α-突触核蛋白损伤巨自噬：与帕金森病的关系

野生型α-突触核蛋白过度表达抑制哺乳动物细胞分泌

早期对酵母菌的研究发现，自噬可能依赖于分泌途径的正常功能(Ishihara等人，2001年;Hamasaki等人，2003年;Reggiori等人，2004年). 鉴于先前的研究结果表明，α-突触核蛋白通过破坏Rab1a体内平衡抑制酵母和体外分泌(Cooper等人，2006年;Gitler等人，2008年)，我们认为，在ER到高尔基体转运水平上，α-突触核蛋白引起的分泌途径缺陷可能是我们在哺乳动物细胞中观察到的自噬缺陷的基础。为了研究α-突触核蛋白对哺乳动物细胞内质网向高尔基体转运的影响，我们使用了一种药物控制的分泌系统，该系统能够敏感地测量组成性分泌的变化。该试验表明，野生型α-突触核蛋白的过度表达对哺乳动物细胞的组成性分泌产生适度但可重复的抑制作用(图2 A). 过表达α-突触核蛋白的细胞也显示出高尔基体碎裂增加(图2、B和C)通常由分泌缺陷引起的表型（例如，Rab1a siRNA敲除；图S2 A). 与这些发现一致，与健康对照组相比，尸检PD脑切片中观察到高尔基体碎片增加(Fujita等人，2006年).

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图2。

α-突触核蛋白的过度表达抑制哺乳动物细胞的分泌并导致高尔基体碎裂。（A） 指示α-突触核蛋白-CFP过度表达对HeLa衍生报告细胞系（C1）组成性分泌的影响的条形图。Brefeldin A是一种已知的组成性分泌抑制剂，用作阳性对照（*，P<0.05；双尾Student’st吨测试；n个= 3). 生长激素。（B） 过表达α-突触核蛋白–GFP的HeLa细胞内源性GM130（顺高尔基标记物）的免疫染色。图像是z堆栈投影。棒材，20µm。（C） α-突触核蛋白对高尔基体裂解作用的量化（***，P<0.001；比值比；n个= 6). （A和C）误差线代表SEM。

Rab1a调节自噬

我们测试了Rab1a基因敲除是否调节自噬。由于没有已知的Rab1a活性的特异性抑制剂，我们使用敲除实验来模拟Rab1a功能的丧失。在bafilomycin A1存在和不存在的情况下，Rab1a的siRNA敲除降低了LC3-II水平(图3 A). Rab1a敲低增加了具有突变亨廷顿蛋白聚集体的细胞的百分比(图3 B). Rab1的一种组成活性形式抑制了突变体亨廷顿蛋白的毒性果蝇属光感受器(图3 C)而显性阴性Rab1增强了突变亨廷顿蛋白片段的毒性(图3 D). 因此，Rab1a缺乏调节自噬并模拟α-突触核蛋白过度表达对自噬和相关表型的影响。值得注意的是，α-突触核蛋白的过度表达不会影响细胞或小鼠脑裂解物中的Rab1a蛋白水平，这与α-突触核蛋白对Rab1a活性而非蛋白水平的影响一致（图S2 B）。

