）细胞时，10μM SB未能逆转层粘连B1的下降(图2A). 此外，在XRA之前开始连续使用SB治疗，未能阻止或延缓层粘连B1的下降(图2B).

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图2：

衰老时拉明B1的丢失独立于p38 MAPK、NF-κB、ATM和ROS信号。（A） p38 MAPK抑制不能逆转DNA损伤诱导的衰老中层粘连蛋白B1的下降。将p38 MAPK抑制剂SB203580（SB；10μM）添加到SEN（XRA）HCA2细胞中48 h。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。模拟照射PRE细胞。（B） p38 MAPK抑制不能阻止DNA损伤诱导的衰老中层粘连蛋白B1的下降。在XRA之前将SB加入到HCA2细胞中。细胞被模拟辐照（PRE）或辐照（XRA）。通过Western blotting分析在指定时间点收集的全细胞裂解物。每天更换SB。（C） p38 MAPK抑制不能逆转或阻止RAS诱导的层粘连B1下降。HCA2细胞被表达致癌RAS的慢病毒感染^V12版本并允许衰老（SEN（RAS））。未添加SB（–），感染后第8天添加48小时（+SB 48小时），或在感染前添加并维持10天（+SB cont）。前新生对照组（PRE）感染了无插入载体。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。（D） p38 MAPK抑制可阻止但不能逆转MKK6诱导的层粘连蛋白B1的下降。HCA2细胞被表达MKK6EE的慢病毒感染并允许衰老（SEN（MKK6））。未添加SB（–），感染后第8天添加48小时（+SB 48小时），或在感染前添加并维持10天（+SB cont）。前新生对照组（PRE）感染了无插入载体。通过蛋白质印迹分析全细胞裂解物。（E） RelA缺失不能阻止DNA损伤诱导的层粘连蛋白B1下降。HCA2细胞被一种慢病毒感染，该慢病毒表达两种针对RelA（shRelA）或GFP（shGFP；对照）的shRNAs，并被选中。然后对细胞进行辐照并使其衰老（SEN（XRA））。前新生对照组（PRE）接受模拟照射。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。（F） ATM耗竭并不能阻止DNA损伤引起的层粘连蛋白B1下降。HCA2细胞被表达shRNA对抗ATM（shATM）或GFP（shGFP；对照）的慢病毒感染并选择。然后对细胞进行辐照并使其衰老（SEN（XRA））。对前新生对照组（PRE）进行模拟照射。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。（G） ROS抑制不能阻止DNA损伤诱导的层粘连蛋白B1下降。照射前向HCA2细胞中添加NAC（10 mM），并保持至XRA（SEN（XRA））后10天收集全细胞裂解物。前新生对照组（PRE）接受模拟照射。NAC每天更换一次。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。（H） ROS抑制不能阻止MKK6诱导的层粘连蛋白B1下降。感染前将NAC（10 mM）添加到HCA2细胞中，并持续至样品采集。在感染表达MKK6EE的慢病毒（SEN（MKK6））10天后收集全细胞裂解物。前新生对照组（PRE）感染了一种缺乏插入物的慢病毒。NAC每天更换一次。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。

同样，SB也不能阻止RAS诱导细胞衰老时层粘连蛋白B1的下降。我们用表达RAS的慢病毒感染细胞，8天后加入SB 48小时（+SB 48 h）。或者，我们用SB连续处理细胞12天，从感染前2天开始（+SB-cont）。在这两种情况下，每天更换SB。两种治疗方案均未对层粘连蛋白B1的下降产生任何影响(图2C). 除了证实层粘连蛋白B1的下降不依赖于p38 MAPK信号，数据还表明层粘连蛋白质B1的下降并不需要衰老相关的生长停滞或形态学改变，因为持续的p38 MAPK抑制可以阻止RAS表达细胞中的这两种表型(我是Iwasa等。，2003;广等。，2009). 我们还将SB给予表达MKK6EE的细胞，该细胞通过组成性p38 MAPK激活诱导衰老(图2D). SB并没有逆转层粘连蛋白B1的下降（+SB 48小时），这表明一旦层粘连基因B1丢失，衰老诱导信号的完全阻断并不能逆转这种下降。然而，在MKK6EE表达之前开始的持续p38 MAPK抑制（+SB cont）阻止了层粘连蛋白B1的下降，证实了衰老信号的阻断减轻了层粘着蛋白B1表达的下降。

拉明B1的丢失也与SASP无关，SASP在很大程度上由转录因子NF-κB调节(弗伦德等。，2011). 我们通过使用两种不相关的短发夹RNA（shRNAs）对抗RelA来抑制NF-κB的活性，RelA是NFκB活性所需的一种NF-κB亚单位。shRNA有效降低了RelA水平(图2E)并消除衰老相关的IL-6分泌（补充图S2B；弗伦德等。，2011). NF-κB的缺失并不能阻止XRA诱导细胞衰老时出现的层粘连蛋白B1的下降(图2E).

