突变体Pink1通过干扰钙流诱导帕金森病神经元细胞模型线粒体功能障碍

表达α-syn和Pink1的慢病毒的产生

的cDNASNCA公司和粉红色1基因首先被合成并克隆到表达载体中。人类体重和W437X粉红色1如前所述，cDNA被克隆到pcDNA3.1-HA载体（Invitrogen，Carlsbad，CA）中(西尔维斯特里等。2005). 人体重量和A53TSNCA公司如前所述，cDNA被克隆到pCEP4载体（Invitrogen，Carlsbad，CA）中(桥本等。1997,竹野内等。2001)

然后将cDNA克隆到具有XbaI和BamHI位点的第三代慢病毒载体pBOB中。通过瞬时转染293T细胞制备表达Pink1（wt和突变W437X）、α-syn（wt及突变A53T）、绿色荧光蛋白（GFP）或空载体（作为对照）的LVs(纳尔迪尼和维尔玛2000).

表达α-syn和Pink1的神经元细胞系的建立

在这些实验中，我们使用了大鼠神经母细胞瘤细胞系B103。之所以选择这种模型，是因为这些细胞中α-syn的过度表达会干扰神经元的可塑性（减少神经突起的生长和粘附），但不会导致明显的细胞死亡(Takenouchi等人，2001年,桥本等。2003). 此外，这些细胞表现出线粒体改变和寡聚α-syn的异常积累(Takenouchi等人，2001年,Hashimoto等人，2003年). 该模型模拟了帕金森病的早期发病过程，即多巴胺能细胞死亡之前，神经突起生长减少和突触改变(Takenouchi等人，2001年,桥本等人，2003年). 在所有实验中，将细胞置于完全培养基中，以40倍感染率（MOI）感染表达wt或突变Pink1和wt或突变体α-syn的LVs。感染后，细胞在37°C的5%CO2增湿环境中培养48小时。所有实验均一式三份，以确保再现性。

免疫印迹分析

在含有1%Nonide P-40（Calbiochem）的TNE缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM EDTA；均来自Sigma-Aldrich）中用蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Roche）溶解细胞。总细胞提取物在6000×g下离心15分钟，上清液的蛋白质浓度用BCA蛋白质检测试剂盒（皮尔斯生物技术公司，伊利诺伊州罗克福德）进行检测。对于Western blot分析，将每条通道20μg裂解液加载到4–12%的Bis-Tris SDS-PAGE凝胶中，并将其印在聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用α-syn抗体和HA抗体孵育印迹，然后用辣根过氧化物酶标记的二级抗体（1:5000，Santa Cruz Biotechnology，Inc.），通过增强化学发光进行可视化，并用Versadoc XL成像仪（加州Hercules BioRad）进行分析。肌动蛋白水平分析被用作负荷控制。

免疫荧光共聚焦显微镜

为了验证感染不同LV载体的细胞中α-syn或Pink1的表达水平，将细胞接种到聚L-赖氨酸涂层玻璃盖玻片上，生长到60%的汇合处，并在4%多聚甲醛（PFA）中固定20分钟。用0.1%Triton X-100在TBS中预处理盖玻片20分钟，然后在4°C下与抗人α-syn抗体（1:500）或抗HA抗体（1:250）孵育过夜。第二天，用异硫氰酸荧光素（FITC）结合二级抗体检测抗体（Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）。对照样品包括：空载体或GFP感染细胞，以及在没有初级抗体的情况下进行免疫标记。使用Prolong Gold防褪色试剂和DAPI（Invitrogen）安装盖玻片。用数字荧光显微镜（Olympus BX51）分析细胞，以估计显示GFP、α-syn或HA（Pink1）反应性的总细胞百分比（DAPI染色）。

为了验证α-syn和Pink1在不同LV载体共同感染的细胞中的共同表达，如前所述，将盖玻片进行双重标记(工作人员等。2008). 盖玻片由空气驱动，用防褪色介质（Vectashield，Vector Laboratories）安装在载玻片上，并用共焦显微镜MRC1024（BioRad）成像。每个条件下平均有50个细胞被成像，单个通道图像被合并并使用Image J程序进行分析。