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图3。

敲除Rab1a抑制大自噬。（A） 在敲除Rab1a并用bafilomycin A1处理HeLa细胞后，通过SDS-PAGE评估LC3-II水平。肌动蛋白水平显示出相等的负荷。代表性数据集的密度测定(n个=3）显示有和没有巴非霉素（*，P<0.05；学生的t吨测试）。（B） 指示Rab1a敲除对httQ74-HA聚集的影响的条形图，如A所示（***，P<0.001；比值比；n个= 9). （A和B）误差条表示SEM。（C）组成型活性Rab1的神经元表达（Rab1 CA；UASp-YFP公司。拉伯1.Q70L)在Rab1-CA存在和不存在的情况下，使用elav-Gal4驱动因子显著抑制表达突变亨廷顿蛋白外显子1（Q120；分别为5.0±0.12和4.1±0.06）的5-d龄苍蝇的神经变性；Student’st吨测试）。每只正常的苍蝇眼都含有数百只小蜂和七个可见的杆状体。这些图表显示了每种基因型每小粒的弹状体数量的分布。使用配对学生的t吨使用五到七个独立实验的数据进行测试，每个实验基于每个基因型的约10个个体，每个基因型都有15个小蜂被打分。（D） 显性负性Rab1（Rab1-DN；UAST-YFP。拉布1.S25N)在Rab1-DN存在和不存在的情况下，使用elav-Gal4驱动因子显著增强了表达突变亨廷顿蛋白外显子1（Q120；分别为4.1±0.1和5.2±0.1）的5-d龄苍蝇的神经变性；Student’st吨测试）。请注意，C和D之间的Q120 elav-Gal4苍蝇的神经退化程度可能不同，因为这些是独立的实验，持续时间不相同。

鉴于Rab1a在分泌中的作用，我们想确定Rab1a是否独立于一般分泌调节自噬，或者自噬是否实际上取决于分泌途径的正常功能，这与早期酵母研究有关(Ishihara等人，2001年;Hamasaki等人，2003年;Reggiori等人，2004年). 了解这种差异可能会提供线索，说明α-突触核蛋白引起的自噬缺陷是否是分泌缺陷的一般后果，或者Rab1a对自噬的抑制是否可以与一般分泌缺陷分离，这表明Rab1a在自噬调节中具有特殊作用。为了开始解决这个问题，我们使用RNAi降低Rab1a效应器（Giantin和VDP[囊泡锁蛋白115]）、对Rab1a分泌至关重要的早期分泌蛋白（Sar1A和-B）以及Rab1b（Rab1的一种替代亚型，也参与早期分泌）的蛋白水平。在敲除这些蛋白后，我们分析了它们的缺失对分泌和自噬的影响，以更密切地观察这两条途径的相互作用。敲除Rab1a、VDP、Giantin、Sar1A和-B均部分抑制构成性分泌(图4 A)以诱导分泌80分钟后分泌的蛋白质百分比来衡量。Rab1b（似乎将不同的囊泡亚群输送至Rab1a；Allan等人，2000年;Alvarez等人，2003年)抑制分泌的程度与Rab1a、Giantin和VDP相似。与Rab1a一样，已知Rab1a效应物Giantin和VDP以及Sar1A和-B的敲除降低了LC3-II水平(图4 B)，增加了含有亨廷顿蛋白聚集体的细胞百分比(图4C)增加了p62的积累(图4 D). 出乎意料的是，Rab1b的敲除对自噬产生了相反的影响。Rab1b RNAi增加LC3-II(图4 E)水平，降低含亨廷顿蛋白聚集体的细胞百分比(图4 F)，并且p62的积累减少(图4 G).

