简介
自噬是一种重要的细胞途径，能够将细胞质内容物和细胞器传递到液泡或溶酶体进行降解。鉴于自噬在维持细胞内环境稳定中的重要作用，它与多种人类疾病密切相关(水岛等., 2008). 自噬领域的一个基本问题是，自噬是如何与细胞生理学和新陈代谢协调调节的。在真核生物中，必需营养素的缺乏强烈地诱导蛋白质和细胞器的自噬降解以维持生存(莱文和克林斯基，2004年). 因此，营养素饥饿是研究自噬代谢调控的常用模型。在酿酒酵母，众所周知，氮饥饿主要通过抑制雷帕霉素复合物靶标1（TORC1）的活性诱导自噬，从而导致Atg13p去磷酸化并激活Atg1p-Atg13p起始复合物(中川县等., 2009). 然而，氮利用率调节TORC1活性的机制仍不清楚。此外，其他代谢紊乱如何调节自噬途径也尚不清楚。在这项研究中，我们发现在没有氮饥饿的情况下，酵母细胞在从富培养基转换到最低培养基后诱导自噬。随后，我们使用这种新的自噬诱导条件作为模型，研究在代谢和营养状态发生细微变化时触发自噬的机制。
结果
在无氮饥饿的情况下，从富培养基切换到最低培养基时诱导自噬
我们选择了一株营养不良的菌株，而不是以前自噬研究中常用的营养不良菌株酿酒酵母，中心。PK（主键）(范迪肯等., 2000)研究自噬的调控。因为严重的营养缺乏是酵母和哺乳动物细胞自噬的众所周知的触发因素(莱文和克林斯基，2004年)，我们首先询问是否也可以在CEN中诱导自噬。PK菌株通过氮饥饿。为了解决这个问题，野生型（WT）原营养细胞在以乳酸为碳源（YPL）的富培养基中生长到对数期，然后切换到两种氮保存培养基（含葡萄糖但不含氮的最低培养基[SD-N]和含乳酸但不含氮气的最低培养液[SL-N]）。与葡萄糖相反，乳酸是一种不可发酵的碳源，需要线粒体进行代谢。对照组为非氮保存培养基（SD和SL）。正如所料，氮饥饿强烈诱导了一般自噬和细胞器自噬(和补充图S1）。
从富培养基转换到最小非失活培养基时诱导自噬。在切换到保氮培养基（SD-N或SL-N）之前，细胞在富培养基（YPL）中生长至对数期。使用非饥饿培养基（SD和SL）作为对照。在指定的时间点，通过ALP活性测定或以Idh1-GFP作为有丝分裂报告物的Western blot检测一般自噬或有丝分裂。印尼盾1编码线粒体基质蛋白。（A） 正如预期的那样，在饥饿培养基（SD-N和SL-N）中诱导了自噬，但在对照培养基（SD）中没有诱导自噬。令人惊讶的是，当切换到SL培养基时，自噬也被显著诱导。（B） 在Δ第5天细胞，在Δ中不受影响第11天细胞。（C） 在Δ第5天和Δ第11天细胞。（D） 自噬诱导条件触发的Atg13p去磷酸化。如前所述，雷帕霉素处理和氮饥饿导致Atg13p去磷酸化(Kamada等人，2000年). 在切换到SL培养基后，Atg13p也被去磷酸化。在转换到含有雷帕霉素（0.2μg/ml）的YPL培养基、缺氮培养基（SD-N）或SL培养基之前，细胞在YPL中生长至对数期。在指定的时间点，将5个OD细胞与TCA混合至最终浓度5-6%，并在离心前在冰上培养至少5分钟。然后对细胞颗粒进行全细胞TCA提取并通过免疫印迹分析。说唱。，雷帕霉素。（E和F）时间进程实验显示，自噬活性在2-4小时后可检测到，在大约6-8小时达到峰值，在切换到SL培养基后17-24小时后开始下降。在（A–C和E）中，数据表示三到五个样本的平均值，带有标准偏差的误差线。
然而，令人惊讶的是，在完全没有氮饥饿的情况下，切换到SL培养基后，碱性磷酸酶（ALP）报告子在一般自噬或有丝分裂中的活性也显著升高(). 之前发现的另外两个事件与有丝分裂、线粒体向液泡移位和Om45-GFP释放游离绿色荧光蛋白（GFP）有关(宽喜等2009年b;冈本等., 2009)在切换到SL培养基时也观察到（补充图S2、A和B）。通过Pex14-GFP释放的游离GFP评估，过氧化物酶体的自噬降解也上调（补充图S1）。此外，所有三名自噬活性的报告者在之前的特征分析中均显著降低自动液位计基因被删除(中川县等., 2009;和补充图S2，B-E）。始终，从YPL到SL的介质切换导致Atg13p去磷酸化()这被认为是自噬开始的早期步骤之一(中通川等., 2009). 综上所述，这些结果表明，自噬是在从富培养基（YPL）切换到最小非保氮培养基（SL）时诱导的。这种新的自噬诱导条件今后将被称为非氮保护（NNS）诱导自噬。在随后的实验中，我们通过测量一般自噬和有丝分裂来评估NNS诱导的自噬水平。