LC3水平分析

为了研究表达突变Pink1和α-syn的神经元细胞中增大的电致密体是否与自噬反应相一致，用LC3-GFP和免疫印迹分析了盖玻片中LC3的水平。如上所述生长B103细胞，然后以5×10的密度将其镀在聚L-赖氨酸涂层玻璃盖玻片上⁴细胞。电镀后5小时，用LV-α-syn和/或LV-Pink 1感染细胞，并培养48小时。所有盖玻片还同时感染了慢病毒载体，该慢病毒载体表达LC3-GFP，MOI为40。然后用无血清DMEM洗涤培养物2次，然后在用4%PFA固定之前将完全培养基或无血清培养基加入12小时。如前所述(皮克福德等。2008)用Prolong Gold抗褪色试剂和DAPI（Invitrogen）处理盖玻片，并用LSCM成像，以使用半自动图像分析系统和ImageQuant软件确定与自噬体一致的GFP阳性颗粒结构的数量。对于每种情况，平均分析50个细胞。此外，通过蛋白质印迹分析LC3水平。简单地说，如前所述(Pickford等人，2008年)，用LV-α-syn和/或LV-Pink 1感染细胞72小时，然后在TNE缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM EDTA；均来自Sigma-Aldrich）中用蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Roche）溶解细胞。将每条通道20μg裂解液装入4–12%的双三SDS-PAGE凝胶中，并将其印在聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用兔抗LC3多克隆抗体（识别LC3-I和LC3-II，Abcam）孵育斑点，然后用辣根过氧化物酶标记的二级抗体（1:5000，Santa Cruz Biotechnology，Inc.），通过增强化学发光进行可视化，并用Versadoc XL成像仪（BioRad，Hercules，CA）进行分析。肌动蛋白水平分析被用作负荷控制。

线粒体形态和膜电位的Mitotracker评估

使用膜透性染料Mitotracker Red MCXRos（Invitrogen）检测线粒体形态和线粒体膜完整性损伤。这种染料迅速被带负电的线粒体吸收，从而能够评估线粒体形态的变化，并定性地估计线粒体膜电位的变化（ΔΨ_米) (巴克曼等。2001). 细胞被镀在聚-L-赖氨酸涂层盖玻片上，生长到60%汇合处，并感染如上所述的LVs。根据制造商的方案进行Mitotracker染色，并使用激光扫描共聚焦显微镜对盖玻片进行成像。实验也在CsA或细胞钙抑制剂RR（10μM）、CC（5μM）和FFA（40μM）存在下进行。如前所述(朗福德等。2004)，每个条件下平均获得200个细胞，并使用ImageQuant软件（新泽西州皮斯卡塔韦的分子动力学）测定平均像素强度水平。此外，还使用NIH Image J程序对这些条件下获得的数字化图像进行分析，以确定平均线粒体直径。

为了确定α-syn或Pink1与线粒体的共定位，用Mitotracker染色的盖玻片在4%PFA中固定20分钟，并用α-syn-或HA抗体进行免疫染色。用FITC-结合二级抗体（Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）检测一级抗体，并用激光扫描共聚焦显微镜检查。每个条件下平均有50个细胞被成像，单个通道图像被合并并使用Image J程序进行分析。

电子显微镜

简单地说，B103神经元细胞被放置在35毫米的培养皿中，底部有一张盖玻片，并感染LV。48h后，将细胞固定在2%多聚甲醛和1%戊二醛中，然后固定在四氧化锇中并包埋在epon araldite中。树脂硬化后，将含有细胞的块状物从盖玻片上取下，用超切片机（徕卡）进行切片。通过免疫电镜分析进一步表征线粒体中Pink1的存在。如前所述(马萨利亚等。2001)将盖玻片上的细胞包埋在环氧树脂陶粒中，然后进行超薄切片。将切片放置在formvar涂层网格上，蚀刻，然后用HA抗体或α-syn抗体进行免疫标记（用于检测HA标记的Pink1），然后用10 nm Aurion ImmunoGold颗粒（1:50，电子显微镜科学，宾夕法尼亚州华盛顿堡）进行银增强标记。如前所述，使用蔡司OM 10电子显微镜分析网格(罗肯施泰因等。2001).