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图4。

自噬并不依赖于调节分泌的所有Rab蛋白。（A） 为了测量Rab1a、Rab1b、Sar1A/B、Giantin和VDP的RNAi对组成分泌的影响，用与这些基因对应的siRNA转染HeLa衍生的C1细胞。用流式细胞术测定诱导分泌80分钟后细胞中残留的GFP–生长激素的量。作为阳性对照，用已知的分泌抑制剂STX5（syntaxin5）siRNA转染细胞(n个=3个独立实验；***，P<0.001；多重比较、单向方差分析、Dunnett的多重比较事后检验）。生长激素。（B） 敲除HeLa细胞中的Sar1A和-B、Giantin或VDP后，通过SDS-PAGE评估LC3-II水平。肌动蛋白水平显示出相等的负荷。（C） 条形图显示敲除对httQ74聚集的影响，如B中所示（**，P<0.01；***，P<0.001；比值比；n个= 9). （D） 在敲除的最后24小时内，将番茄p62和DsRed转染到HeLa细胞中，如B细胞，并通过SDS-PAGE测定其效果。DsRed被用作tomato-p62的转染对照。与DsRed相比，tomato-p62水平的量化如条形图所示（*，P<0.05；**，P<0.01；Dunnett的多重比较事后检验；n个= 3). 将数值归一化为单独实验的控制值。（E） 在敲除Rab1b（显示的条带来自同一凝胶，并且忽略了无关的条带）或Rab2后，通过SDS-PAGE评估LC3-II水平。肌动蛋白和微管蛋白水平显示出相等的负荷。（F） 条形图显示敲低对转染细胞中httQ74聚集百分比的影响，如E中所示（***，P<0.001；比值比；n个= 9). （G） 在敲除的最后24小时内，将番茄p62和DsRed转染到HeLa细胞中，如在E中，并通过SDS-PAGE测定其效果。DsRed被用作tomato-p62的转染对照。相对于DsRed的tomato-p62水平的定量显示在条形图中（**，P<0.01；Bonferroni的多重比较事后检验；n个= 3). 将数值归一化为单独实验的控制值。（A、C、D、F和G）误差线代表SEM。

尽管人们对Rab1a和Rab1b的不同功能知之甚少，但它们在自噬背景下的作用的明显差异令人惊讶。这导致我们测试了另一种功能相关的Rab，Rab2。Rab2的特征甚至不如Rab1b，它在内质网-高尔基体和高尔基体内运输的几乎所有方面都发挥着作用(蒂斯代尔，1999年). 与Rab1b一样，Rab2的敲除增加了稳态LC3-II(图4、D和E)水平，降低含亨廷顿蛋白聚集体的细胞比例(图4 F)，并降低p62水平(图4 G). 尽管Rab1b的敲除抑制了分泌，类似于Rab1a，但它实际上减少了自噬底物的聚集。有趣的是，化学数据进一步证实了支持自噬功能独立于分泌功能的证据，这些数据表明，众所周知的自噬诱导剂海藻糖(Sarkar等人，2007年)导致部分分泌受阻（图S2 C）。总的来说，这些数据为Rab1在自噬调节中的特定作用提供了有力证据，而自噬的调节独立于一般分泌对自噬产生的任何影响。这些数据表明，在不降低自噬体合成的情况下，某些分泌途径会受到损害，而由Rab1a及其效应器特异性调节的途径对自噬至关重要。

Rab1a能够拯救α-突触核蛋白对自噬的抑制作用

为了进一步证实α-突触核蛋白通过Rab1a作用于自噬的假说，我们测试并证实了Rab1a的过度表达可以挽救α-突触核蛋白过度表达导致的自噬小体丢失。与对照条件相比，α-突触核蛋白的过度表达显著降低了囊泡数。Rab1a-CFP的共表达将囊泡计数的减少恢复到控制水平(图5，A和B).

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图5。

Rab1a可以拯救α-突触核蛋白对大细胞自噬的影响。（A） 用空CFP载体（对照条件）或Rab1a-CFP（挽救条件）表达α-突触核蛋白-HA的细胞对SKNSH细胞中的tomato-LC3囊泡的影响。使用带有23个多聚谷氨酰胺重复序列（httQ23）的HA标记野生型（wt）亨廷顿蛋白外显子1片段作为在对照和救援条件下表达α-突触核蛋白-HA的细胞的对照。我们在这些实验中使用了每个细胞20个小泡的截止值，因为LC3的瞬时转染增加了小泡的基线水平（与内源性LC3相比），20个小囊是在这些细胞的野生型条件下观察到的平均值。棒材，20µm。（B） 量化Rab1a-CFP对α-突触核蛋白依赖性LC3水平降低的影响（**，P<0.01；双尾Student’st吨测试；n个= 3). 误差条代表SEM。

α-突触核蛋白和Rab1a影响自噬蛋白Atg9的定位

我们已经证明，α-synuclein导致分泌和高尔基体缺陷，与Rab1a稳态破坏一致，α-sunuclein和Rab1a在自噬体合成中导致类似和特异的缺陷，而Rab1b可以拯救α-synuglein对自噬的抑制作用。这表明α-突触核蛋白通过Rab1a抑制自噬。为了确定α-突触核蛋白和Rab1a对自噬作用的潜在机制，我们分析了自噬体合成的关键步骤。Rab1a敲除或α-突触核蛋白过度表达均未影响自噬信号通路中的关键参与者，如mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶点）活性(图S3 A).