为了更好地理解NNS诱导的自噬，我们在切换到SL培养基后的不同时间点测量了自噬活性(). 时间进程实验表明，在培养基切换后2-4小时，NNS诱导的自噬可被检测到。自噬活性在6-8小时后达到峰值，17-24小时后开始下降。然后，我们测试了NNS诱导的自噬是否会在原营养型W303和S288C中发生，其营养缺陷型衍生物已广泛用于酵母研究。尽管自噬在两种菌株背景下均由氮饥饿诱导，但在W303细胞中观察到NNS诱导的自噬，但在S288C细胞中未观察到（补充图S3、A和B）。因为NNS诱导的自噬在两种CEN中都是强健的。PK和W303，我们认为NNS诱导的自噬是酿酒酵母S288C细胞在切换到SL培养基后未能触发自噬可能是由于不同酵母菌株之间的遗传多态性。
NNS诱导的自噬对介质转换后的细胞内环境稳定和生长至关重要
NNS诱导的自噬的生理作用是什么？为了解决这个问题，我们破坏了自噬体形成的核心机制，并测试了自动变速箱突变株从YPL培养基转换到SL培养基后可能表现出生长表型。为了确保潜在的生长表型是由自噬抑制引起的，而不是由基因特异性效应引起的，我们测试了8种自动液位计基因-自动液位计1,自动液位计5,自动液位计6,自动液位计7,自动液位计8,ATG9型,ATG10，和ATG13公司-每个编码一个核心Atg蛋白(中川县等., 2009). 对于所有八个自动变速箱突变体，YPL的生长速度与WT细胞相当(，左侧面板）。然而，在切换到SL培养基后，细胞生长在自动变速箱突变体(，右侧面板）。这些结果清楚地表明，NNS诱导的自噬对于从YPL培养基转换到SL培养基后的细胞生长非常重要，并且表明NNS诱导自噬是维持细胞内环境稳定所必需的，以响应培养基成分和细胞代谢状态的变化。此外，由于切换到SL培养基后，有丝分裂被强烈诱导()，我们询问单是抑制有丝分裂是否足以损害细胞生长。通过删除选择性破坏有丝分裂自动液位计32切换到SL培养基后对细胞生长没有影响(，右侧面板）。删除自动液位计32最近的研究表明，它会导致有丝分裂接近完全抑制(宽喜等2009年b;Okamoto等人。，2009).
NNS诱导的自噬对细胞从YPL培养基转换为SL培养基后的生长至关重要。（A） WT和自动变速箱YPL培养基中的突变细胞以及切换到SL培养基后的突变细胞。对于YPL中的生长测量，将指定基因型的细胞培养在YPL中至对数期，然后稀释至OD6000.05–0.1. 外径600稀释后每1-3小时测量一次，并根据第一个时间点进行标准化。对于从YPL培养基切换到SL培养基后的生长测量，所示基因型的细胞在YPL至对数期（OD）生长6000.1–0.15），然后切换到SL介质。外径600每24h测量一次，并与第一个时间点进行标准化。（B） WT的增长曲线，Δatg5，和Δatg32细胞在YPL培养基中以及在切换到SL培养基之后。按照（A）所述进行生长测量。
视觉筛查以确定NNS诱导自噬所需的基因
为了确定NNS诱导自噬所需的选择性基因，我们使用一组插入突变体（参见材料和方法). 简言之，一种原营养CEN。表达有丝分裂可视报告基因的PK菌株通过基于转座子的插入文库进行转化，以随机产生插入突变体(烧伤等., 1994). 在初级筛选中，将单个突变体生长在96 well平板的YPL中至对数期，然后切换至SL培养基诱导自噬。介质切换后8小时，使用自动成像装置获取线粒体图像。保存线粒体空泡信号很少或没有空泡信号的突变体用于二次筛选。二次筛选的目的是消除自噬核心机制被破坏的突变体。通过监测GFP-Atg8p在氮储存诱导的自噬过程中从细胞质到液泡的易位来检查自噬核心机制的完整性(基里萨科等., 1999). 在通过氮饥饿诱导自噬后，GFP-Atg8p主要留在细胞质中的突变体被丢弃，而具有强烈空泡GFP-Atg 8p信号的突变体则被保存以供进一步表征。
从视觉屏幕上，我们识别出两个先前特征的突变克隆自动液位计基因，ATG11型和自动液位计32(Kanki和Klionsky，2008年;宽喜等2009年b;冈本等., 2009)验证了我们的视觉屏幕的功效。更重要的是，视觉屏幕显示出三个特征不佳的基因，IML1公司,NPR2、，和净现值3，其缺失导致显著抑制NNS诱导的自噬，但引人注目的是，对氮储存诱导的自吞噬影响极小或没有影响(和补充图S4）。这三个基因对于W303菌株背景中NNS诱导的自噬也是必不可少的（补充图S3、C和D）。