DDR通路，特别是共济失调-毛细血管扩张突变（ATM）激酶的激活，对衰老生长停滞和SASP很重要(冯·兹格利尼基，2005年;马莱特等。，2007;罗迪耶等。，2009;奎尔曼等。，2010). 此外，该通路独立于p38 MAPK进行调节(弗伦德等。，2011). 为了确定DDR是否是层粘连蛋白B1下降所必需的，我们使用shRNA对抗ATM，然后通过XRA诱导衰老。尽管ATM水平有效降低，IL-6有效抑制（补充图S2C），层粘连蛋白B1仍显著下降，与正常衰老细胞中的行为类似(图2F).

最后，活性氧（ROS）在衰老细胞中升高，而ROS信号被认为介导衰老生长停滞(Lu和Finkel，2008年;Jun和Lau，2010年;帕索斯等。，2010;Rai公司等。，2011). 我们用10 mM连续处理细胞以抑制ROSN个-乙酰半胱氨酸（NAC），在通过XRA或MKK6EE表达诱导衰老前2天开始。尽管NAC有效降低了ROS水平（补充图S2D），但NAC治疗对两种情况下的层粘连B1下降均无影响(图2，G和​和HH（H）).

我们得出结论，衰老相关的层粘连蛋白B1表达下降独立于p38 MAPK、NF-κB、DDR和ROS信号。

当p53或pRB通路激活时，层蛋白B1丢失

由于到目前为止检测到的所有衰老诱导剂都会导致层粘连蛋白B1的表达急剧下降，因此我们询问实现衰老生长阻滞的肿瘤抑制途径的激活是否足以耗尽层粘连基因B1的细胞。很少有例外(奥尔森等。，2002;Campisi和d'Ada di Fagagna，2007年所有的衰老诱导物都激活了pRB和/或p53肿瘤抑制通路，因此我们询问层粘连B1是否会因直接激活这些通路而下降。

为了激活p53，我们使用了小分子MDM2-触角蛋白-3a，它会导致p53蛋白的积累(埃费扬等。，2007;熊本等。，2008). 为了激活pRB通路，我们使用慢病毒载体稳定地过度表达p16^INK4a公司(博塞等。，2003;复制等。，2006)，一种自身的肿瘤抑制因子，通过阻止pRB磷酸化来激活pRB(Ohtani公司等。，2004). 我们在连续治疗或表达4天后收集全细胞裂解物，这是在其他衰老标记物表达之前的一段时间。p53或p16水平升高^INK4a公司足以导致层粘连蛋白B1的损失(图3，A和​和BB类).

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图3：

p53或p16的表达足以导致层粘连蛋白B1的丢失，这在mRNA水平上受到调节。（A） p53稳定足以导致层粘连蛋白B1下降。用5μM nutlin-3a或载体（PRE）处理HCA2细胞。连续处理4天后，通过Western blotting分析全细胞裂解物。（B） 异位p16^{INK4A（墨水）}这种表达足以引起层粘连蛋白B1的下降。HCA2细胞被缺乏插入物（PRE）或表达p16的慢病毒感染^{INK4A（墨水）}（第16页^INK4a公司OE）并选择。感染4天后，用Western blotting分析全细胞裂解物。（C） 层蛋白裂解产物存在于凋亡细胞中，但不存在于衰老细胞中。用500nM staurosporine处理HCA2细胞24h诱导凋亡（Stauro）或照射4d后收集（SEN（XRA））。对前新生对照组（PRE）进行模拟照射。通过Western blotting分析全细胞裂解产物。（D） 半胱天冬酶抑制可防止葡萄孢霉素诱导的层粘连蛋白B1降解，但不能阻止衰老相关层粘连肽B1的下降。HCA2细胞用500 nM staurosporine处理24小时（Stauro）或照射4天后收集（SEN（XRA））。前新生对照组（PRE）接受模拟照射。如有指示，从staurosporine/XRA之前开始添加泛酶抑制剂z-VAD-fmk（z-VAD；100μM），直到收集到全细胞裂解物。每天更换Z-VAD-fmk。（E） 衰老细胞中的层粘连蛋白B1 mRNA下降。HCA2和IMR-90细胞接受模拟辐射（PRE）或XRA处理。4天后分离总RNA，并通过定量逆转录-PCR进行分析。信号正常化为微管蛋白。（F） 衰老细胞中的层粘连蛋白B1 mRNA稳定性降低。HCA2细胞接受模拟辐射（PRE）或XRA处理。三天后，添加放线菌素D（最终1μg/ml）以停止转录。24小时后，分离总RNA并通过定量RT-PCR进行分析。添加放线菌素D前的转录水平设置为100%。