我们接下来关注的是Atg9，因为它是唯一已知的跨膜自噬蛋白之一（在其转运和糖基化中涉及分泌途径），并且是自噬体生物发生所必需的。Atg9定位于TGN，并与部分LC3阳性自噬体共定位。雷帕霉素诱导自噬或饥饿导致Atg9从TGN移向自噬体（图S3 B），导致Atg8与TGN标记物共定位减少，Atg9与自噬体共定位增加（图S3C；Young等人，2006年). Rab1a敲除和α-突触核蛋白过度表达不会明显影响Atg9的糖基化(图S4 A). 然而，这两种扰动都导致Atg9从其正常的核周位置（与TGN标记p230共定位）重新定位到细胞内的弥散分布(图6 A和图S4 B）。这种定位错误，在α-synuclein过度表达的细胞中或Rab1a被敲除的细胞中，也表现为与Atg9共定位的LC3小泡比例较低，与LC3共定位的Atg9结构较少（通过使用Mander系数控制LC3小囊数量减少后；图6，C–E). 这种定位错误并不是自噬抑制剂的一般特征，因为在用{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“LY290042”，“term_id”：“1257839980”}}LY290042号（一种磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂；Young等人，2006年)、3-甲基腺嘌呤或巴非霉素A1，它们都不同于雷帕霉素（显示为Atg9运动的阳性对照；图S4 C）。此外，在敲除Rab1b和Rab2后，未发现Atg9共定位的这种特征性改变，这两种基因都增加了Atg9和LC3的共定位（图S4、D和E），并降低了Atg8与p230的共定位。这些数据与我们早期的发现一致(图4，E–G)表明Rab1b和Rab2基因敲除增加了自噬。总的来说，这些数据表明，不仅Rab1a敲除和α-突触核蛋白过度表达的作用相似且相对特异，而且Rab1b和Rab2的不同作用表明，Rab1a-敲除对自噬的影响不仅仅是由组成性分泌或高尔基体结构的一般性干扰引起的。

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图6。

α-突触核蛋白和Rab1a影响Atg9和LC3小泡的共定位。（A） α-synuclein过度表达或Rab1a敲除SKNSH细胞中Atg9和p230的内源性免疫染色。使用空GFP载体（EGFP）作为表达α-突触核蛋白–GFP的细胞的对照。显示的图像是z轴堆栈投影。Atg9面板显示，随着α-synuclein过度表达或Rab1a敲除，核周定位明显分散。在p230列中可以看到高尔基体碎裂。α-突触核蛋白过度表达导致高尔基体结构紊乱增加，这是一种通过Rab1a敲除而扩增的表型。（这些图像的放大倍数已保存在JCB DataViewer中。）（B）用p230（皮尔逊系数；***，P<0.001；双尾Student’st吨测试；n个=10（来自一个代表性实验）。（C） α-synuclein过度表达或Rab1a敲除细胞内内源性Atg9和LC3的免疫染色。使用空GFP载体（GFP）作为表达α-突触核蛋白–GFP的细胞的对照。Colocalization在合并面板上以白色突出显示（图像由ImageJ Colocalisation插件生成）。图像是单共焦平面，以更精确地确定共聚焦。箭头表示同位化事件。（这些图像的放大倍数已保存在JCB DataViewer中。）（D和E）Atg9与LC3共定位的量化（皮尔逊[D]和曼德系数[E]）。当LC3囊泡数量因Rab1a敲除或α-突触核蛋白过度表达而减少时，E中第一个条形图中显示的Mander系数更准确地预测Atg9/LC3共定位（*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；双尾Student’st吨测试；n个= 10). （B、D和E）误差条代表SEM。参见相关图S3棒材：（A）20µm；（C） 10微米。