视觉屏幕揭示了NNS诱导的自噬选择性需要的三个自噬调节器。细胞在YPL培养至对数期，然后切换至保氮培养基（SD-N）或非失活培养基（SL）。培养基切换后7至9小时，通过ALP活性测定法测量一般自噬或线粒体自噬。数据表示三到五个样本的平均值，带有标准偏差的误差线。（A和B）NNS诱导的一般自噬和有丝分裂在Δiml1，Δnpr2，和Δnpr3细胞。删除IML1公司,NPR2、，或净现值3然而，对氮滞留诱导的自噬作用影响极小甚至没有影响。Δatg5和Δatg32突变体作为阳性对照。
因为Npr2p和Npr3p与TORC1活性的负调控有关(Neklesa和Davis，2009年)已知雷帕霉素抑制TORC1后可诱导自噬(Noda和Ohsumi，1998年)，我们测试了IML1公司,NPR2、，和净现值3是雷帕霉素诱导自噬所必需的。尽管Δatg5时细胞在加入雷帕霉素后未能上调自噬活性，并且对雷帕霉素治疗更加敏感IML1公司,NPR2、，或净现值3对雷帕霉素诱导的自噬没有影响，并且始终不影响雷帕霉素的敏感性（补充图S5）。最近的研究表明，Npr2p和Npr3p可能对氮储存诱导的自噬很重要(杜库多夫斯卡娅等., 2011;Graef和Nunnari，2011年). 然而，我们观察到，Npr2p和Npr3p是通过多种分析选择性地被要求用于NNS诱导的自噬(和补充图S4A）。
一个复数中的Iml1p、Npr2p和Npr3p函数
因为IML1公司,NPR2、，和净现值3都选择性地参与SL诱导的自噬，并且已知Npr2p和Npr3p相互作用(Neklesa和Davis，2009年)，我们假设这三种蛋白可能在一个复合物中发挥调节自噬的作用。为了检测Iml1p、Npr2p和Npr3p之间的潜在相互作用，我们生成了带有这三种蛋白质的N或C末端表位标记版本的菌株。
我们通过联合免疫沉淀法验证了Npr2p和Npr3p之间的相互作用(). 然而，它们的相互作用与IML1公司(). 如前所述(斯皮尔沃伊等., 2010)，我们还观察了通过免疫沉淀Npr2p的磷酸酶处理评估的Npr2p的磷酸化(). 与磷酸化和去磷酸化Npr2p结合的Npr3p(). 相反，Iml1p主要与磷酸化Npr2p相互作用，后者的磷酸化依赖于两者净现值3和IML1公司(). 我们还检测到Iml1p和Npr3p之间的相互作用，以及NPR2型严重取消了互动(). 总的来说，我们已经证明Iml1p确实与Npr2p和Npr3p形成复合体，并且两者都丢失了NPR2型或净现值3中断复合体中其他两个组件之间的绑定。为了支持这些数据，最近的一项研究报告称，通过质谱分析，复合物中存在Iml1p、Npr2p和Npr3p(杜库多夫斯卡娅等2011年). Iml1p-Npr2p-Npr3p复合体此后将被称为“Iml1p复合体”
Iml1p、Npr2p和Npr3p函数在一个复数中。细胞在YPL中生长到对数期，然后切换到SL培养基。在指定的时间点，收集80-150个指定双标记菌株的OD细胞，并进行FLAG或HA免疫沉淀。（A） Npr2-FLAG和HA-Npr3相互作用。免疫印迹观察到两种形式的Npr2p。Npr3p与两种形式的Npr2p相关联。删除IML1公司导致Npr2p慢迁移带丢失，但不影响Npr2p和Npr3p之间的相互作用。（B） Iml1p主要与磷酸化形式的Npr2p相互作用。收集生长于YPL至对数期的细胞，进行FLAG或HA免疫沉淀，然后进行磷酸酶处理。磷酸酶处理消除了Npr2p的缓慢迁移带，表明Npr2p是磷酸化蛋白。Iml1p主要下调磷酸化形式的Npr2p，后者在磷酸酶处理后塌陷成信号带。（C）净现值3Npr2p磷酸化和Iml1p-Npr2p相互作用都需要。在没有Npr3p的情况下，去磷酸化的Npr2p无法降低Iml1p。（D） Iml1p还与Npr3p合作。Iml1p-Npr3p相互作用在缺乏NPR2型在切换到SL培养基后，Iml1p-Npr2p-Npr3p相互作用的程度或Npr2p的磷酸化状态似乎没有显著变化。
Iml1p形成点状结构，偶尔与前吞噬体结构共存