衰老相关的层粘连蛋白B1的丢失在mRNA水平上受到调节

细胞是否衰老或凋亡的决定仅取决于几个因素，如p53磷酸化和PTEN状态(Bargoneti和Manfredi,2002;Campisi和d'Adda di Fagagna，2007年;车道等。，2010;李等。，2010). 在凋亡过程中，细胞结构蛋白主要被半胱氨酸蛋白酶降解，核层粘连蛋白是半胱氨酸酶的靶点(尼马提亚等。，1995;饶等。，1996;基维宁等。，2005). 衰老细胞经常破坏细胞核(梅塔等。，2007)，增加了衰老时观察到的层粘连蛋白B1下降的可能性，这是caspase介导的降解的结果。

半胱天冬酶对层蛋白的裂解可以通过蛋白质印迹观察到(饶等。，1996;加杜塞克等。，2001;基维宁等。，2005). 因此，我们询问是否在衰老细胞中检测到层粘连B1裂解产物。作为阳性对照，我们用staurosporine（500 nM；基维宁等。，2005). Staurosporine有效诱导细胞凋亡，包括特征性的层粘连B1和层粘连A/C裂解产物；然而，在衰老细胞中没有检测到这种裂解产物(图3C).

因为在诱导凋亡24小时后，层粘连蛋白裂解产物会消失(加杜塞克等。，2001)，我们用z-VAD-fmk处理细胞，z-VAD-fmk是一种不可逆的泛酶抑制剂，可以阻止凋亡过程中层粘连蛋白的caspase降解(基维宁等。，2005). 尽管100μM z-VAD-fmk可以阻止staurosporine诱导的层粘连B1降解，但在XRA之前和之后的3d内给予z-VAD-fmk并不能阻止XRA诱导的层黏连B1丢失(图3D). 我们的结论是，在衰老过程中，层粘连蛋白B1不会被半胱氨酸蛋白酶裂解降解。

接下来，我们询问层粘连蛋白B1是否因mRNA水平下降而下降。定量PCR显示，在XRA后2天内，两种细胞株的层粘连蛋白B1 mRNA显著下降（p=0.01）(图3E). 结合这一结果和caspase抑制无法阻止层粘连蛋白B1的下降，我们得出结论，层粘连酶B1在衰老期间是在mRNA水平上调节的，而不是通过caspase裂解在翻译后进行的。有趣的是，层粘连蛋白B1 mRNA的下降至少部分是由于层粘连肽B1 mRNA稳定性的下降。在加入放线菌素D停止转录后的24小时，我们测量了剩余的层粘连蛋白mRNA的量。尽管层粘连素A mRNA在早衰细胞和衰老细胞中同样下降，但层粘连酶B1 mRNA在衰老细胞中下降得更快（p=0.001）(图3F)，在考虑了初始（放线菌素D前）mRNA水平的差异后。这一发现表明，衰老细胞中的层粘连B1 mRNA和随后的蛋白质减少，至少部分是由于层粘连B1mRNA稳定性降低。

化学抑制剂和诱导剂

细胞被给予10μM SB203580（559395；Calbiochem，La Jolla，CA）或10 mM NAC（A7250；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）溶解于水中并每日补充。用溶于二甲基亚砜中的100μM z-VAD-fmk（FMK001；R&D Systems，Minneapolis，MN）处理细胞，并每日补充。Staurosporine（500 nM）来自Sigma-Aldrich（S4400）。

媒介、病毒和感染

MKK6EE、基因抑制因子22和RAS^V12版本如前所述，被子克隆到网关目标向量670-1中(博塞等。，2003;坎波等。，2009). 使用无插入载体感染作为对照。针对绿色荧光蛋白（GFP；RHS4459）和RelA（TRCN0000014686，TRCN000001687）编码shRNAs的慢病毒载体来自Open Biosystems（Thermo Biosystes，Huntsville，AL）。编码ATM shRNA的慢病毒载体(罗迪耶等。，2009)病毒的产生如前所述(纳尔迪尼等。，1996;博塞等。，2003).