MTT、LDH、TUNEL和轴突长度分析

如前所述，通过MTT、LDH和TUNEL分析评估线粒体活性、细胞死亡和凋亡(Langford等人，2004年). 在完全培养基中，将细胞接种在96孔板上。对于治疗，将细胞转移到最低限度的培养基（1%血清）中，然后按照制造商的说明（Promega）进行测定。为了评估神经突起的生长和粘连，每种情况下平均有100个神经元用相差显微镜成像，并用ImageQuant软件估计神经突起长度。

细胞ATP生成的测量

使用ATP发光检测试剂盒Cell Titer-Glo（Promega）测量细胞ATP水平。将细胞接种在完全培养基中的黑色透明底部96孔板上，感染并孵育48小时。治疗后，根据制造商的说明进行ATP检测。简单地说，向每个孔中添加100μl反应溶液，并在RT下培养2分钟，然后在平板读取器中检测发光（Beckman Coulter，DTX880）。用各种药物处理感染细胞后，也进行ATP测定。实验在亲环素D抑制剂CsA（5μM）或各种细胞钙抑制剂（包括RR（10μM）、CC（5μM）和FFA（40μM））存在下进行。

钙动员试验

使用FLIPR 4钙测定的改良方案（加利福尼亚州桑尼维尔市分子设备公司）评估钙内流。简单地说，B013细胞感染了MOI为30的LV构建物，并在含有10%FBS和青霉素/链霉素的DMEM培养基（Mediatech，Manassas，VA）中培养。培养物保存在37°C的培养箱中，环境为95%空气和5%CO₂感染后两天，将细胞以30000个细胞/孔的密度接种在具有平坦透明底部的Costar 96孔黑色板（Corning，Corning，NY）上。抑制剂处理后，用100μl HBSS缓冲液替换培养基，并向每个孔中添加100μl钙染料。细胞在37°C的培养箱中保存1小时，然后使用DTX 880多模检测器（加利福尼亚州富勒顿市贝克曼·库尔特）在470–495/515–575 nm的激发/发射过滤器测量荧光。作为钙内流的阳性对照，向一组微孔中添加0.6μg离子霉素（西格玛，密苏里州圣路易斯）。

突变体Pink1促进α-同步表达神经元细胞线粒体结构的改变

接下来，我们使用Mitotracker Red比较了联合感染wt或mut-Pink1的α-syn表达神经元细胞中线粒体的特征。在感染空LV载体、LV-GFP、LV-α-syn-wt或LV-Pink1 wt的细胞中，线粒体表现为离散的点状或细长结构(图2A-C)平均直径为0.76μm(图2G)平均占细胞表面积的8%（未显示数据）。由于空LV载体（称为LV对照）和LV-GFP都给出了可比较的结果，因此使用LV对照进行后续实验，以避免图像分析和双标记实验中荧光通道的干扰。

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图2

用Mitotracker分析感染LV表达α-syn和Pink1的神经元细胞的线粒体形态。（A-C）感染LV-空对照、α-syn wt和Pink1 wt（D-F）的神经元细胞中线粒体（箭头）的基线外观。（G） 线粒体平均直径的图像分析。用激光共聚焦显微镜记录每个条件下平均200个细胞，并用NIH Image J程序进行分析。表达α-syn A53T或Pink1 W437X的细胞线粒体大小增加了25-50%。在同时感染LV-α-syn A53T和LV-Pink1 W437X的细胞中，这些变化加剧*第页与LV对照组感染细胞相比，单因素方差分析和事后Dunnett检验均<0.05#第页与单独感染LV-α-syn A53T或LV-Pink1 W437X的细胞相比，单因素方差分析（ANOVA）和事后Tukey-Kramer试验的结果均<0.05。面板（F）中的比例尺（5μm）适用于所有照片。

表达LV-α-syn A53T的神经细胞(图2D)或Pink1 W437X(图2E)线粒体形态发生显著变化，包括轮廓不规则和体积增大(图2G). 这些改变在同时感染α-syn和Pink1突变型（LV-α-synA53T和LV-Pink1 W437X）的细胞中加剧(图2F、G). 然而，仅表达α-syn或Pink1突变形式的细胞（α-syn-A53T和Pink1 wt或α-syn-wt和Pink1W427X）与其单一感染的对应细胞没有显著差异(图2G).

为了进一步研究过度表达α-syn和Pink1的神经元细胞线粒体改变的特征，进行了超微结构分析。与共焦显微镜数据一致(图2)，与LV控制相比(图3A、B)，神经元细胞感染LV-α-syn A53T(图3C、D)或LV-Pink1 W437X(图3E、F)显示出显著的亚细胞变化，包括线粒体增大和不规则。细胞内同时表达这两种突变蛋白(图3G，H和图4)这些改变更为严重，线粒体经常增大(图4B)或细长(图4C)嵴异常，偶见单个电致密包裹体堆积(图4D). 此外，自噬小体异常增大，内含丰富的电致密包涵体，常与增大的线粒体很接近(图4B和补充图2)，这些也经常被直径在9-11nm之间的丝状聚集体包围(图4E、F).