然后，我们通过用GFP标记蛋白质来监测Iml1p复合物的定位。当细胞在YPL中生长时，无法检测到Iml1-GFP。然而，当从YPL培养基切换到SL培养基时，我们观察到Iml1-GFP在一小部分细胞的液泡附近形成点状结构(和). 在YPL中检测不到Iml1-GFP点状结构并不是因为Iml1-GFP表达的差异，因为Iml1-GFP的表达在切换到SL培养基后的早期没有改变(). 然后我们询问在其他自噬诱导条件下是否可以检测到点状结构。然而，在切换到保氮培养基（SD-N；). 因此，Iml1-GFP在NNS诱导的自噬过程中特异性地形成点状结构，这与Δiml1。
在NNS诱导的自噬过程中，Iml1-GFP定位于PAS和非PAS点状结构。（A） 在切换到SL培养基时，Iml1-GFP在Vph1-mCherry标记的液泡附近形成点状结构。Vph1p是一种液泡驻留蛋白。显示了不同时间点的典型图像。比例尺，5μm。（B） 切换到SL介质时，Iml1-GFP定位到PAS（箭头）和非PAS点状焦点（箭头）。PAS标记为Ape1-mRFP1(铃木等人，2007年). 显示了不同时间点（YPL->SL 1.5–3 h）的典型图像。比例尺，5μm。（C） 切换到SL培养基后，在一小部分细胞中检测到Iml1-GFP点状结构。然而，从YPL培养基切换到保氮培养基（SD-N）并没有诱导Iml1-GFP点状结构的形成。（C–E）量化不同条件下具有Iml1-GFP点状结构的液泡百分比。每个时间点至少统计200个细胞。数据表示三个独立实验的平均值，带有标准偏差的误差条。（D） Iml1-GFP点状结构在Δnpr2和Δnpr3细胞切换到SL培养基后。（E） Iml1-GFP点状结构的形成在Δatg8时细胞在切换到SL培养基后的早期点。（F） 在切换到SL培养基后的早期时间点，Iml1-GFP的丰度没有变化，但在后期时间点略有增加。在指定的时间点，收集5个OD细胞进行全细胞TCA提取，然后通过免疫印迹分析。Pgk1p用作加载控制。（G） Iml1 GFP的表达在Δnpr2,Δnpr3，和Δatg8细胞。通过免疫印迹分析来自对照细胞或突变细胞的TCA沉淀的全细胞提取物。
尽管在YPL和SL介质中未检测到Npr2-GFP和Npr3-GFP信号（未发表的数据）NPR2型或净现值3导致Iml1-GFP点状结构完全丧失，而不影响Iml1-GFP的表达(和). 在YPL培养基中检测不到Iml1-GFP，在YPL和SL培养基中也检测不到Npr2-GFP和Npr3p-GFP，可能是因为它们的低表达。在典型的全细胞提取物中未检测到Iml1p、Npr2p和Npr3p（未公布的数据）。我们只能使用三氯乙酸（TCA）沉淀的全细胞提取物来检测它们(和未发布的数据）。
在酿酒酵母雷帕霉素诱导自噬后，到目前为止鉴定出的大多数Atg蛋白被征募到前自噬体结构（PAS）中，PAS的组织和动力学对自噬小体的形成很重要(铃木和大秀，2010年). 由于PAS和Iml1-GFP点状结构都位于空泡附近，并且在功能上与自噬有关，我们怀疑Iml1-GFP可能定位于PAS。为了解决这种可能性，我们使用Ape1p作为PAS的标记(铃木等., 2007)在切换到SL介质数小时后，对Iml1-GFP和Ape1-mRFP1进行了双色成像。有趣的是，我们观察到Iml1-GFP点状结构定位于Ape1阳性PAS和Ape1阴性非PAS(). Iml1p对PAS的定位与IML1公司并提示Iml1p或Iml1p复合物可能参与调控自噬体的形成。
类似地，Atg8p先前已被证明形成点状病灶，定位于PAS和非PAS，就像隔离膜一样(基里萨科等., 1999;铃木等., 2007). 因此，我们测试了自动液位计8可能会调整Iml1p本地化。删除自动液位计8在切换到SL培养基的早期，部分阻断了Iml1-GFP点状结构的形成，而不影响Iml1-GFP的表达(和). 相反，Atg8-GFP点的形成在Δiml1，Δnpr2，或Δnpr3细胞（补充图S6）。基于这些结果，我们假设在自噬体形成过程中，Iml1p或Iml1p复合物在Atg8p下游一步发挥作用。与此想法一致IML1公司,NPR2、，或净现值3切换到SL培养基后，没有逆转Atg13p的去磷酸化()尽管Npr2p和Npr2与TORC1的负调控有关(Neklesa和Davis，2009年).