免疫荧光

细胞在玻璃室载玻片上培养，用福尔马林固定10分钟，并用0.1%Triton在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中渗透。在PBS中用1%牛血清白蛋白（BSA）和4%正常驴血清在室温下封闭玻片30分钟，清洗玻片，并在PBS的1%BSA中用一抗在室温下孵育1小时。用Alexa Fluor（Alexa 350，488，594；Molecular Probes，Invitrogen，Carlsbad，CA）清洗玻片并孵育用1%BSA中的二级抗体以1:750的比例在PBS中标记45分钟。用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）标记DNA。用Vectashield（H1000；加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories，Burlingame）清洗并安装载玻片。初级抗体如所述(石米等。，2008)并在以下稀释液中使用：层粘连蛋白B1，1:1000；层粘连蛋白B2，1:500；层粘连蛋白B1和B2（M-20），1:500；层粘连蛋白C（321-11），1:3000。使用开放式图像分析程序CellProfiler对图像进行定量(网址：www.cellprofiler.org).

收获小鼠肝脏，快速冷冻，切片，装在载玻片上，然后固定并在−20°C下用冰镇甲醇/丙酮（50/50）渗透5分钟。在室温下用1%牛血清白蛋白和5%正常山羊血清在PBS中清洗并封闭载玻片1小时，按照细胞培养所述用一级和二级抗体清洗并培养载玻片。使用带DAPI的ProLong Gold防褪色试剂清洗并安装载玻片({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“P36931”，“term_id”：“2506707”，“term_text”：“P26931”}}第36931页; Invitrogen）。使用CellProfiler对图像进行量化。

蛋白质印迹分析

用温热的PBS清洗细胞，在含有蛋白酶抑制剂（P8340，1:200；Sigma-Aldrich）的变性（1%SDS，10 mM Tris）或非变性（Cell Lysis Buffer，9803；Cell Signaling，Beverly，MA）缓冲液中溶解和刮除细胞和磷酸酶（200 mM咪唑、100 mM氟化钠、115 mM钼酸钠、100 mC原钒酸钠、400 mM酒石酸钠，1:100）。对裂解物进行针切，通过离心澄清，使用4-12%Bis-Tris凝胶进行SDS–PAGE，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。用圣克鲁斯生物技术公司（Santa Cruz，CA；NF-κB p65，SC-8008，1:1000；MKK6，SC-1992，1:1000，Sigma-Aldrich（微管蛋白，T-5168，1:4000）、BD转导实验室（肯塔基州列克星敦；RAS，R02120-050，1:1000）或BD生物科学（加利福尼亚州圣地亚哥；p16^INK4a公司, 554070, 1:1000; 层粘连蛋白A/C，612162，1:4000）。在室温下清洗膜并用辣根过氧化物酶（1:5000；细胞信号）或IR-dye（1:20000；LI-COR Biosciences，Lincoln，NE）结合二级抗体培养45分钟，然后清洗，分别通过增强化学发光或LI-COR Odyssey检测信号。

定量逆转录-PCR

使用RNeasy Mini Kit（74104；加利福尼亚州瓦伦西亚Qiagen）和iScript cDNA合成试剂盒（170-8891；加利福尼亚州Hercules Bio-Rad）生成的cDNA分离RNA。使用UPL系统（印第安纳波利斯罗氏）测定mRNA水平。人类引物（探针编号分别为31、17和58）如下：LMNB1，3′：aagcagctggtgtgtt；LMNB1，5′：ttggatgctcttggttc；LMNA，3′：agcaaagtgcgtgaggatt；LMNA，5′：tcaggtaccctcctttg；微管蛋白，3′：cttcgtctcccatcag；微管蛋白，5′：ttgccaatctggacaca。小鼠LMNB1引物如下（探针#15）：3′：gggaagttattcgcttgaaga；5′：atctccagcccatt。

酶联免疫吸附试验和条件培养基

检测IL-6（D6050）的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒来自研发系统。通过用无血清DMEM洗涤并在无血清DMEM中孵育24小时制备条件培养基。所有ELISA数据均归一化为细胞数。

我们感谢Robert Goldman用于免疫荧光的抗层粘连抗体，感谢Eisuke Nishida（日本东京大学）用于pSRalpha-myc-MKK6-EE载体。这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health Research Grants）AG09909和AG017242（J.C.）以及美国国家科学基金会（National Science Foundation）研究生奖学金（a.F.）的支持。