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图3

表达α-syn和Pink1的LV感染神经元细胞的超微结构分析。（A和B）感染LV对照的细胞显示线粒体（M）、粗面内质网和溶酶体（L）的基线结构保持不变。（D-F）在感染LV-α-syn A53T（C和D）或Pink1 W437X（E和F）的神经元细胞中，线粒体（M）被拉长，通常被细丝包围（箭头）。此外，细胞质中有丰富的电感应层状结构，让人想起自噬多聚体（AP）。（G和H）同时感染LV-α-syn A53T和Pink1 W437X的神经细胞显示，线粒体增大，嵴多余（箭头所示），溶酶体异常（L），含有电致密物质和自噬体（AP）。面板（G）中的比例尺（0.5μm）适用于面板A、C、E、G；面板（H）中的比例尺（1μm）适用于面板B、D、F、H。

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图4

感染LV表达突变型α-syn和Pink1的神经元细胞系线粒体病理学特征。（A） LV对照组感染细胞中保存的线粒体（M）形态。（B，C）在同时感染LV-α-syn A53T和Pink1 W437X的细胞中，在自噬小体（AP）附近发现线粒体增大和拉长。（D） 与LV-α-syn A53T和Pink1 W437X共同感染的细胞线粒体基质中异常电致密颗粒（箭头）的积聚。（E，F）与LV-α-syn A53T和Pink1 W437X共同感染的细胞中异常线粒体被细丝（箭头）和自噬体包围。插图显示了更高倍的线粒体周围纤丝图像。面板（F）中的比例尺（0.25μm）适用于所有显微照片。

为了验证超微结构数据，并确定表达突变Pink1和α-syn的神经元细胞中增大的电致密体是否对应于可能与功能失调线粒体周转相关的自噬反应，通过共聚焦显微镜分析表达GFP标记LC3的B103细胞中LC3的表达模式。这些研究表明，与感染载体控制的LC3-GFP表达细胞相比(补充图3A、G)，共表达LC3-GFP和LV-α-syn-wt、LV-α-syn A53T或LV-Pink1 W437X的细胞显示GFP荧光增强，与LC3表达水平增加相对应(补充图3B-D、G). 在与LV-Pink1 W437X共同感染的细胞中，LC3-GFP积聚在离散的细胞质聚集体中，这种作用增强(补充图3D-F、G). 与共聚焦显微镜结果一致，B103细胞LC3免疫反应的免疫印迹分析表明，与LV对照组相比，感染LV-α-syn的细胞显示LC3水平升高(补充图3H，I).

为了进一步研究Pink1在高水平表达α-syn的PD细胞模型中介导线粒体损伤的作用，进行了共定位研究。表达Pink1 wt的神经细胞(图5A-C)或α-syn-wt(图5D-F)显示出一种更为弥漫的免疫反应，很少在线粒体周围共同定位。相反，在感染LV-Pink1 W437X的神经元细胞中(图5G-I)，Pink1的免疫反应性与Mitotracker染色的线粒体更接近。同样，在感染LV-α-syn A53T的神经元细胞中(图5J-L)线粒体周围有α-syn免疫反应(图5G-L). 这一效应在图5M-O-在同时感染LV-α-syn A53T和LV-Pink1 W437X的细胞中变得更加明显(图5P-R).

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图5

在感染LV的神经元细胞中，α-syn和Pink1与线粒体的共定标。细胞生长在盖玻片上，用Mitotracker Red标记，用α-syn-或HA抗体进行免疫染色，以检测Pink1，并用激光共聚焦显微镜成像。（A-C）表达Pink1 wt或（D-F）α-syn-wt的细胞显示出更弥漫的免疫反应（箭头）。（G-I）在感染LV-Pink1 W437X或（J-L）LV-α-syn A53T的细胞中，Pink1或α-syns的免疫反应性更接近Mitotracker染色的线粒体（箭头所示）。（M-O）方框所示图像的特写。（P-R）在与LV-α-syn A53T和LV-Pink1 W437X（*）共同感染的细胞中，突变体α-syn-和Mitotracker的共扩增变得更加明显。面板（R）中的比例尺（5μm）适用于面板A-L和P-R；面板（O）中的比例尺（2μm）适用于面板m-O。