IML1公司,NPR2、，和净现值3不调节Atg13p磷酸化。细胞在YPL中生长到对数期，然后切换到保氮培养基（SD-N）或SL培养基。在指定的时间点，按照。
Iml1p复合物在NNS诱导的自噬过程中调节自噬体的形成
为了确定在NNS诱导的自噬过程中，Iml1p复合物是否影响自噬小体的形成或自噬体与液泡的融合，我们对WT、，Δiml1，Δnpr2，Δnpr3，和Δatg5将培养基从YPL切换到SL 9小时后的细胞。自噬体和液泡之间的融合在Δiml1，Δnpr2，和Δnpr3因为我们没有观察到空泡外有大量的自噬体堆积。然而，我们观察到Δiml1，Δnpr2，和Δnpr3细胞在液泡中含有较少的自噬体。为了更定量地分析自噬体的形成，我们根据每个细胞中观察到的AB数量将细胞分为两组。含有少于八个AB的细胞被视为第一组，而含有八个或更多AB的电池被视为第二组。只有8.5%的WT细胞含有少于8个AB，而与之形成鲜明对比的是，56.3%的WTΔiml1细胞，52.8%Δnpr2细胞，43.5%Δnpr3细胞，100%Δatg5时在含有少于八个AB的细胞中(). 综上所述，这些结果表明，在NNS诱导的自噬过程中，Iml1p复合物调节自噬体的形成。
在NNS诱导的自噬过程中，Iml1p-Npr2p-Npr3p复合物调节自噬体的形成。培养基从YPL切换到SL后9小时，收集并处理所示基因型的细胞进行超微结构分析。显示了具有少于八个AB或具有八个或更多AB的细胞的代表性图像。分类为每组的细胞百分比在相应的图像中显示。每个基因型计数的细胞总数：271（WT），256(Δiml1), 337 (Δnpr2), 232 (Δnpr3), 134 (Δatg5). V、 液泡。用于电镜分析的所有菌株都含有缺失Δpep4和Δprb1，包括WT（补充表S1）。
Iml1p包含NNS诱导自噬所需的保守结构域
IML1公司编码一种具有两个潜在功能域的～182kDa蛋白：N端的未知功能域（DUF）3608域（以下简称DUF域）和C端的Dishevelled、Egl-10和Pleckstrin（DEP）域(). DUF域是以前未标记的域。类似NPR2型和净现值3(Neklesa和Davis，2009年),IML1公司也被预测在高等真核生物中有同源基因，包括智人.所有的直系亲属都与IML1公司就规模和领域架构而言，但以前也没有进行过表征。Iml1p及其同源序列之间的全长比对表明，高度保守的残基分散在整个蛋白质中（补充图S7）。一些区域相对更保守，例如DUF结构域，而其他区域包含更少甚至没有保守残基，例如DEP结构域().
Iml1p包含进化上保守的结构域，对NNS诱导的自噬和Iml1p复合物的形成非常重要。（A） Iml1p域结构的示意图。（B和C）Iml1p及其同系物之间DUF域（B）和DEP域（C）的多序列比对。高度保守的残留物为黑色。嗯，小家鼠; 雷诺数，褐家鼠; Hs、，智人; Gg、，五倍子; Dm、，黑腹果蝇; 服务提供商，葡萄裂殖酵母; 理科，酿酒酵母（D和E）通过Western blot和ALP活性测定评估，Iml1p的DUF结构域是NNS诱导自噬所必需的。将全长IML1-FLAG、IML1Δdep-FLAG或IML1△duf-FLAG的编码序列克隆到一个着丝粒质粒中，该质粒由CYC1（日历年1）启动子。将表达Iml1-FLAG、Iml1Δdep-FLAG或Iml1△duf-FLAG的空载体或质粒转化为Δiml1细胞，以确定他们是否能够拯救NNS诱导的自噬。显示WT单元以进行比较。在（E）中，数据表示三到五个样本的平均值，带有标准偏差的误差条。（F） Iml1p的DUF（RANS）域是与Npr2p和Npr3p交互所必需的。将表达Iml1-FLAG、Iml1Δdep-FLAG或Iml1△duf-FLAG的空载体或质粒转化为Δiml1单元格，然后用于下拉Npr2p或Npr3p。
我们通过将Iml1ΔDEP或Iml1△DUF引入到自噬中来测试DUF和DEP结构域对Iml1p的功能是否重要Δiml1细胞，以确定他们是否能够拯救NNS诱导的自噬。我们观察到，表达全长Iml1p或Iml1Δdep的质粒可以显著但不完全地挽救自噬(). Iml1p或Iml1Δdep的表达与内源性染色体位点的Iml1p的表达不完全匹配，这可能是部分挽救的原因（补充图S8）。相反，Iml1Δduf不能挽救NNS诱导的自噬()，这可能是由于与Npr2p和Npr3p的相互作用几乎完全丧失(). 由于DUF结构域在进化上比DEP结构域更保守，并且确实在NNS诱导的自噬中起着重要作用，我们推测，其他的同源基因可能存在于国际货币基金组织1在特定条件下，家庭也可能参与调节自噬。为了支持这一观点，研究表明Npr2p和Npr3p的人类同源物也与酵母细胞中观察到的相互作用(Neklesa和Davis，2009年). 据我们所知，这是DUF3608域功能的第一个特征，我们建议将其重命名为RANS(R（右）需要用于A类在N个非氮气-S公司停滞状态）域，以表明其在自噬中的功能作用。