骨料量化

EGFP-httQ74聚集通过直接免疫荧光检测，而httQ74-HA聚集通过免疫染色检测（初级HA抗体[1:500；Covance]和抗小鼠Alexa Fluor结合二级抗体[1:1000；Invitrogen]）。对含有聚集物的转染细胞比例进行评分（每张盖玻片约200个细胞）。每三个独立实验进行三次盲法实验。聚集分析的统计数据以原始数据95%置信区间的优势比（每种情况下聚集细胞核的比率）进行计算。使用SPSS 6.1版（SPSS Inc.）中的通用对数线性分析，通过无条件逻辑回归分析确定比值和p值。

蛋白质印迹

通过标准SDS-PAGE技术评估蛋白质水平。主要抗体包括抗EGFP（Takara Bio Inc.）、抗HA（12CA5；Covance）、抗Rab1a、抗Atg9（均为Abcam）、抗tubulin和抗LC3（Novus Biologicals）。在ImageJ（美国国立卫生研究院）软件中对正常ECL开发技术和LI-COR Odyssey（BD）进行蛋白质水平的Western blotting定量。

免疫荧光和显微镜

细胞生长在盖玻片上，并在4%多聚甲醛中固定10分钟，然后用−20°C甲醇渗透4分钟。对于使用httQ74-HA的聚集实验，使用0.5%Triton X-100在PBS中渗透细胞。使用PBS中4%的山羊血清（Sigma-Aldrich）进行阻断，并使用一级和二级缓冲液。将盖玻片放置在4°C的初级抗体中过夜。次要抗体是结合Alexa Fluor抗体（Invitrogen）。除抗LC3（纳米工具）外，用于免疫印迹的所有初级抗体均用于免疫染色。

共聚焦显微镜（63×NA 1.4 Plan-Apochromat油浸透镜；LSM510 META；Carl Zeiss，Inc.）以及LSM5103.2版软件（Carl Zess，Inc.）用于荧光共聚焦显微镜，包括用Alexa Fluor–共轭二级抗体或荧光标记蛋白进行免疫荧光染色。除DFCP1-GFP HEK293 omegasome细胞系的实验外，所有共聚焦图像均使用63×油浸透镜拍摄，其中使用40×油浸镜头。对固定在盖玻片上的细胞进行显微镜检查。盖玻片安装在Prolong Gold防褪色试剂中（使用DAPI；Invitrogen）。ImageJ和Photoshop（Adobe）用于共焦图像的进一步分析和处理（下一节将讨论共焦分析和图像处理软件的使用细节）。使用显微镜（Plan-Apochromat 60×NA 1.4油浸透镜；Eclipse E600；Nikon）进行聚集计数和高尔基体碎裂定量。

共定位的量化

在对内源性蛋白质进行免疫染色后，使用LSM510 META共聚焦显微镜（63×NA 1.4 Plan Apochromat油浸透镜）和LSM510 3.2版软件对Atg9与高尔基体（p230）和LC3的共定位进行成像。在每个实验条件下，每幅图像平均拍摄5个细胞的10张图像。每个实验都至少进行两个独立的实验。在整个采集过程中，曝光设置保持不变。在z堆栈中对细胞进行成像，并通过JaCoP插件对图像进行分析(博尔特和科德利埃，2006年)在ImageJ软件中。Pearson和Mander（原始非阈值）系数用于报告共定位。学生的t吨测试在Excel（Microsoft）中进行，以确定共定位系数的统计显著性。显示的图像是使用ImageJ和Photoshop软件的z堆栈投影或代表性图像的单个平面。