对表达Pink1并用HA抗体进行免疫标记的B103神经元细胞的电子显微镜分析证实，与对照组相比，mut-Pink1感染细胞的线粒体中存在丰富的金颗粒，wt-Pink中的金颗粒较少(补充图4). 金颗粒倾向于与线粒体内膜结合。在排除初级抗体的对照实验中，或在未感染的神经元细胞中，只在细胞质中观察到分散的金颗粒，但与线粒体无关。

突变Pink1相关线粒体结构改变导致α-syn表达神经元细胞线粒体功能缺陷

为了确定mut-Pink1介导的线粒体结构改变是否与功能缺陷相关，线粒体ΔΨ_米通过分析Mitotracker红荧光进行半定量评估(图6). 与LV对照组或wtα-syn或Pink1感染的细胞相比，表达α-synA53T或Pink1W437X的细胞Δ降低了18-20%，但幅度较小Ψ_米（p<0.05）。两种突变蛋白的共表达导致Δ的显著缺失Ψ_米（45%，p<0.05）(图6A).

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图6

在感染LV表达α-syn和Pink1的B103细胞中，线粒体功能改变以及环孢霉素A和钌红的保护作用。所有值均表示为控制百分比。用5μM环孢霉素A或10mM钌红处理神经细胞。（A-C）线粒体Δ的半定量分析Ψ_米用载体对照（A）、环孢素A（B）或钌红（C）处理的细胞中的Mitotracker红荧光。（D-F）用载体对照（D）、环孢菌素A（E）和钌红（F）处理的细胞中ATP产生的测定（通过发光测定试剂盒）。表达突变α-syn和Pink1的细胞表现出线粒体功能和ATP生成的减少，这种影响在表达这两种突变蛋白的细胞中更大。环孢霉素A治疗部分减少了表达突变α-syn和Pink1的细胞的缺陷，而钌红完全恢复了组合突变蛋白的作用*第页与LV对照组相比，单因素方差分析和事后Dunnett检验均<0.05#第页通过单因素方差分析和事后Tukey Kramer检验，与单独感染LV-α-syn A53T或LV-Pink1 W437X的细胞相比，<0.05。

通过分析ATP生成水平进一步评估线粒体活性。与对照组相比，单独表达α-syn-wt或A53T的神经细胞或与Pink1 wt相关的神经细胞没有表现出任何显著的ATP减少(图6D). 相反，突变体Pink1的存在严重影响了ATP的生成，在单独表达Pink1 W437X的细胞中（~16%，p<0.05）或与α-syn-wt联合表达的细胞中逐渐减少（~21%，p<0.05）(图6D). 与结构和膜电位研究一致，表达Pink1 W437X的细胞与突变体α-syn相关，ATP水平下降最严重（约40%，p<0.05）(图6D).

此外，MTT分析显示，无论是单独表达还是与Pink1 wt或W437X联合表达突变α-syn的细胞中的值显著降低（约20%，p<0.05）(图7A)表明该分析对α-syn-比Pink1诱导的改变更敏感。神经元功能的这些缺陷与细胞活性受损无关，因为LDH和TUNEL检测均未显示突变α-syn和/或Pink1存在时48小时内细胞死亡水平显著增加(补充图5). 我们之前已经表明，在稳定转染的B103神经元细胞中，α-syn过表达导致粘附减少和轴突生长(Takenouchi等人，2001年). 与此一致的是，感染LV-α-syn A53T或Pink1 W437X的细胞显示出神经突起长度中度但显著减少（约30%，p<0.05）(图7D). 在同时感染突变型α-syn和Pink1的细胞中，这种下降显著加剧（~60%，p<0.05），而当一个突变蛋白与另一个wt蛋白共同表达时，这种下降会得到改善(图7D).

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图7

在感染LV表达α-syn和Pink1的B103细胞中，神经元的改变以及环孢霉素A和钌红的保护作用。所有值均表示为控制百分比。用5μM环孢霉素A或10μM钌红处理神经细胞。用载体对照（A）、环孢菌素A（B）或钌红（C）处理细胞的MTT分析。（D-F）通过相差显微镜和图像分析测定经溶媒对照（D）、环孢素A（E）或钌红（F）处理的细胞的轴突长度。表达突变α-syn和Pink1的细胞表现出线粒体活性和轴突长度的减少，在表达这两种突变蛋白的细胞中这种影响更大。环孢霉素A治疗部分减少了表达突变α-syn和Pink1的细胞的缺陷，而钌红完全恢复了组合突变蛋白的作用*第页与LV对照组相比，单因素方差分析和事后Dunnett检验均<0.05#第页与单独感染LV-α-syn A53T或LV-Pink1 W437X的细胞相比，单因素方差分析（ANOVA）和事后Tukey-Kramer试验的结果均<0.05。