讨论
我们发现了一种以前未被认识到的自噬诱导条件，称为NNS诱导的自吞噬。对NNS诱导的自噬的观察表明，除了严重的氮或碳饥饿外，自噬还可以通过介质组成和细胞代谢状态中相对较细微的变化进行调节。这些代谢变化的性质以及它们是如何被自噬机制感知的，目前尚不清楚，这将是未来研究的一个领域。
重要的是，NNS诱导的自噬在培养基组成和代谢状态发生变化时，在维持细胞内环境稳定方面发挥着关键作用，因为通过破坏自噬核心机制来阻止NNS诱导自噬，在切换到SL培养基时会导致严重的生长表型。因此，NNS诱导的自噬可能对使细胞快速适应不断变化的生长环境很重要。
NNS诱导自噬的另一个有趣特征是，这种自噬与饥饿诱导的自噬不同，它依赖于碳源。切换到以葡萄糖为碳源的SD培养基时不会诱导自噬(). 一直以来，在SL培养基中添加葡萄糖完全阻断了转换为SL后的自噬诱导（补充图S9）。这些结果表明，NNS诱导的自噬严格受细胞代谢状态控制，可能受到葡萄糖抑制。例如，由乳酸（一种不可发酵的碳源）触发的线粒体呼吸功能的上调可能对NNS诱导的自噬至关重要。或者，丰富的可发酵碳源（如葡萄糖）可能会抑制调节NNS诱导自噬的途径。基于这些观察结果，我们预测，对NNS诱导的自噬的研究将提高我们对自噬诱导与代谢密切协调的认识。
此外，我们认为酿酒酵母例如CEN。PK对研究自噬的代谢调控具有重要价值。这些原营养菌株没有破坏某些必需代谢物（如氨基酸和核苷酸）生物合成途径的基因组损伤，这些代谢途径可能影响自噬和其他代谢过程的调节(波尔等., 2008;2010年周二;图等., 2005). 因此，原营养细胞的代谢行为可能更真实，更能代表野生酵母细胞。
通过进行基于这些考虑因素设计的视觉屏幕，我们确定了一种蛋白质复合物，称为“Iml1p复合物”，它选择性地被NNS诱导的自噬所需，并调节自噬体的形成。因此，我们的研究揭示了存在特异性调节NNS诱导的自噬的蛋白质，而不是氮储存诱导的自吞噬。我们认为Iml1p复合体在进化上可能是保守的，原因有三。首先，预计复合物Iml1p、Npr2p和Npr3p的所有三个组分在高等真核生物中都有同源物。第二，Npr2p-Npr3p相互作用以前已经证明在人类细胞中是保守的(Neklesa和Davis，2009年). 最后，我们证明了Iml1p包含一个进化上保守的结构域（RANS结构域），它不仅对Iml1p复合体的形成很重要，而且对NNS诱导的自噬也很重要。
有趣的是，Atg13p的去磷酸化表明，从富含YPL培养基切换到最低SL培养基时，TORC1可能会失活(). 然而，我们对选择性参与调节NNS诱导的自噬的其他因子的鉴定表明，NNS诱导自噬背后的分子机制可能不同于调节氮储存诱导的自吞噬。此外，我们的研究结果表明，假设NNS通过TORC1诱导自噬功能，在这两种自噬诱导条件下，输入TORC1的上游信号可能不同。由于Iml1p复合物的破坏对雷帕霉素诱导的自噬没有影响（补充图S5），我们推测Iml1p复合物在TORC1下游的步骤中不起作用。此外，Iml1p复合物调节Atg13p磷酸化的失败意味着Iml1p复合物不调节TORC1活性(). 因此，我们的研究表明，其他机制可以根据诱导刺激差异调节自噬。未来的研究需要确定触发NNS诱导自噬的上游信号，并阐明Iml1p复合物如何调节NNS诱导的自噬。
材料和方法
酵母菌株和培养基
补充表S1列出了本研究中使用的菌株。
本研究中使用的介质(谢尔曼，2002)是YPL（1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%乳酸）；SL（0.17%酵母氮碱，不含氨基酸和硫酸铵，0.5%硫酸铵，2%乳酸）；SD（0.17%酵母氮碱，不含氨基酸和硫酸铵，0.5%硫酸铵，2%葡萄糖）；SD-N（0.17%酵母氮碱，不含氨基酸和硫酸铵，2%葡萄糖）；和SL-N（0.17%酵母氮基，不含氨基酸和硫酸铵，2%乳酸）。
质粒