分泌分析

矢量（pC₄S公司₁-FM公司₄-FCS-hGH）编码药理学调控的报告结构，从ARIAD Pharmaceuticals获得(Rivera等人，2000年). 修改了结构，以便在信号序列和第一个FM之间的帧内克隆EGFP₄聚合域。然后将报告构建体亚克隆到逆转录病毒表达载体pQXCIP（Takara Bio Inc.）中。通过病毒转染HeLa细胞生成了一个稳定的细胞系（称为C1），该细胞系表达报告构建物。

对于siRNA实验，如前所述，使用寡病毒胺（Invitrogen）将OnTargetPlus siRNA寡核苷酸（最终浓度100 nM；Thermo Fisher Scientific）转染C1细胞(莫特利等人，2003年). 在过度表达实验中，使用HeLaMonster（Mirus）将α-synuclein–CFP或CFP转染到C1细胞96小时，然后检测分泌情况。Brefeldin A是一种已知的分泌抑制剂，以2µg/ml的浓度作为本试验的对照。

为了评估组成性分泌，通过在37°C和5%CO中用1µM AP21998（ARIAD Pharmaceuticals）培养C1细胞来启动稳定表达的GFP–生长激素的分泌₂将细胞放在冰上，使其停止分泌，并将细胞与胰蛋白酶-EDTA溶液（PAA Laboratories）在4°C下孵育2小时，将其从培养皿中分离出来。使用添加FCS的DME对胰蛋白酶进行猝灭，然后使用FACSCalibur流式细胞仪（BD）在0和80分钟对样品进行EGFP荧光分析。使用7-氨基放线菌素D排除死细胞。为了分析α-突触核蛋白过度表达实验，需要CFP和GFP荧光检测，样品在Cyan ADP（Beckman Coulter）上进行分析。

为了测量GFP的分泌量，每个siRNA寡核苷酸或构建物被转染两次。第一个样本用于初始时间点（0分钟），第二个样本用于最终时间点（80分钟）。测量每个样品的平均荧光，并使用FlowJo软件（Tree Star，Inc.）计算细胞中剩余的GFP量。

使用Excel软件对Student’st吨测试（过表达实验）和PRISM软件（GraphPad software，Inc.）用于单向方差分析（ANOVA；siRNA实验）。80分钟后分泌蛋白的百分比是通过将80分钟时的GFP荧光除以0分钟时的绿色荧光蛋白荧光来确定的。对于α-突触核蛋白和brefeldin A，该比率被归一化为空载体（CFP）。

高尔基体碎裂

使用抗GM130抗体对过度表达α-突触核蛋白–GFP或EGFP的细胞进行高尔基体免疫染色。破碎的高尔基体被认为是分散的、非凝聚的GM130染色，而非破碎高尔基体则被认为是凝聚的、核周的和带状的GM130着色。用高尔基体碎片转染细胞的百分比在至少200个细胞的盲法实验中进行计数，共进行三次。

果蝇属菌株

对适当基因型的后代进行假瞳孔分析，这些后代是由基因型的处女杂交产生的elav-GAL4型^155元; gmr-Htt（外显子1）Q1204.62(Jackson等人，1998年)与表达野生型α-突触核蛋白的苍蝇(UAS-α-syn;费尼和本德，2000年)和表达组织学活性Rab1的苍蝇(年¹P（P）{UASp-YFP.Rab1.Q70L}CG3638^第12页w个*;Zhang等人，2007年)或显性负Rab1(年¹w*；P（P）{UAST-YFP.Rab1.S25N}mei-S332⁰⁴;Zhang等人，2007年).