α-syn-pressing神经元细胞中与突变Pink1相关的线粒体改变被环孢霉素A部分逆转

减少ATP生成和Δ损失Ψ_米可以促进线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放(Crompton 1999年)这反过来可能导致神经元功能障碍。为了评估mPTP开放的改变是否在感染LV-Pink1 mut的α-syn表达神经元细胞的线粒体功能障碍中起作用，用环孢霉素a（CsA）处理细胞，CsA是一种已知的抑制mPTP成分之一亲环素D的药物(沃尔德梅尔等。2003). CsA治疗能够恢复ΔΨ_米在共同表达α-syn A53T和Pink1 W437X的神经元细胞中(图6B). 同样，环孢素A恢复了ATP水平(图6E)，MTT活动(图7B)和突起生长(图7E)在单独表达Pink1 W437X或与α-syn-wt结合表达的神经元细胞中恢复到基线水平，而它部分挽救了ATP水平的严重降低(图6E)和神经突起长度(图7E)在表达这两种突变蛋白的细胞中（从基础培养基中的40%到CsA中的20%）。这些结果表明，mPTP的改变可能在突变体α-syn和Pink1的有害作用中发挥作用。

阻断线粒体钙内流可完全挽救α-syn表达神经元细胞中突变Pink1引起的线粒体损伤

游离钙通过其特定通道过度电致进入线粒体是ATP合成中断的最常见原因之一，可能是通过直接抑制呼吸链功能和改变ΔΨ_米(马特森2007,Parihar等人，2008年). 为了确定感染LV-Pink1 mut的α-同步表达细胞中观察到的线粒体膜损伤和ATP减少是否是由于线粒体钙超载所致，分别用不同的钙通道阻滞剂处理细胞。其中包括防止细胞外钙内流的氯化钴（CC）、阻止内质网钙流量的氟苯那酸（FFA）和特异性线粒体钙吸收通道阻滞剂钌红（RR）。

只有RR治疗能够恢复ΔΨ_米感染LVα-syn A53T和Pink1 W437X的细胞恢复到正常水平(图6C和补充图6). 与LV对照组相比，CC和FFA均不能恢复与LVα-syn A53T和Pink1 W437X表达相关的线粒体膜损伤（约20–40%损失，p<0.05）(图8A-C和补充图6). 同样，RR治疗完全恢复了ATP水平(图6F)，MTT活动(图7C)神经突起生长(图7F)表达Pink1 W437X的细胞中的正常值，单独或与α-syn-wt和A53T结合。相反，CC和FFA都不能恢复感染LVα-syn A53T和Pink1 W437X的神经元细胞中ATP的丢失（约15–40%，p<0.05）(图8D-F).

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图8

钙阻滞剂对感染LV表达α-syn和Pink1的神经元细胞系膜电位和ATP生成的影响。所有值均表示为控制百分比。用细胞钙抑制剂氯化钴（5μM）或氟苯那酸（40μM）处理神经细胞，并用Mitotracker Red或ATP分析。线粒体Δ的（A-C）半定量分析Ψ_米用溶媒对照（A）、氯化钴（B）或氟苯那酸（C）处理的细胞中的Mitotracker红色荧光。（D-F）用溶媒对照（D）、氯化钴（E）或氟苯那酸（F）处理的细胞中ATP生成的测定（通过发光分析试剂盒）。与钌红的保护作用相反，其他钙阻滞剂均未恢复表达突变α-syn和Pink1对ΔΨ_米或ATP生产*第页与LV对照组相比，单因素方差分析和事后Dunnett检验均<0.05#第页与单独感染LV-α-syn A53T或LV-Pink1 W437X的细胞相比，单因素方差分析（ANOVA）和事后Tukey-Kramer试验的结果均<0.05。

这项工作得到了NIH（AG18440、AG10435和AG022074）、意大利Telethon基金会（GGP07210）和意大利卫生部（Progetto Ordinario Ricerca Finalizzata 2006；Ricerca Finalizzata 2006，前第56条）的资助。我们也感谢Livio Patrizi基金会和Transgenomics的支持。