质粒pFA6a-OM-KanMX6用于制作ALP报告子（Pho8Δ60和OM-Pho8Δ60.）。OM代表线粒体外膜靶向。为了产生质粒pFA6a-OM-KanMX6，我们首先通过替换CYC1（日历年1）p417-CYC1启动子（Dualsystems Biotech，Schlieren，Switzerland），具有~411碱基对-长TEF1标准发起人囊我和Xba公司I站点。用于扩增的引物TEF1标准启动子为5′-ATTGCGAGCTCATAGCTCAAAATGTCTCTCTTT-3′（正向引物）和5′-AttGCTCTAGAACTTAAACTTAGATGTCTTT-3’（反向引物）。碱基对1–96个TOM20，编码线粒体外膜靶向序列，插入p417-TEF1Xba公司我和生态RV场地。用于扩增靶向序列的引物为5′-GACTTCTAGAATGCCCAGTCGAACCCTATTAC-3′（正向引物）和5′-CAGTGATCTTGATAGTCAAAGTAGAAAC-3’（反向引物）。然后TEF1标准启动子和外膜靶向序列在囊我和生态RV站点并插入pFA6a-KanMX6(朗廷等., 1998)制作pFA6a-OM-KanMX6。
如本节稍后所述，产生用于产生线粒体自噬成像报告基因的质粒HO-poly-MtRFP-KanMX4-HO。Plasmid vt100-DsRed，来自Nunnari实验室的慷慨礼物(Westermann和Neupert，2000年)，被切割速度I、 并将含有线粒体靶向序列和DsRed编码序列的所得片段用Klenow钝化并克隆到Sma公司质粒HO-poly-KanMX4-HO的I位点(沃斯人等., 2001).
GFP-Atg8p表达质粒p417-GFP-ATG8的产生如本节后面所述。500个碱基对–长自动液位计8启动子插入质粒p417-TEF1囊我/巴姆HI站点。然后GFP公司编码序列插入到产生的质粒中巴姆HI（高）/生态RI站点。最后，ATG8编码序列被克隆到质粒中生态RI公司/萨尔I站点。为了制备质粒pRS41N/H-GFP-ATG8，从p417-GFP-ATG中切下GFP-AT8的编码序列并克隆到载体pRS41N/H中(出租车和Knop，2006年)在囊我/Spe公司I站点。
以质粒p417-CYC1为骨架，我们创建了质粒p417-2CYC1-IML1-FLAG、p417-CYC1-IML1Δdep-FLAG和p417-C YC1-iml 1Δduf-FLAG，用于用表达Iml1-FLAG的细胞制备的基因组DNA作为模板，扩增Iml1-FLAG的编码序列。因为我们很难在一个PCR中扩增整个编码序列，所以我们通过引入一个生态RI定位在DEP结构域之前，并将N或C末端片段克隆到p417-CYC1中Spe公司我/生态RI站点或生态RI公司/萨尔我的网站，分别。除了在PCR中跳过编码dep结构域或duf结构域的序列外，对表达Iml1Δdep-FLAG或Iml1△duf-FLAG的质粒进行了类似的克隆。
检测自噬
成像。
构建了一株双色报告菌，表达线粒体定位DsRed（MtRFP）和GFP标记的空泡膜蛋白Vph1p（Vph1-GFP），以可视化线粒体吞噬。液泡中MtRFP信号的增加表明有丝分裂的诱导。
蛋白质印迹。
根据之前描述的方法，检测Om45-GFP、Idh1-GFP和Pex14-GFP释放的游离GFP，以测定有丝分裂或有丝分裂(宽喜等2009年). Om45p是一种线粒体外膜蛋白。Idh1p是一种线粒体基质蛋白。Pex14p是一种过氧化物酶体膜蛋白。
ALP活性测定。
表达细胞溶质Pho8Δ60p或线粒体外膜靶向Om-Pho8Δ60 p的细胞分别进行ALP活性测定，以测量一般自噬或有丝分裂水平。
碱性磷酸酶测定的方案基本上遵循了前面描述的方法(野田等., 1995)进行了一些修改。简单地说，用400μl裂解缓冲液（250 mM Tris-HCl pH 9，25 mM MgSO）重新悬浮细胞颗粒4，1%Triton，1X EDTA无蛋白酶抑制剂鸡尾酒[瑞士巴塞尔罗氏公司]）。在添加～100μl玻璃珠（西格玛，圣路易斯，密苏里州）后，通过三轮珠子敲打来溶解细胞：敲打1分钟，然后在冰上冷却1分钟。通过在4°C下以最大速度离心10分钟，从细胞提取物中分离细胞碎片和玻璃珠。对于每个样品，将70μl细胞提取物添加到96 well平底板中的三个重复孔中。在添加基底之前，将盘子放在冰上。向空白孔中添加裂解缓冲液（70μl）。基质溶液（250 mM Tris-HCl pH 9，25 mM MgSO4，1%Triton®声波风廓线仪，2.7 mM第页-硝基苯磷酸盐[MP生物医学生命科学，索隆，俄亥俄州]；然后将70μl）添加到每个孔中。然后在室温下培养平板5分钟，然后用140μl停止缓冲液（1 M甘氨酸，pH 11）停止反应。在400 nm处读取极板，以测量第页-硝基苯酚。