作为衍生飞行系的对照，同基因的处女w个¹¹¹⁸线路(Ryder等人，2004年)或者泛神经驾驶员elav-GAL4型^155元与每个转基因系的雄性杂交以产生后代，以确认除gmr-Htt（外显子1）Q120导致神经退化。同样的处女与男性杂交y w；gmr-Htt（外显子1）Q1204.62评估突变体亨廷顿蛋白引起的神经退行性变率。

在25°C下进行苍蝇杂交和实验。在相同的时间和条件下进行所有单独实验的杂交。使用配对的Student’st吨使用五到七个独立实验的数据进行测试，每个实验基于每个基因型的约10个个体，每个基因型都有15个小蜂被打分。我们感谢M.Feany（马萨诸塞州波士顿哈佛医学院）、G.R.Jackson（加利福尼亚大学洛杉矶分校医学院）和Bloomington果蝇库存中心果蝇属股票。

老鼠

M7α-synuclein小鼠是V.M.-Y.Lee（宾夕法尼亚大学，费城，PA）赠送的礼物。为了产生三种可能的小鼠基因型，M7纯合子与C57BL/6J杂交，F1杂交产生F2上的三种基因型（+/+、M7/+和M7/M7）。所有实验均使用F2小鼠。所有程序均按照适当的内政部和地方道德委员会批准执行。

在所有实验中使用F2小鼠。利用实时PCR技术从耳垂DNA中对F2小鼠进行基因分型。通过Western blotting验证α-突触核蛋白的表达水平。半脑（22–23周龄男性；n个各=3）在裂解缓冲液（0.5%Triton X-100和50mM Tris-HCl，pH 7.4，补充有完整的蛋白酶抑制剂混合物[Roche]）中均化。匀浆在4°C下以13200 rpm离心。去除上清液，通过SDS-PAGE评估LC3-II和微管蛋白水平。使用ImageJ软件对免疫印迹进行密度分析。野生型小鼠的平均值设置为100%，误差条表示SEM。

对于剂量依赖性测量，使用R进行回归分析。为了验证α-synuclein转基因剂量与LC3-II水平之间的关联，我们使用了置换试验。我们将小鼠随机分配到不同的基因组，测试关联性，并存储测试统计数据。我们重复了10万次，计算了置换测试的p值，测试统计的比例大于原始分析中观察到的比例。

统计

除非另有说明，否则所有数据均为代表性实验的平均值。除非另有说明，否则所有实验均进行了三个独立实验。组间单次比较的统计显著性由双尾、非配对、Student’st吨在Excel软件中执行的测试。使用比值比（SPSS软件；SPSS，Inc.）确定聚集实验的显著性。聚集测定的统计数据计算为比值比（每种条件下转染细胞与聚集物的比率），原始数据的置信区间为95%。使用SPSS 6.1版中的一般对数线性分析，通过无条件逻辑回归分析确定比值和p值。为了简化数据表示，将聚集实验的柱状图表示为具有代表性的实验中聚集百分比的平均值，并使用平均值的SEM。在PRISM软件中，使用Bonferroni或Dunnett的多重比较事后检验，通过单向或多重比较方差分析确定两个以上组之间比较的统计显著性。

我们感谢H.Sitte的Rab1a-CFP构建。我们感谢M.Feany、G.R.Jackson和布鲁明顿果蝇库存中心果蝇属M7α-突触核蛋白小鼠的库存和V.M.-Y.Lee。我们感谢N.T.Ktistakis向我们发送DFCP1-GFP HEK293 omegasome细胞系。我们还要感谢J.Cooper（英国剑桥大学）在统计方面的帮助，以及M.Gratian和M.Bowen（剑桥大学）对显微镜技术的帮助。

导致这些结果的研究得到了威康信托基金（D.C.Rubinsztein高级研究员）、医学研究委员会（MRC；D.C.Rupinsztei、C.J.O'Kane的项目拨款，A.A.Peden的S.Brown和职业发展奖）、威康信托/MRC（D.C.鲁宾斯泰因的神经变性战略奖）的资助，海外研究生奖学金和剑桥海外信托基金（授予A.R.Winslow）以及欧洲共同体第七框架计划（FP7/2007-2013），授予协议编号241791（MEFOPA）。