可视屏幕
创始人菌株MtRFP，Δleu2用酵母基因组mini-Tn3:：lacZ:：LEU2转座子插入文库转化，通过同源重组随机产生插入突变体(烧伤等., 1994). 大约5000个突变体被制作出来并在初级筛选中进行了测试。将单个突变体在96 well平板的YPL中培养至对数期，然后切换到SL培养基中培养8 h，然后将细胞转移到384孔的玻璃底板上进行成像。使用BD Pathway 855显微镜（新泽西州富兰克林湖BD Biosciences）以40倍放大率自动捕获MtRFP信号。大约60个突变体被发现几乎没有或几乎没有液泡状MtRFP信号，并被保存用于二次筛选。二次筛选的目的是消除随机插入破坏自噬核心机制的突变体。为此，将表达GFP-Atg8p的着丝粒质粒转化到从原筛分离的突变体中。然后将突变体在YPL中培养至对数期，然后切换至缺氮培养基（SD-N）。在培养基切换后约6小时，以100倍放大率对细胞进行成像，以显示GFP-Atg8p和MtRFP。发现了24个具有空泡Atg8p信号但很少或没有空泡MtRFP信号的突变体，并将其保存以供进一步鉴定。然后使用Vectorette PCR方法绘制这些突变体的插入位点(莱利等., 1990).
蛋白质印迹
对于全细胞提取物制备，用300μl酵母裂解缓冲液（50 mM NaCl、50 mM NaF、100 mM Tris-HCl[PH7.5]、1 mM EDTA、1 mM-EGTA、1%Triton X-100、10%甘油、14 mM 2-巯基乙醇、1X EDTA无蛋白酶抑制剂鸡尾酒[Roche]）重新悬浮细胞颗粒，2 mM苯基甲基磺酰氟，5μM Pepstatin A，10μM亮肽）。在添加～80μl玻璃珠后，通过三轮珠子敲打来溶解细胞：敲打1分钟，然后在冰上冷却1分钟。
使用的抗体为小鼠抗GFP单克隆抗体（克隆7.1和13.1；Roche）、小鼠抗Pgk1单克隆抗体。
显微镜
使用横河（日本东京）CSU-22旋转共焦盘在尼康（纽约州梅尔维尔）ECLIPSE Ti显微镜上对细胞成像。GFP用488nm固体激光线激发，红色荧光蛋白用568nm固体激光器线激发。使用带有Andor ix897电子倍增电荷耦合器件（Andor Technology，Belfast，Northern Ireland）的100×/1.45NA CFI复色物镜记录图像。
免疫沉淀
在指定的时间点，采集80-150 OD（光密度）当量的细胞，用液氮快速冷冻，并在-80°C下保存，直到细胞溶解。然后将细胞颗粒在冰上解冻，并用500μl酵母溶解缓冲液重新悬浮。添加～500μl玻璃微珠后，通过微珠敲打9-10次将细胞溶解：敲打20 s，然后在冰上冷却3 min。将粗细胞提取物进行离心（16100×克)在4°C下保持5分钟。将上清液转移到新试管中，并用玻璃珠将500μl裂解缓冲液添加到试管中。珠子洗了两次。通过离心收集上清液，并将其与第一轮打球获得的上清液合并。合并的上清液进行离心，以清除细胞碎片和玻璃珠。然后将清除的上清液与15μl磁珠（Invitrogen）混合，磁珠与2μg FLAG或HA抗体结合，并在4°C下培养4小时用于FLAG免疫沉淀或8小时用于HA免疫沉淀。
TCA沉淀的全细胞提取物的制备
按照之前描述的方案制备TCA沉淀的全细胞提取物(基奥等., 2006)稍作修改。简单地说，在指定的时间点，造粒五个OD细胞，用20%TCA清洗，用液氮快速冷冻，然后在-80°C下储存，直到细胞溶解。然后在冰上解冻细胞颗粒，并用250μl 20%TCA重新悬浮。在加入~250μl玻璃珠后，通过珠打三次裂解细胞：打1分钟，然后在冰上冷却1分钟。通过离心收集沉淀物，并用5%TCA清洗一次，用100%乙醇清洗一次。然后将洗涤后的颗粒溶解在120μl缓冲液中（40μl 1 M Tris-HCl，pH 8.0，加80μl 2×SDS样品缓冲液），并煮沸5–10分钟。
电子显微镜
UT西南医学中心电子显微镜核心设备使用快速冷冻和冷冻替代法进行电子显微镜分析。样品制备按照Baba（2008）)除了酵母细胞需要进行高压冷冻，而不是直接冷冻。使用FEI（瑞士洛桑）Tecnai G2 Spirit透射电子显微镜拍摄超微结构图像。
